Method Article

Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli

DOI:

10.3791/54055

⸱

May 13th, 2016

 ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manipolazioni transgeniche e la modifica del genoma sono fondamentali per il collaudo funzionale i ruoli dei geni ed elementi -regulatory cis. Ecco una dettagliata protocollo microiniezione per la generazione di modifiche genomiche (compresi costrutti Tol2-mediate fluorescenti giornalista transgene, Talens, e CRISPRs) è presentato per il pesce modello emergente, il Spinarello.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il pesce Spinarello è emersa come un potente sistema per studiare la base genetica di una vasta gamma di morfologica, fisiologica, e fenotipi comportamentali. I fenotipi notevolmente diverse che si sono evoluti come le popolazioni marine si adattano agli ambienti di acqua dolce innumerevoli, combinata con la capacità di attraversare le forme marine e d'acqua dolce, forniscono un sistema di vertebrati raro in cui la genetica può essere utilizzato per mappare regioni genomiche il controllo sia evoluto tratti. Eccellenti risorse genomiche sono ora disponibili, facilitando molecolare dissezione genetica dei cambiamenti evoluti. Mentre gli esperimenti di mappatura generano liste di geni candidati interessanti, manipolazioni genetiche funzionali sono necessari per testare il ruolo di questi geni. regolazione genica può essere studiato con plasmidi reporter transgenici e BAC integrate nel genoma utilizzando il sistema trasposasi Tol2. Funzioni di specifici geni candidati e gli elementi -regulatory cis possono essere valutate inducendo miratamutazioni con Talen e CRISPR / Cas9 reagenti modifica del genoma. Tutti i metodi richiedono l'introduzione di acidi nucleici in fecondate embrioni spinarello un cellulare, un compito reso difficile dalla fitta corion di embrioni stickleback e il relativamente piccolo e sottile blastomeri. Qui, un protocollo dettagliato per la microiniezione di acidi nucleici in embrioni spinarello è descritto per le applicazioni transgeniche e la modifica del genoma per studiare l'espressione genica e la funzione, così come le tecniche per valutare il successo di transgenesi e recuperare le linee stabili.

Introduction

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Una componente fondamentale di capire come la biodiversità si pone è la determinazione delle basi genetiche e di sviluppo dei cambiamenti fenotipici evoluti in natura. Il pesce Spinarello, Gasterosteus aculeatus, è emerso come un ottimo modello per studiare le basi genetiche dell'evoluzione. Spinarelli hanno subito molti cambiamenti evolutivi adattativi come i pesci marini hanno colonizzato gli ambienti di acqua dolce innumerevoli intorno nell'emisfero settentrionale, con conseguente morfologica drammatico, fisiologici, e cambiamenti comportamentali 1. I genomi di individui di ventuno popolazioni stickleback sono stati sequenziati e assemblati, e una mappa linkage alta densità è stato generato per migliorare ulteriormente il gruppo 2,3. Esperimenti di mappatura genetici hanno identificato regioni genomiche sottostante fenotipi evoluti 4 - 6, e in alcuni casi, i ruoli funzionali di geni specifici sono stati testati 7,8. Un certo numero di regioni genomiche sottostanti cambiamenti morfologici sono stati identificati con promettenti geni candidati, ma questi candidati non sono ancora stati testati funzionalmente 9 - 12. Inoltre, spinarelli sono modelli comuni per gli studi di genetica delle popolazioni / genomica 13,14, speciazione 15, il comportamento 1, endocrinologia 16, ecotossicologia 17, l'immunologia 18 e parassitologia 19. Futuri studi in ciascuno di questi settori beneficeranno della possibilità di eseguire manipolazioni genetiche funzionali in spinarelli. Oltre a manipolare le sequenze codificanti, i ruoli dei geni candidati possono essere valutate studiando le loro sequenze -regulatory cis e funzionalmente crescente, decrescente o eliminando espressione del gene candidato. Microiniezione e transgenesi metodi in spinarelli sono ben stabiliti 7,8,20 e sono stati inizialmente sviluppati utilizzando un meganuclease-mediataMetodo 21 descritto per primo nel Medaka 22. Il metodo microiniezione modificato presentato qui è stato ottimizzato sia per la transgenesi Tol2-mediata e recentemente sviluppato reagenti di modifica del genoma tra Talens e CRISPRs.

Modifiche a cis -regulatory elementi sono pensati per essere critico per l'evoluzione morfologica, come cis -regulatory cambiamenti possono evitare le conseguenze negative pleiotropici di codifica mutazioni 23. Pertanto, prova e il confronto putative sequenze -regulatory cis è diventato un obiettivo centrale di un numero crescente di studi evolutivi. Inoltre, la maggior parte delle varianti di malattie umane sono varianti normative 24,25 e sistemi modello vertebrati sono dolorosamente necessari per studiare cis Funzione di un elemento -regulatory e la logica. I pesci che fertilizzare i loro embrioni esternamente in gran numero offrono potenti sistemi di vertebrati a studiare -Regolamento cis. Il sistema di trasposoni Tol2, in cui commDNA gn per essere integrato nel genoma è fiancheggiato da Tol2 trasposasi siti di legame e di co-iniettato con Tol2 trasposasi mRNA, funziona con alta efficienza per l'integrazione con successo plasmide costruisce sui genomi di pesce 26 - 28. In genere, un potenziale Enhancer è clonato a monte di un promotore basale (come hsp70l 29) e del gene reporter fluorescente come EGFP (enhanced green fluorescent protein) o mCherry in una spina dorsale Tol2 e iniettato con trasposasi mRNA 26. L'osservazione di espressione del reporter fluorescente, sia in embrioni o discendenti con transgeni stabilmente integrati iniettati, fornisce informazioni sulla regolazione spazio-temporale dell'espressione genica guidato dal enhancer putativo. In ulteriori esperimenti, esaltatori validati possono essere utilizzati per guidare sovraespressione tessuto-specifica dei geni di interesse.

Per l'analisi delle più grandi regioni -regulatory cis, di alta qualità genom grande insertolibrerie IC utilizzando cromosomi batterici artificiali (BAC) sono stati costruiti per entrambe le marine e di acqua dolce spinarelli 30. Questi BAC possono essere recombineered per sostituire un gene con un gene reporter fluorescente nel contesto di un grande (150-200 kb) regione genomica 31. Il reporter fluorescente viene poi espressa in un modello spazio-temporale, come determinato dal sequenze regolatrici all'interno del BAC. Per gli studi nei pesci, siti Tol2 possono essere aggiunti alla BAC per facilitare genomico integrazione 32,33. Nelle fasi successive di sviluppo, quando l'ibridazione in situ è tecnicamente impegnativo, la lettura fluorescenza del BAC può essere utilizzato per studiare gli schemi di espressione genica, come è stato dimostrato per stickleback proteina morfogenetica 6 (BMP6) 20. Inoltre, i modelli di espressione fluorescenti in un individuo possono essere monitorati nel corso del tempo, che non può essere realizzato con l'ibridazione in situ. BAC può essere utilizzato anche per aggiungere un additional copia di una regione genomica di aumentare il dosaggio di un gene di interesse.

Per lo studio della funzione del gene, editing genoma è un campo esplosivo espansione che può essere utilizzato per produrre cambiamenti mirati a sequenze genomiche in un'ampia varietà di organismi 34. Trascrizione attivatore-come nucleasi effettrici (Talens) sono, nucleasi modulari sequenza-specifiche originariamente isolato da agenti patogeni delle piante che possono essere progettati proprio per legarsi direttamente ad una sequenza genomica di scelta e di generare un doppio filamento pausa 35,36. Cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / sistemi CAS sono stati originariamente trovati nei batteri e utilizzare un RNA guida e la proteina Cas9 per generare una pausa in una sequenza di DNA bersaglio complementare alla guida 37. La successiva riparazione della rottura a doppio filamento creato da entrambe le Talens e CRISPRs spesso lascia dietro di sé una piccola inserimento o la cancellazione, che possono interferire con la funzione della sequenza bersaglio35-37. In spinarelli, Talens sono stati utilizzati per distruggere l'espressione genica di mira un potenziatore 20, ed entrambi Talens e CRISPRs hanno prodotto con successo le mutazioni in sequenze codificanti (dati non pubblicati). Un protocollo dettagliato per la generazione di CRISPRs per l'utilizzo in zebrafish può essere utilizzato come linea guida per sviluppare CRISPRs per spinarelli 38.

esperimenti di modifica transgenici e genoma richiedono l'introduzione di acidi nucleici in un appena fecondato embrione unicellulare. Con l'introduzione del transgene strumento o del genoma di modifica nelle prime fasi di sviluppo, il numero di cellule figlie geneticamente manipolate in l'embrione è massimizzata. embrioni iniettati vengono poi proiettati visivamente per fluorescenza o molecolarmente sottoposti a screening per le modifiche del genoma. Se le cellule che contribuiscono alla linea germinale sono mirati con successo, il transgene o mutazioni possono essere trasmessi a un sottoinsieme di prole, anche quando post-iniezione letale è elevata. Il pesce a mosaico possono essere outcrossed oincrocia e la loro prole proiettato per recuperare i alleli mutanti o un transgene stabilmente integrata di interesse. Questo protocollo descrive i metodi per l'introduzione di transgeni e l'editing di reagenti genoma in embrioni spinarello uno-cellula e di monitoraggio per le modifiche genomiche di successo.

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Protocol

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Tutti i lavori di pesce è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e l'uso della University of California-Berkeley (numero di protocollo R330).

1. Preparare acidi nucleici per iniezione

  1. Tol2 plasmidi Transgenesi (Adattato da Fisher 26).
    1. Tagliare 10 mcg trasposasi plasmide (PCS-TP) 39 con 10 U Noti nel buffer fornito per 1 ora a 37 ° C per la linearizzazione.
      Nota: Gli accordi materiale di trasferimento può essere richiesto per ottenere plasmidi Tol2.
    2. Estrarre il plasmide taglio con un 25: 24: 1 miscela di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico e etanolo precipitato con acetato di sodio secondo protocolli standard 40. Risospendere plasmide in acqua priva di RNasi 50 ml.
      Nota: fenolo-cloroformio deve essere utilizzato in una cappa e i rifiuti devono essere smaltiti secondo le linee guida istituzionali.
    3. Impostare una reazione Sp6 trascrizione secondo le istruzioni del produttore.
    4. Utilizzare un isolante RNAKit zione per ripulire reazione di trascrizione in base alle istruzioni del fabbricante; risospendere l'RNA in acqua 50 ml RNasi-free.
    5. Rimuovere un'aliquota 1 ml di RNA. Riscaldare a 65 ° C per 5 minuti per denaturare strutture secondarie poi rilassarsi immediatamente in ghiaccio. Fermo restando reazione di trascrizione a -80 ° C.
    6. Eseguire l'aliquota di RNA su un gel 1% agarosio a 0.5x TAE (Tris base, acido acetico, acido etilendiamminotetracetico) tampone di corsa, con uno standard di dimensioni di RNA in una corsia. Il prodotto previsto è 2.200 bp; scartare se> 5% del RNA totale appare in uno striscio inferiore a 2.200 bp, che indica una eccessiva degradazione (Figura 1).
    7. Quantificare l'RNA utilizzando uno spettrofotometro a 260 nm. Diluire a 350 ng / ml in acqua e negozio di 1 ml RNase-free aliquote a -80 ° C (buono per almeno due anni).
    8. Clone Tol2 plasmide reporter (per esempio, utilizzando pT2HE 8 o plasmidi dal kit Tol2 41) con cis- Elemento normativo di interesse. Brevemente, PCR amplificare una sequenza di DNA genomico di interesse con primers contenenti siti di restrizione presenti nel plasmide, digerire il prodotto PCR e il vettore con l'enzima (s), legare l'inserto nel vettore, e trasformare risultante plasmide in E. competente coli 40. Isolare plasmide con un kit che comprende un risciacquo endotossina secondo il protocollo del produttore.
    9. Eseguire una seconda purificazione del plasmide Tol2 con un kit di purificazione PCR secondo il protocollo del produttore. Eluire in 30 acqua priva di RNasi microlitri.
      Nota: la resa di questo passo può essere basso (a volte con il 50% del plasmide ingresso).
    10. Diluire plasmide a ~ 125 ng / ml in acqua RNase-free.

figure-protocol-1
Figura gel mRNA 1. trasposasi. Reazione pro trascrizione purificatacondotto (1 ml) viene riscaldata a 65 ° C, raffreddato in ghiaccio, ed eseguito su un gel di agarosio 1% con 0.5x TAE tampone di corsa a 100 V. Le dimensioni della scala RNA in kilobasi (kb) sono indicati a fianco . La figura intera trasposasi mRNA è una fascia luminosa a ~ 2.2 kb. Una piccola ma accettabile quantità di mRNA degradati o incompleta è visto sotto 2,2 kb. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. BAC Transgenesi (Vedi Suster 32,33 per Tecniche BAC recombineering)
    1. Preparare BAC da E. coli utilizzando il kit di purificazione BAC secondo il protocollo del produttore. Utilizzare precipitazione in etanolo per recuperare il DNA con una sodio acetato-etanolo estrazione del 40 e del DNA risospendere a ~ 250 ng / ml in acqua RNase-free.
    2. Preparare trasposasi mRNA come nella sezione 1.1.
  2. La mutazione induzione con Talens (See Cermak
  3. Utilizzare l'applicazione web-based per la progettazione Talens per il gene di interesse 42. Se possibile, il design Talens ad interrompere un sito di taglio enzima di restrizione per facilitare l'analisi molecolare.
  4. Clone Talens e preparare plasmidi per la trascrizione seguito pubblicati protocollo 35.
  5. Trascrivere TALEN mRNA con una reazione Sp6 trascrizione secondo le istruzioni del produttore e ripulire mRNA come descritto per trasposasi nella sezione 1.1.4. Quantificare con uno spettrofotometro e diluire a 200 ng / ml in RNasi acqua libera. Eseguire TALEN mRNA su un gel per assicurarsi che sia la dimensione corretta e non degradata come descritto al punto 1.1.6.
  6. Progettare un paio di primer PCR per amplificare circa 100-200 bp che circonda la sequenza bersaglio TALEN utilizzando uno strumento di progettazione primer e il target sequenza di DNA 43. Ordinare l'enzima di restrizione adeguato per verificare lesioni al sito di destinazione sulla base di passo 1.3.1.
  • CRISPR Transgenesi (Vedi Talbot e Amacher 38 per la progettazione e la preparazione di CRISPRs):
    1. Progettazione e preparare CRISPRs e Cas9 mRNA secondo il protocollo 38, e nell'ordine appropriato primer di verifica e di enzimi di restrizione, come descritto al punto 1.3.4.

    • 2. Preparare Reagenti iniezione

    1. Utilizzare borosilicato capillari per preparare gli aghi come descritto di seguito.
      Nota: questi capillari non sono i capillari standard utilizzati per la microiniezione zebrafish, e sono fatti di un vetro più spesso e più forte che è fondamentale per forare il corion stickleback dura.
      1. Indossare sempre nitrile o guanti di lattice quando si tira gli aghi, e non consentono aghi per contattare oli per la pelle o pelle.
      2. Determinare i parametri micropipetta tirando empiricamente dai test di rampa seguenti istruzioni fornite dal produttore del estrattore micropipetta. Ad esempio, con una scatola di filamenti, i seguenti parametri sono stati determinato essere ottimale: (calore = 515, Pull = 60, velocità = 60, ritardo = 85, Pressione = 500). Queste impostazioni producono un ago che si assottiglia vertiginosamente a circa 12 ° per ~ 2 mm e poi una lunga estensione che si rastrema a circa 2 ° per ~ 6 mm (figura 2).
        Nota: I parametri corretti variano da estrattore e filamenti, e ciecamente utilizzando un programma senza determinare i parametri prima attraverso test rampa può permanentemente distruggere filamento della estrattore, che è difficile e costoso da sostituire.
      3. Seguire le istruzioni del produttore per tirare almeno 4 aghi micropipetta di vetro borosilicato con le impostazioni determinate in 2.1.2.
      4. aghi Conservare in verticale in vaso di archiviazione capillare con la punta rivolta verso il basso.
      5. Prima di iniettare, posizionare vaso di archiviazione capillare sul ghiaccio per raffreddare gli aghi. Aggiungere un pezzo di carta assorbente umida al barattolo per evitare l'evaporazione una volta che gli aghi sono pieni.
    2. Fertilizzare Eggs (TuttiPassaggi eseguiti a temperatura ambiente)
      1. Striscia uovo frizione gravido spinarello femmina premendo delicatamente l'addome e carezze in un anteriore a posteriore direzione per spingere le uova attraverso la cloaca e in un 35 x 10 mm 2 Petri. Aggiungere un pezzo umido di carta assorbente su un lato della piastra di Petri (non toccare le uova) per creare la camera umida. Mettere il coperchio sulla piastra di Petri in modo da uova rimanere umido.
      2. Euthanize spinarello maschio a 0,025% tricaine-S tamponato con bicarbonato di sodio allo 0,1%.
      3. Taglio aperto l'addome, rimuovere testicoli e macerare in 250 ml soluzione di Hank (vedi Westerfield 44 per il pieno protocollo per la preparazione della soluzione di Hank).
      4. Fertilizzare al massimo 100 uova con la soluzione di sperma 50 ml e mescolare delicatamente con la punta della pipetta al fine di garantire tutte le uova vengono fecondate. Se la frizione è> 100 uova, concimare la metà delle uova successive per garantire che tutti gli embrioni sono in una fase unicellulare al momento dell'iniezione. Le uova possono essere lasciati non fecondatoa RT per fino ad un'ora, e sperma dura generalmente per 1-7 giorni a 4 ° C in soluzione di Hank.
      5. Mantenere gli embrioni coperto con coperchio scatola di Petri dopo la fecondazione per evitare l'essiccazione. Consentire 20-25 min per la prima cella di emergere e gonfiarsi (preparare materiali di iniezione durante questo periodo).
      6. Riempire un piatto di 150 millimetri x 15 mm Petri con acqua stickleback. (Per rendere l'acqua spinarello, prima preparare il 10% di bicarbonato di sodio disciolto in acqua deionizzata. Quindi aggiungere 3,5 g miscela acqua di mare artificiale e 0,217 ml di 10% di bicarbonato di sodio per 1 L di acqua deionizzata, e mescolare / agitare energicamente per sciogliere il sale.)
    3. Preparare la soluzione di iniezione (mentre le uova sono concimazione)
      1. Preparare la soluzione di iniezione in base alla tabella 1 e memorizzare sul ghiaccio.
        Nota: le concentrazioni di alcuni acidi nucleici sono stati aumentati da quelli pubblicati per zebrafish a causa del maggior volume del blastomero stickleback.
    Reagente iniezione Tol2 iniezione BAC iniezione TALEN iniezione CRISPR
    Tol2 mRNA 350 ng 350 ng - -
    DNA 150-200 ng plasmide 200-300 ng BAC - -
    TALEN mRNA - - 200 ng ogni -
    Guida CRISPR RNA - - - 200 ng
    Cas9 mRNA - - - 400 ng
    PBS 0,5% rosso fenolo di inDulbecco 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
    acqua libera RNAsi a 5 ml a 5 ml a 5 ml a 5 ml

    Tabella 1:. Reagenti iniezione Tutte le miscele devono essere pronti a un volume complessivo su 5 ml e conservati in ghiaccio.

    1. Fill Aghi (su ghiaccio; attendere almeno 10 min per Aghi da riempire).
      1. Backfill almeno tre aghi pipettando soluzione per l'iniezione di 0,5 ml sull'estremità smussata superiore dell'ago, mentre gli aghi sono appesi verticalmente in barattolo di stoccaggio capillare. Fare attenzione che la caduta rimane in cima e non cola lungo il lato ed evitare bolle.
      2. Dopo che il liquido rosso ha in gran parte svuotato alla punta appuntita dell'ago, aggiungere un altro 0,5 microlitri fino alla fine smussata dell'ago e lasciar scolare.

    3. Preparare Iniettare Rig e ago per microiniezione

    Nota: Questi passaggi cuna solito essere fatto dopo la concimazione delle uova.

    1. Attiva luce transilluminazione per il microscopio da dissezione e posizionare una lastra di vetro ~ 13 cm x 13 cm sulla base microscopio ottico con il 15 cm intonaco lama sulla parte superiore della lastra di vetro 7. Orientare la sega perpendicolare alla apparecchiatura iniezione con le tacche rivolte verso il porta-aghi.
    2. Accendere alimentazione dell'aria e garantire la pressione è impostata a ~ 200 kPa dal regolatore.
    3. Selezionare la casella di controllo e regolare le impostazioni. Impostare la pressione di ~ 150-175 kPa. Impostare la durata di iniezione a 180 msec.
    4. Allentare il porta aghi, inserire un ago pieno nel supporto fino a quando la resistenza del supporto in gomma può essere sentito, e stringere fino a stringerla.
    5. Regolare l'angolo dell'ago di circa 45 °.
    6. Utilizzare controlli micromanipolatore per regolare l'ago in modo fine è centrato nel campo visivo. Zoom in a ~ 40X di ingrandimento e concentrarsi sulla punta dell'ago, che non dovrebbe essere a contattoil vetro inferiore.
    7. rompere delicatamente la punta dell'ago afferrandolo con una pinza di orologiaio. Idealmente, non si rompono perpendicolarmente, ma piuttosto ad un angolo di ~ 60 °. Rompere vicino alla punta (non più di 2-3 larghezze forcipe lontano dalla fine, figura 2).

    figure-protocol-2
    Figura 2. aghi microiniezione Unbroken e rotti. L'ago superiore è ininterrotta e la punta dell'ago fondo è stato rotto con una pinza (freccia). Gli aghi sono riempiti con una soluzione contenente 0,05% di rosso fenolo. Barra di scala = 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    1. Premere il pedale di iniezione più volte per verificare se l'ago è rotto. Dopo pochi tocchi, minuscole goccioline rosse dovrebbero cominciare a uscire da tha fine. In caso contrario, provare a rompere l'ago leggermente più alto.
    2. Se l'ago ha una bolla d'aria, aumentare l'unità contropressione e premere il pedale diverse volte velocemente a lavorare la bolla fuori.
    3. Regolare la contropressione:
      1. Utilizzare la pipetta di trasferimento usa e getta di mettere alcune gocce di acqua stickleback sulla lastra di vetro.
      2. Abbassare delicatamente l'ago in acqua.
      3. Aumentare la pressione indietro fino a quando un flusso debole di liquido rosa emerge dalla ago (indicante pressione positiva).
        Nota: se non c'è abbastanza pressione di ritorno, l'ago elaborare citoplasma per azione capillare. Se c'è troppa pressione posteriore, il volume di iniezione può essere inavvertitamente troppo grande.
      4. Disimpegno ago per quanto possibile in modo che non venga danneggiato durante la preparazione degli embrioni (vedi sotto).
    4. In alternativa, regolare la pressione torna a un'impostazione di pressione più alta in modo che un forte flusso costante di liquido esce l'ago wgallina viene immerso in acqua. Quindi, premendo il pedale per iniettare diventa inutile; tuttavia, l'iniezione deve essere eseguita rapidamente per evitare un eccesso di iniezione.
      Nota: Non tentare questa tecnica quando prima imparare a iniettare.

    4. microiniezione

    1. Circa 25 minuti dopo la fecondazione, utilizzare due punte 10 microlitri pipetta per rimuovere 5-10 embrioni da la frizione e trasferimento in lastra di vetro.
    2. Sempre con i puntali, separare delicatamente gli embrioni in singole rientranze della lama. Fare attenzione a non forare embrioni.
    3. Usando una pipetta con l'estremità tagliata in modo da embrioni spinarello si inserisce all'interno, aggiungere acqua stickleback sufficiente a coprire gli embrioni, lasciare l'acqua per 3-5 secondi, quindi rimuovere l'acqua in eccesso con la pipetta, lasciando una piccola quantità di acqua di rivestimento ogni embrione.
      Nota: Troppa acqua provoca le chorions a indurirsi e rompere l'ago, ma una piccola quantità di acqua è necessario sollevare il chorion dalla cella e tuorlo (Figura 3A - B).
    4. Partendo con la più embrione distanza, far scorrere la piastra di vetro e l'immagine in modo che il primo embrione riempie circa il 25% del campo visivo.
    5. Abbassare l'ago nel campo visivo, quindi utilizzare il puntale 10 microlitri per ruotare delicatamente l'embrione di identificare blastomero, un granuloso, leggermente giallo leggermente rialzato di citoplasma in cima al tuorlo (Figura 3B), e quindi ruotare in modo che blastomero è direttamente perpendicolare all'estremità dell'ago (mantenendo l'embrione nella rientranza della lama, Figura 3C).
      Nota: le goccioline tuorlo possono muovere come l'embrione viene ruotata, in modo da non li utilizzare come quadro di riferimento per la posizione del blastomeri.
    6. Abbassare l'ago nel citoplasma, ma non spingere fino al tuorlo sottostante. Applicare una pressione lentamente e in modo uniforme quando penetrante corion per evitare di rompere l'ago. Se lacurve ago gravemente, si ritirano e riprovare in una posizione leggermente diversa.
    7. Premere il pedale 3-4 volte per iniettare in modo che un bolo rosso con bordi leggermente diffuse riempie circa ~ 1/8 di diametro del citoplasma (vedere Figura 3D).
      1. Evitare ottenendo un bolo rosso con bordi taglienti che non iniziano diffondere, che indica iniezione nel tuorlo sotto citoplasma (Figura 3E).
      2. Se una macchia rosso-rosato brillante diffonde rapidamente, inserire l'ago ulteriormente per forare la blastomeri.
      3. Se il bolo iniezione diventa giallo istantaneamente, ruotare l'embrione al fine di garantire la blastomere è stato preso di mira e iniettare di nuovo (Figura 3F).

    figure-protocol-3
    Figura 3. Aspetto di embrioni stickleback prima e dopo l'iniezione. Tutti gli embrioni sono tratte da the prospettica guardando attraverso il microscopio (tranne C 'e G). (A) Prima di aggiungere acqua, embrioni fecondati hanno un aspetto uniforme con goccioline di olio galleggiante vicino alla parte superiore del tuorlo. (B) Dopo aggiunta di acqua, si gonfia corion, rivelando un blastomere che sporge dal tuorlo ed è visibile in profilo. (C) Rotazione dell'embrione in modo che l'ago entri perpendicolarmente al corion e blastomero. (C ') Vista laterale di un ago che ha perforato il corion con la punta nel citoplasma. (D) iniezione nel citoplasma risultati in una macchia rossa con bordi diffuse che si dissolvono nel tempo. (E) Iniezione nel tuorlo alla base dei risultati citoplasma in una macchia rossa con bordi definiti. (F) Iniezione nel tuorlo opposta risultati citoplasma in un cambiamento di colore pH indotta dal rosso al giallo. (G) Lateralvista dei risultati di iniezione, con Xs oltre sedi di iniezione sub-ottimali. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    1. Utilizzare i controlli micromanipolatore per ritrarre l'ago, utilizzando la punta della pipetta 10 microlitri di tenere premuto l'embrione, se si attacca all'ago.
    2. Dopo ritrarre l'ago, far scorrere la piastra di vetro per allineare la successiva embrione con l'ago.
    3. Dopo l'iniezione tutti gli embrioni, utilizzare la pipetta per aggiungere l'acqua per gli embrioni, poi raccoglierli nella pipetta di trasferimento e il luogo in 150 millimetri Petri piatto pieno di acqua stickleback.
    4. Asciugare la lastra di vetro con un tovagliolo di carta per evitare di accumulare troppa acqua.
    5. Distribuire embrioni freschi sulla sega e ripetere i passaggi 4.4 tramite 4.10.
    6. Tenere ~ 10% degli embrioni come controlli uninjected per garantire che gli embrioni uninjected sviluppano normalmente e da utilizzare come controlli wild-type per tegli saggi molecolari descritto di seguito.

    5. Cura iniezione Messaggio

    1. Incubare gli embrioni in piastre di Petri a 18 ° C dopo l'iniezione fino alla schiusa 10. A seguito di schiusa, le larve posteriore in acquari come descritto 10.
    2. Delicatamente versare l'acqua spinarello un giorno dopo l'iniezione e sostituire con acqua fresca stickleback. Sostituire con acqua fresca spinarello almeno ogni due giorni dopo.
    3. Verificare la presenza di embrioni morti o malformati quotidiana. Rimuovere tali embrioni per evitare il decadimento di contaminare l'acqua.

    6. Analisi dei risultati iniezione

    1. Per l'iniezione di reporter fluorescenti, monitorare embrioni quotidianamente in una stanza buia utilizzando un microscopio da dissezione fluorescenza con GFP o RFP filtro (a seconda del transgene fluorescente). Registra modelli anatomici di espressione genica con fotografie digitali e / o descrizioni scritte e tabulazione del numero di pesce con diversi Expresdomini sione (figure 4 e 5).
      Nota: Gli spinarelli hanno autofluorescenti, cellule stellate pigmento che sono visibili sotto filtri GFP con inizio alle 4 giorni dopo la fecondazione (DPF).
      1. Per generare linee stabili, salvare gli embrioni con fluorescenza rilevabile e crescere fino all'età adulta, come descritto 10.
      2. Outcross iniettato pesci adulti di wild-type pesce utilizzando la procedura di fecondazione in vitro descritto nella sezione 2.2 e prole schermo per la fluorescenza come descritto al punto 6.1 per cercare prole fluorescente, che indica la trasmissione transgene successo.
      3. Per visualizzare la fluorescenza in covato, priva di nuoto larve, aggiungere 500 microlitri 0,8% Tricaine al piatto 150 millimetri di Petri anestetizzare il pesce e aspettare fino alla fermata di pesce in movimento all'immagine. Sciacquare immediatamente più volte con acqua fresca spinarello seguente osservazione e di imaging.
      4. Facoltativamente, per preservare la fluorescenza per ulteriori immagini, eutanasia larve0,025% (250 mg / L) Tricaine tamponata con bicarbonato di sodio allo 0,1% e fissare per 4 ore in paraformaldeide al 4% in 1x tampone fosfato (PBS) a 4 ° C. Conservare in 1x PBS per un massimo di due settimane.
        Nota: sfondo auto-fluorescenza aumenta nel tempo.
    2. Diagnostico PCR / genotipizzazione digestione per Mutation induzione con CRISPRs o Talens - meglio eseguita in 2 giorni dopo la fecondazione.
      1. Utilizzare una pipetta di inserire 10 embrioni iniettati (2 DPF, ancora in chorions) nei primi 10 pozzetti di una ben 12 PCR tubo striscia. Mettere pesci di controllo uninjected negli ultimi due pozzi.
      2. Rimuovere l'acqua in eccesso stickleback.
      3. Aggiungere 50 microlitri tampone di lisi (10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0.3% Tween-20, e 0,3% NP-40) in ciascun pozzetto.
      4. Inserire tappi su tubi e incubare a 95 ° C per 20 minuti in un termociclatore.
        Nota: Il tuorlo diventa bianca e gommosa dopo la fase di ebollizione.
      5. Rimuovere i coperchi e utilizzare un diverso CLEun puntale 1.000 ml macerare l'embrione in ogni tubo.
        Nota: detriti bianca raccoglierà sul fondo della provetta.
      6. Aggiungere 2,5 ml di 10 mg / ml proteinasi K a ciascun pozzetto.
      7. Sostituire coperchi e incubare a 55 ° C per 1 ora per digerire proteine, seguito da 95 ° C per 20 minuti per inattivare proteinasi K. Conservare a -20 ° C per evitare la crescita di muffe.
      8. Eseguire la PCR usando una polimerasi ad alta fedeltà seguendo le istruzioni del produttore. Utilizzare il lisato embrione come modello di DNA.
        Nota: fare attenzione per rimuovere il liquido dalla parte superiore del tubo di DNA stampo, evitando qualsiasi corion visibile o detriti tuorlo sul fondo della provetta.
      9. Mescolare il prodotto di PCR in ugual volume con una master mix enzima di restrizione contenente tampone specifici enzimi 1x e 0,25 enzima microlitri per campione. Salvare sempre metà del prodotto uncut PCR per saggiare su un gel per confermare i prodotti di PCR sono la dimensione prevista. Incubare la PCR mescolato con l'enzima nelle condizioni appropriate perl'enzima di restrizione.
        Nota: Alcuni enzimi possono richiedere altri rapporti di tampone enzima prodotto di PCR; regolare la concentrazione di buffer se i controlli uninjected non mostrano completa digestione.
      10. Dopo la digestione, prodotti eseguiti su un 1% gel accanto a una scala dimensione del DNA per confermare la dimensione dei prodotti attesi.
        Nota: bande non tagliati in embrioni iniettati indicano la presenza di lesioni molecolari (Figura 6) e controlli uninjected devono essere completamente digeriti per interpretare i risultati.
      11. Per confermare le lesioni, tagliare le bande non tagliati dal gel di agarosio e purificare il DNA con un kit di estrazione gel. Utilizzare sequenziamento Sanger, preferibilmente utilizzando un primer di sequenziamento interno ai primer PCR, per confermare le lesioni. In F 0 iniettato embrioni, un mix di lesioni sarà probabilmente presente, causando la qualità del Sanger leggi di degradare vicino al sito di destinazione.
      12. Per produrre una linea stabile, salvare tutti gli embrioni iniettati da frizioni che schermano positivo per le lesioni molecolari. solremare fino pesce, outcross, e quindi schermo un sottoinsieme di F 1 embrioni per lesioni molecolari come descritto nei punti 6.2.1 attraverso 6.2.11. Se vengono individuati i portatori eterozigoti, far crescere il restante F 1 embrioni di età adulta e identificare gli individui eterozigoti utilizzando DNA estratto da una clip pinna caudale.

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    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Per transgeni Reporter gene che hanno attività enhancer, iniezione di successo si tradurrà in specifico, espressione cellulare del transgene (Figura 4A, 4C). Pesci iniettati possono essere outcrossed per produrre linee stabili (esempio di una linea stabile BAC mostrato nella Figura 4B). L'iniezione di DNA in embrioni stickleback in genere si traduce in letalità di gran lunga superiore rispetto alla sola RNA. È tipico vedere fino al 50% (...

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Iniettano embrioni stickleback una cella per transgenesi o la modifica del genoma presenta tre sfide principali. In primo luogo, relativamente agli embrioni di zebrafish, lo spinarello embrionali corion è dura e spesso rompere gli aghi. Questo problema può essere superato parzialmente usando micropipette di vetro più spesse e più forti e iniettando perpendicolare al corion (vedi protocollo, figura 2). Assicurare che il meno acqua possibile si aggiunge agli embrioni (quanto basta per causare il corion a ...

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    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Gli autori non hanno nulla da rivelare.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Questo lavoro è stato finanziato in parte dal NIH R01 # DE021475 (CTM), un NIH predoctoral formazione di Grant 5T32GM007127 (PAE), e un Graduate Research Fellowship NSF (NAE). Ringraziamo Kevin Schwalbach per l'esecuzione di BAC recombineering e iniezioni, Nick Donde per la generazione di dati di sequenziamento Sanger CRISPR, e Katherine Lipari per il feedback utile sul protocollo di iniezione.

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    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Stereomicroscopio con transilluminazioneLeicaS6e/ KL300 LED
    Micromanipolatore manualeStrumentazione scientifica applicataMM33Micromanipolatore Marzhauser M33
    Sistema di iniezione di pressioneStrumentazione scientifica applicataMPPI-3
    Strumentazione scientifica applicataBPU
    Kit porta micropipetteStrumentazione scientifica applicata MPIP
    Supporto base magneticaStrumentazione scientifica applicataBase
    magnetica Interruttore a pedaleStrumentazione scientifica applicataFSW
    Piastra in ferro (base magnetica)Narishige
    Flaming/Brown StrumentoSutterP-97
    Pipette di trasferimento monousoFisher13-711-7M
    0,5% rosso fenolo in DPBSSigmaP0290tracciante per iniezione
    #5, biologie dumoxel Fine Science Tools11252-30per la rottura dell'ago
    Barattolo per micropipettePrecision InstrumentsE210contiene aghi
    6", 6 denti per pollice sega per cartongessoLenox20571 (S636RP)contiene uova per iniezione
    13 cm x 13 cm lastra di vetroqualsiasi negozio di ferramenta-Capillari
    in vetro borosilicato, 1,0 mm OD / 0,58 mm ID World Precision Instruments1B100-F4*vetro più duro del pesce zebra capillari di iniezione
    150 x 15 mm Piastra di PetriFisherFB0875714allevare embrioni di spinarello
    Piastra di Petri da 35 mm x 10 mmFisher08-757-100Aconservare le uova pre-iniezione
    Instant Ocean SaltInstant OceanSS15-10
    Bicarbonato di sodioSigmaS5761-500G
    Tricaina metansolfonato/MS-222Western Chemical IncMS222anestesia/eutanasia dei pesci
    Kit di trascrizione Sp6AmbionAM1340Per la trascrizione di TALEN e trasposasi mRNA
    RNeasy cleanup kitQiagen74104purificare la trasposasi o TALEN RNA
    QiaQuick PCR cleanup kitQiagen28104pulire i plasmidi per iniezione
    Proteinasi K 20 mg/mlAmbionAM2546per la preparazione del DNA
    Kit Nucleobond BAC 100Clontech740579per la preparazione del DNA
    BAC NotINEBR0189L
    Phusion polimerasiFisherF-530L
    Qiagen PlasmidPlus Midi kitQiagen12943contiene il tampone di risciacquo delle endotossine
    QIAQuick Estrazione GelQiagen28704 per sequenziamento di mutazioni indotte
    Fenolo:cloroformio:Alcool isoamilicoSigmaP2069-100ML
    Acetato di sodioSigmaS2889-250G
    Etanolo (grado di biologia molecolare)SigmaE7023-500ML
    AgarosioSigmaA9539
    50x tampone Tris-acetato-EDTAThermoFisherB49
    0,5-10 Kb RNA ladderThermoFisher15623-200
    Nanodrop  SpettrofotometroThermo ScientificNanodrop 2000
    ParaformaldeideSigma158127-500G
    10x PBSThermoFisher70011-044
    1 kb Plus Scala DNAThermoFisher10787-018
    Cloruro di potassioSigmaP9541-500G
    Cloruro di magnesioSigmaM8266-100G
    NP-40ThermoFisher28324
    Tween 20 SigmaP1379-500ML
    Tris pH 8.3TeknovaT1083
    Provetta PCR a 12 strisceThermo ScientificAB-1113
    Estrattore per micropipette IP pinza World

    References

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