Il fluido biliare è una preziosa fonte di vescicole/esosomi extracellulari che contengono biomarcatori potenzialmente importanti. Questo protocollo rappresenta un metodo robusto per isolare gli esosomi dalla bile umana per ulteriori analisi, tra cui la profilazione dei miRNA.
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Articolo metodologico
Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana
In questo articolo
Sommario
Abstract
la ricerca Exosome negli ultimi tre anni ha notevolmente ampliato la portata verso l'identificazione e la caratterizzazione di biomarcatori e loro usi terapeutici.
Esosomi sono stati recentemente dimostrato di contenere microRNA (miR). Mirs si sono sorti come biomarcatori preziosi per scopi diagnostici. Come la raccolta di campioni nelle cliniche e negli ospedali è molto variabile, miRNA isolamento da tutta la bile varia notevolmente. Per ottenere solidi, precisi e riproducibili profili miRNA da campioni di bile raccolti in modo semplice richiesto lo sviluppo di un protocollo di alta qualità per isolare e caratterizzare esosomi dalla bile. Il metodo richiede diversi centrifugazioni e una fase di filtrazione con un passo ultracentrifugazione finale per far sedimentare le esosomi isolati. La microscopia elettronica, Western blot, citometria a flusso e multi-parametro analisi ottica di nanoparticelle, se disponibili, sono passi fondamentali di caratterizzazione per convalidare la qualità del messaggio exosomes. Per l'isolamento di miRNA da questi esosomi, chiodare il lisato con un non-specifica, miRNA sintetico da una specie come Caenorhabditis elegans, vale a dire, Cel-miR-39, è importante per la normalizzazione di efficienza di estrazione di RNA. L'isolamento di exosome dal liquido biliare seguendo questo metodo consente la riuscita miRNA profilatura da campioni di bile conservati per diversi anni a -80 ° C.
Introduzione
Come altri fluidi biologici, vale a dire, il latte materno, plasma o urina, la bile contiene esosomi, lipidi vescicole ricche 1-4. Esosomi possono indurre o alterare le funzioni biologiche in cellule riceventi 5, 6, una forma di comunicazione cellula-cellula che potrebbe essere parte della loro normale funzione 4, 7-9. Esosomi possono contenere specie miRNA che possono fornire una preziosa fonte di biomarcatori per la diagnosi 10. profili miRNA hanno guadagnato considerevole attenzione negli ultimi anni come marcatori diagnostici e prognostici per una varietà di malattie 11-14.
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Protocollo
Ottenere la bile da pazienti di colangiopancreatografia retrograda endoscopica (ERCP) richiede l'approvazione di un protocollo di studio soggetti umani dal Institutional Review Board. Tutto il lavoro qui presentato è stato approvato dal Comitato Etico della Johns Hopkins University.
1. Exosome Isolamento da Bile
- Eseguire colangiopancreatografia retrograda endoscopica (ERCP). Posizionare il paziente in posizione supina e intubare.
- Passare una duodenoscopio attraverso la bocca del paziente e inserirla nella seconda parte del duodeno e identificare la papilla.
- Selettivamente cannulate il dotto biliare comune....
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Risultati
Poiché esosomi sono troppo piccole per essere rilevato mediante microscopia normale o la citometria a flusso, microscopia elettronica o analisi ottica nanoparticelle deve essere eseguita. L'analisi ottica nanoparticelle ha il vantaggio rispetto microscopia elettronica che è anche quantitativa e fornisce distribuzione dimensionale e concentrazione. Lo strumento presenta un raggio laser finemente focalizzato attraverso un prisma di vetro nel campione. Il moto browniano delle vescicole .......
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Discussione
Per utilizzare in modo affidabile esosomi isolati dalla bile, è importante utilizzare metodi di isolamento di alta qualità costante per ottenere campioni di alta qualità in cambio. La metodologia definita in questo documento è un modo consolidato per isolare esosomi e miRNA dalla bile umana. Si evidenzia diversi passaggi cruciali nella caratterizzazione dei esosomi isolati che come minimo dovrebbe comprendere microscopia elettronica o l'analisi ottica di nanoparticelle e macchie occidentali.
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Dichiarazioni
Nessuno degli autori ha interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato da un premio K08 (DK090154-01) dal National Institutes of Health (NIH; a F.M.S.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,2 µ m Filtro a membrana in polietersulfone (PES) | Corning | 431229 | |
| provette per ultracentrifuga in poliallomero a parete sottile | Rotore Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Software Nanosight | ||
| per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| Inibitore completo della proteasi | Roche distribuito da Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anticorpo anti-CD63 | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
Riferimenti
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before ....
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Ristampe e permessi
