Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

Sommario

Il fluido biliare è una preziosa fonte di vescicole/esosomi extracellulari che contengono biomarcatori potenzialmente importanti. Questo protocollo rappresenta un metodo robusto per isolare gli esosomi dalla bile umana per ulteriori analisi, tra cui la profilazione dei miRNA.

Abstract

la ricerca Exosome negli ultimi tre anni ha notevolmente ampliato la portata verso l'identificazione e la caratterizzazione di biomarcatori e loro usi terapeutici.

Esosomi sono stati recentemente dimostrato di contenere microRNA (miR). Mirs si sono sorti come biomarcatori preziosi per scopi diagnostici. Come la raccolta di campioni nelle cliniche e negli ospedali è molto variabile, miRNA isolamento da tutta la bile varia notevolmente. Per ottenere solidi, precisi e riproducibili profili miRNA da campioni di bile raccolti in modo semplice richiesto lo sviluppo di un protocollo di alta qualità per isolare e caratterizzare esosomi dalla bile. Il metodo richiede diversi centrifugazioni e una fase di filtrazione con un passo ultracentrifugazione finale per far sedimentare le esosomi isolati. La microscopia elettronica, Western blot, citometria a flusso e multi-parametro analisi ottica di nanoparticelle, se disponibili, sono passi fondamentali di caratterizzazione per convalidare la qualità del messaggio exosomes. Per l'isolamento di miRNA da questi esosomi, chiodare il lisato con un non-specifica, miRNA sintetico da una specie come Caenorhabditis elegans, vale a dire, Cel-miR-39, è importante per la normalizzazione di efficienza di estrazione di RNA. L'isolamento di exosome dal liquido biliare seguendo questo metodo consente la riuscita miRNA profilatura da campioni di bile conservati per diversi anni a -80 ° C.

Introduzione

Come altri fluidi biologici, vale a dire, il latte materno, plasma o urina, la bile contiene esosomi, lipidi vescicole ricche ^1-4. Esosomi possono indurre o alterare le funzioni biologiche in cellule riceventi ^{5, 6,} una forma di comunicazione cellula-cellula che potrebbe essere parte della loro normale funzione ^{4, 7-9.} Esosomi possono contenere specie miRNA che possono fornire una preziosa fonte di biomarcatori per la diagnosi ^10. profili miRNA hanno guadagnato considerevole attenzione negli ultimi anni come marcatori diagnostici e prognostici per una varietà di malattie ^11-14.

miRNA stesso può essere trovato in fluidi biologici, eventualmente rilasciati da cellule morte e la quantità di cellule capannone può essere fortemente influenzato da una malattia di base. Il profilo di miRNA exosomes non riflette necessariamente il profilo miRNA della cellula originaria ^{6, 10, 15-17,} ma exosomes può effettuare firme miRNA che potrebbero essere caratteristico per la ce genitorill come una cellula tumorale. Exosomes tumore-derivato sono stati identificati nel plasma dei pazienti con adenocarcinoma del polmone, cancro alla prostata e di altri tumori ^{8, 16, 18.}

L'obiettivo di questo metodo è l'isolamento affidabile e robusta di esosomi da campioni bile umana, in gran parte indipendenti delle loro procedure di gestione precedenti. E 'stato sviluppato per utilizzare la bile come una fonte affidabile di miRNA per il potenziale diagnosi delle malattie del dotto biliare, come colangiocarcinoma ^19. Si compone di diverse fasi di centrifugazione con l'aumentare della velocità per isolare esosomi e potrebbe essere applicabile ad altri fluidi biologici.

Protocollo

Ottenere la bile da pazienti di colangiopancreatografia retrograda endoscopica (ERCP) richiede l'approvazione di un protocollo di studio soggetti umani dal Institutional Review Board. Tutto il lavoro qui presentato è stato approvato dal Comitato Etico della Johns Hopkins University.

1. Exosome Isolamento da Bile

1. Eseguire colangiopancreatografia retrograda endoscopica (ERCP). Posizionare il paziente in posizione supina e intubare.
   1. Passare una duodenoscopio attraverso la bocca del paziente e inserirla nella seconda parte del duodeno e identificare la papilla.
   2. Selettivamente cannulate il dotto biliare comune con l'inserimento di una tripla lume sfinterotomo pre-caricato con un 0,035 pollici (0,9 mm), filo guida idrofilo.
   3. Avanzare il filo guida sotto guida fluoroscopica al dotto epatico sinistro in quanto a volte può essere difficile differenziare il dotto cistico dalla dotto epatico destro, poi avanzare ilsfinterotomo 5 cm nel dotto biliare per acquisire una posizione stabile.
   4. Rimuovere il filo guida, collegare una siringa da 10 ml alla porta filo guida attraverso il blocco Luer e aspirare la bile utilizzando 10 ml di pressione negativa.
   5. Rimuovere la siringa contenente la bile per procedere con l'ERCP reinserendo il filo guida e iniettando contrasto attraverso la porta di iniezione per opacizzare l'albero biliare.
   6. Trasferire la bile raccolto in una provetta da 15 ml su ghiaccio e tenere in ghiaccio fino al momento di procedere con la fase di centrifugazione.
      Attenzione: Indossare guanti per proteggere se stessi ei campioni! Trattare bile come potenziale fonte di infezione in quanto può contenere epatite A particelle virali!
   7. Mantenere il campione (s) su ghiaccio. O procedere con passo 1.2 o centrifugare a 500 xg a 4 ° C per 10 min e poi congelare a -80 ° C fino all'utilizzo.
      Nota: I campioni conservati in questo modo per diversi anni sono stati regolarmente utilizzati con buoni risultati ^19.
2. Transfer 400 ml di bile in una provetta e raccogliere le cellule e detriti cellulari mediante centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
3. Rimuovere il surnatante pipettando, trasferire in una provetta fresco e centrifugare il campione (s) a 16.500 xg per altri 20 min a 4 ° C per eliminare il sopranatante di ulteriori detriti. Eliminare i tubi nei rifiuti a rischio biologico. In alternativa, far girare i campioni in un'ultracentrifuga invece.
4. Raccogliere il surnatante e filtrare in un armadio biosicurezza con una siringa attraverso un filtro a membrana 0,2 micron polietersulfone (PES), che ha buone portate e basso legame con le proteine ​​per rimuovere eventuali particelle più grandi di 200 nm a sinistra.
5. Pipettare il supernatante filtrato per ultracentrifuge tubi e aggiungere PBS modo che i tubi sono più di 2/3. Se i tubi contengono meno liquidi rispetto a quello, i tubi crollerà durante la centrifugazione! I tubi possono essere lavati, sterilizzati in autoclave e riutilizzati più volte.
6. Pellet le exosomes attraverso ultracentrifugazione a 120.000 xg per 70 min a 4 ° C. Dopo l'aspetto centrifugazione sul fondo della provetta ultracentrifuga vedere talvolta piccole palline gialle; questi sono gli esosomi.
7. Eliminare il surnatante per decantazione cautela e disinfettare rifiuti aggiungendo candeggina per una concentrazione finale del 10% v / v e lasciate riposare per 20 min.
8. Per gli esperimenti a valle, o elaborare il pellet (s) in un piccolo volume della soluzione appropriata (ad esempio, test radioimmunoprecipitazione (RIPA) tampone per l'isolamento delle proteine, RNA tampone di lisi per l'isolamento MIR) o risospendere in 50-150 ml di fosfato tamponata salino (PBS), che può essere conservata a -80 ° C per un uso futuro (reale tempo di reazione a catena della polimerasi quantitativa (qRT-PCR) o estrazione delle proteine ​​etc.) o utilizzata per la caratterizzazione del preparato exosome da TEM o analisi ottica nanoparticelle .

2. Identificazione da ExosomeMicroscopia elettronica a trasmissione (TEM) o CryoEM

1. Risospendere vescicole extracellulari in 100 ml di PBS pipettando. Idealmente, utilizzare exosomes che non sono stati conservati a -20 ° C o -80 ° C, in particolare quando si esegue l'isolamento per la prima volta.
2. Assorbire in 20 microlitri aliquota (circa 2 mg) a 400 griglie di rame Parlodion carbonio rivestite di maglia per 2 minuti e lasciare asciugare a temperatura ambiente.
3. Fissare la exosome in 1% (v / v) glutaraldeide (EM-grade) per 5 minuti a RT ponendo attenzione gocce sul preparato secco.
4. Lavare le griglie due volte con acqua per 5 minuti e quindi contrastare EVs macchia con acido fosfotungstico 1% (PTA) per 30 sec.
5. Acquisire immagini con un microscopio elettronico con una tensione di accelerazione di 80 kilovolt partendo ingrandimenti 20,000X e aumentando al 100,000X per determinare la dimensione delle particelle.
   Nota: altre preparazioni come la stratificazione su 200 griglie Formvar carbonio rivestite di maglia di rame o nichel e colorazione di contrasto like 1% o 2% acetato di uranile per 10-15 min sono anche possibili.
6. Per CryoEM, mescolare un 20 microlitri aliquota (circa 2 mg) con 60 microlitri di proteine ​​G in oro 10 nm (1: 3 ratio). Ciò contribuirà a determinare il diametro exosome.
7. Trasferire i campioni su griglie di carbonio bucata C-piatta bagliore-scarica e rimuovere il liquido in eccesso tamponando. Congelare le griglie immergendo immediatamente in etano liquido.
8. Montare le griglie in cryoholder in azoto liquido.
9. Acquisire le immagini a 200 kV con ingrandimenti di 20,000X e 100,000X.

3. Exosome identificazione da Multi-parametro nanoparticelle analisi ottica

1. Risospendere le exosomes isolati in 100 ml di PBS pipettando.
2. Diluire exosomes in 600 l di PBS in diversi rapporti diversi (come 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 e 1: 1.200).
3. Visualizza le exosomes di scattering di luce laser con lo strumento e software appropriato in tempo reale in base alle Manufactuprotocollo di rer ^20.
4. Aumentare il livello della fotocamera in modalità di acquisizione fino a quando le particelle diventano visibili, quindi regolare la messa a fuoco per rendere le particelle aspetto liscio.
5. Mentre in modalità standard, diminuire la fotocamera al livello più basso che le particelle possono ancora vedere, se necessario regolare otturatore della fotocamera e il guadagno per raggiungere questo obiettivo.
6. Controllare visivamente per assicurare 20-100 particelle sono visibili sullo schermo, se non svuotare l'unità e regolare la diluizione in PBS.
7. Quindi regolare la durata di acquisizione tra il 30-60 sec. Dopo il video viene catturato, regolare i parametri di elaborazione fino a quando tutte le particelle vengono identificati sullo schermo ed elaborare il file video.

4. Exosome Caratterizzazione mediante Western Blot

1. Lyse exosome pellet da 2-5 ml di bile in 100 ml di test radioimmunoprecipitazione ghiacciata (RIPA) tampone con un inibitore della proteasi pipettando su e giù a fondo e mescolare lisati energicamente per 30 secsu un vortex per solubilizzare efficacemente le proteine.
2. Mentre la maggior parte del tempo non necessario, utilizzare pulse-sonicazione dei campioni su ghiaccio con 2 impulsi per 10 secondi ciascuna per garantire la piena lisi.
3. Pellet materiale insolubile mediante centrifugazione a 15.000 xg a 4 ° C per 5 minuti e trasferire il surnatante in una provetta pulita.
4. Determinare la concentrazione di proteine ​​con un metodo di scelta (cioè, acido bicinconinico (BCA), Coomassie, modificato Lowry, 660 nm Protein Assay, ecc) secondo il protocollo del produttore. Il metodo non è importante finché lo stesso metodo viene utilizzato costantemente per ottenere risultati paragonabili attraverso esperimenti.
5. Carico 50 mg di proteine ​​per campione in tampone Laemmli dopo riscaldamento del campione a 95 ° C per 5 minuti in un pozzo di un gel di poliacrilammide per elettroforesi (PAGE).
6. Elettroforesi i campioni sui gel PAGE per 1,5 ore e trasferire le proteine ​​separate su una membrana di nylon.
7. Bbloccare la membrana (s) con il 5% di latte scremato in Tris-Buffered Saline con 0,1% di Tween 20 (TBS-T) per 1 ora, poi incubare con anticorpi specifici exosome come anti-CD63 e anti-STG-101 a una diluizione di 1: 500, preferibilmente O / N a 4 ° C.
8. Lavare le membrane con TBS-T 3 x 10 min, poi incubare con un appropriato, corrispondente anticorpo secondario HRP-coniugato in 5% latte scremato in TBS-T per 1-2 ore a temperatura ambiente.
9. Lavare la membrana (s) 3 x 5 minuti con TBS-T e rilevare le proteine ​​specifiche con i reagenti chemiluminescenza secondo il protocollo del produttore.
10. Immagine le membrane con film o un sistema di imaging digitale secondo il protocollo del produttore.

5. MicroRNA isolamento dal Esosomi isolati

Nota: Isolamento di miRNA da exosomes biliari viene effettuata utilizzando un isolamento miRNA modificata sulla base di un kit disponibile in commercio, ma qualsiasi altro metodo di isolamento di RNA può essere utilizzato o adattato.

1. Aggiungere 300 &# 181; l lisi / tampone edificio al pellet exosome (isolato da 400 ml di bile), vortex, pipetta o passare attraverso un ago / siringa per la lisi completamente il esosomi per ottenere un lisato omogeneo.
2. Aggiungere 1/10 (30 ml) volume di miRNA Omogenato additivo, e mescolare bene nel vortex o invertendo il tubo più volte.
3. Incubare la miscela per 10 min in ghiaccio.
4. Aggiungere un volume di acido-fenolo: cloroformio pari al omogenato iniziale (300 ml).
5. Aggiungere 5 ml di 5 fmol / ml cel-miR 39 e vortex per 30-60 sec.
6. Centrifugare per 5 min a 10.000 xg a temperatura ambiente per separare il acquosa (superiore) e fasi organiche (inferiore).
7. aspirare accuratamente la fase superiore pipettando e trasferire in una nuova provetta pur rilevando il volume trasferito. Eliminare la fase organica nel contenitore dei rifiuti organici appropriata.
8. Per arricchire per piccoli RNA aggiungere 1/3 del volume di 100% di etanolo alla fase acquosa recuperata e mescolare per bene vortex o invertendo il tuessere diverse volte.
9. Pipettare la miscela lisato / etanolo sulla cartuccia del filtro, fino a 700 ml per volta.
10. Centrifugare le cartucce per 15 sec a un massimo di 10.000 xg o applicare il vuoto per passare la miscela attraverso il filtro.
11. Raccogliere il filtrato e se la miscela lisato / etanolo supera 700 ml, trasferire il flusso continuo in una nuova provetta e ripetere la procedura per raccogliere tutte le filtrati. Questi filtro contiene frazioni di RNA privi di piccoli RNA e può essere utilizzato per recuperare questi RNA più grandi.
12. Aggiungere 2/3 volume di RT 100% di etanolo al filtrato totale e mescolare bene nel vortex.
13. Pipettare la miscela filtrato / etanolo su una seconda cartuccia filtrante. Come prima il volume massimo che può essere applicato in una sola volta è di 700 microlitri.
14. Centrifugare per 15 secondi a 10.000 xg o applicare il vuoto come descritto al punto 5.10.
15. Gettare il flow-through, e ripetere fino a quando tutti miscela filtrato / etanolo è stato filtrato.
16. applicare 70081; l miRNA soluzione di lavaggio 1 per la cartuccia del filtro, centrifugare per 5-10 secondi o applicare il vuoto e scartare il flow-through.
17. Lavare il filtro con 500 microlitri soluzione di lavaggio 2/3 come fatto nella fase 5.16.
18. Ripetere il lavaggio una seconda volta con 500 ml di soluzione di lavaggio 2/3 come al punto 5.16, scartare il flow-through e posizionare il filtro nel tubo di raccolta.
19. Spin la cartuccia del filtro per 1 min a 10.000 xg per rimuovere tutto il liquido residuo dal filtro.
20. Trasferire la cartuccia filtro in un tubo di raccolta fresca e applicare 100 ml di acqua calda libera (95 ° C) nucleasi al centro del filtro.
21. Spin assemblee per 20-30 secondi alla massima velocità per recuperare l'RNA.
22. Raccoglie l'eluato e utilizzare immediatamente o conservare a -80 ° C.

Risultati

Poiché esosomi sono troppo piccole per essere rilevato mediante microscopia normale o la citometria a flusso, microscopia elettronica o analisi ottica nanoparticelle deve essere eseguita. L'analisi ottica nanoparticelle ha il vantaggio rispetto microscopia elettronica che è anche quantitativa e fornisce distribuzione dimensionale e concentrazione. Lo strumento presenta un raggio laser finemente focalizzato attraverso un prisma di vetro nel campione. Il moto browniano delle vescicole isol...

Discussione

Per utilizzare in modo affidabile esosomi isolati dalla bile, è importante utilizzare metodi di isolamento di alta qualità costante per ottenere campioni di alta qualità in cambio. La metodologia definita in questo documento è un modo consolidato per isolare esosomi e miRNA dalla bile umana. Si evidenzia diversi passaggi cruciali nella caratterizzazione dei esosomi isolati che come minimo dovrebbe comprendere microscopia elettronica o l'analisi ottica di nanoparticelle e macchie occidentali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,2 µ m Filtro a membrana in polietersulfone (PES)	Corning	431229
provette per ultracentrifuga in poliallomero a parete sottile	Rotore Beckman Coulter	331374
SW40Ti	Beckman Coulter
LM10-HS	Software Nanosight
per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA)	Nanosight
mirVANA	Life Technologies	AM1560
Inibitore completo della proteasi	Roche distribuito da Sigma-Aldrich	4693116001
Immobilon PSQ	Millipore, Bedford MA	ISEQ00010
Anticorpo anti-CD63	Abcam	ab59479
Anti-Tsg101	Abcam	ab30871