Valutazione della myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilità Alla base Cardiac eccitazione-contrazione Accoppiamento

Sommario

Questo articolo descrive un protocollo che valuta i cambiamenti della sensibilità del miofilamento Ca²⁺ durante la contrazione in miociti cardiaci isolati dal cuore di ratto. Insieme all'elettrofisiologia cardiaca, ai livelli di citosol sistolico/diastolico Ca²⁺ e alla contrazione/rilassamento, questa misurazione è fondamentale per sostenere i meccanismi che mediano l'accoppiamento eccitazione-contrazione cardiaca nei cuori sani e malati.

Abstract

L'insufficienza cardiaca e aritmie cardiache sono le principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. Tuttavia, il meccanismo di patogenesi e malfunzionamenti miocardio nel cuore malato deve essere ancora pienamente chiariti. Prova convincente recente dimostra che i cambiamenti nel myofilament Ca ²⁺ sensibilità influenzano Ca ²⁺ intracellulare attività omeostasi e canali ionici in miociti cardiaci, i meccanismi fondamentali responsabili del potenziale d'azione cardiaco e la contrazione nei cuori sani e malati. Infatti, le attività di canali ionici e trasportatori sottostanti potenziali d'azione cardiaci (ad esempio, Na ^+, Ca ²⁺ e canali K ⁺ e Na ⁺ -Ca ²⁺ scambiatore) e Ca ²⁺ movimentazione proteine ​​intracellulari (ad es., Recettori rianodinici e Ca ²⁺ -ATPasi nel reticolo sarcoplasmatico (SERCA2a) o fosfolambano e la sua fosforilazione) sono convenzionalmente misurata condotta in basemangiato i meccanismi fondamentali di attacco cardiaco eccitazione-contrazione (EC). Entrambe le attività elettrica nella membrana e intracellulari Ca ²⁺ cambiamenti sono i segnali di attivazione di accoppiamento CE, che myofilament è l'unità funzionale di contrazione e rilassamento, e myofilament Ca ²⁺ sensibilità è indispensabile nella realizzazione di prestazioni myofibril. Tuttavia, pochi studi incorporano myofilament Ca ²⁺ sensibilità nell'analisi funzionale del miocardio a meno che non è al centro dello studio. Qui, descriviamo un protocollo che misura sarcomere accorciamento / ri-allungamento e il livello di intracellulare di Ca ²⁺ usando Fura-2 AM (rilevamento raziometrico) e valutare i cambiamenti di myofilament Ca ²⁺ sensibilità nei miociti cardiaci da cuori di ratto. L'obiettivo principale è quello di sottolineare che myofilament Ca ²⁺ sensibilità dovrebbe essere presa in considerazione in abbinamento CE per l'analisi meccanicistica. un'indagine completa di isui canali ionici, trasportatori, intracellulare di gestione di Ca ^2+, e myofilament Ca ²⁺ sensibilità che sono alla base dei miociti contrattilità nei cuori sani e malati fornirà informazioni preziose per la progettazione di strategie più efficaci di traslazione e valore terapeutico.

Introduzione

Cardiac accoppiamento eccitazione-contrazione (EC) è lo schema fondamentale per analizzare le proprietà meccaniche del miocardio, cioè, la funzione contrattile del cuore ^1,2. Accoppiamento CE è avviata da depolarizzazione della membrana secondaria alle attività di canali ionici sarcolemma (ad esempio, il canale Na ⁺ voltaggio-dipendenti, che può essere misurata mediante tecniche di patch-clamp). Successiva attivazione di voltaggio-dipendenti di tipo L Ca ²⁺ canali (LTCCs) e Ca ²⁺ afflusso tramite LTCCs innescare la maggior parte di Ca ²⁺ rilascio attraverso i recettori rianodin....

Protocollo

Il protocollo è in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicati dal National Institutes of Health delle Nazioni Unite (NIH Publication No. 85-23, rivisto 1996). E 'stato approvato dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) di Seoul National University (approvazione IACUC no .: SNU-101.213-1).

1. Buffer Preparazione (Materiali e attrezzature Tabella)

1. Preparare 300 ml di soluzione di isolamento fresco il giorno dell'esperimento (in mM: NaCl, 135; KCl, 5,4, MgCl _2, 3,5, glucosio, 5; HEPES, 5; Na ₂ HPO _4, 0,4, taurina, 20; pH 7,4 con NaOH). <....

Risultati

miociti LV sono isolati da normali e ipertesi cuori di ratto. Miociti a forma di bastoncello con striature chiare (che rappresenta sarcomeri) e contrazioni stabili in risposta alla stimolazione campo sono considerati come i miociti ottimali e sono selezionati per le registrazioni (Figura 2A). Nell'esempio illustrato in F IGURA 2A, un Fura 02:00 MOLLA LV miociti è posizionato orizzontalmente e la apertura della telecamera viene regolata in modo che il.......

Discussione

Qui, descriviamo i protocolli per valutare i cambiamenti di myofilament Ca ²⁺ sensibilità in un'unica miociti cardiaci isolati e sottolineare l'importanza di misurare questo parametro insieme a proprietà elettrofisiologiche, intracellulari di Ca ²⁺ transitori, e la dinamica myofilament. Questo perché le registrazioni di uno o due dei parametri non possono spiegare i meccanismi sottostanti contrazione cardiaca e relax. A differenza dei metodi convenzionali che misurano miociti contrazione e .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 settimane
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Corea)	AHN901	Codice assicurativo:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucosio	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitolo	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodio Piruvato	Sigma	P2256
Taurina	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Albumina fetale bovina	Sigma	A7906
Collagenasi di tipo 2	Worthington	LS004177
Proteasi	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Sonde molecolari	F1221
Pluronic F127 Soluzione al 20% in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Bagno d'acqua con agitazione	Chang Shin	Modello scientifico: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Costruttore sperimentale	Acquisizione e analisi dei dati di accoppiamento EC nei miociti
Miociti Calcio & Sistema di registrazione della contrattilità	IonOptix Ltd
Bagno d'acqua circolante	BS-Tech	BW2-8
Microscopio a fluorescenza per miociti	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescenza & Rilevamento video	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescenza & Interfaccia di sistema	IonOptix	FSI700
Sorgente luminosa di eccitazione	IonOptix	mSTEP
Lampada ARC ad alta intensità Alimentazione	Cairn Resresearch
Controller ruota portafiltri	IonOptix	GB / MUS200
Stimolatore digitale	Sistemi medici Porzione	S-98 Mutimode
Composizioni di soluzioni sperimentali
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Soluzione di isolamento (pH: 7,4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentrazione (mmol) 135
Concentrazione KCl	Sigma	P4504	(mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentrazione (mmol) 5
Glucosio	Concentrazione Sigma	G8270	(mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentrazione (mmol) 3.5
Concentrazione di Taurina	Sigma	CB2742654	(mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentrazione (mmol) 0,4
Soluzione di conservazione (pH: 7,4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentrazione (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentrazione (mmol) 5,4
HEPES	Sigma	H3375	Concentrazione (mmol) 10
Glucosio	Sigma	G8270	Concentrazione (mmol) 5,5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentrazione (mmol) 0,2
Mannitolo	Sigma	M4125	Concentrazione (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentrazione (mmol) 5
Piruvato di sodio	Sigma	P2256	Concentrazione (mmol) 5
Taurina	Sigma	CB2742654	Concentrazione (mmol) 20
Soluzione di perfusione (soluzione di Tyrode, pH: 7,4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentrazione (mmol) 141,4
KCl	Sigma	P4504	Concentrazione (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentrazione (mmol) 0,33
HEPES	Sigma	H3375	Concentrazione (mmol) 10
Glucosio	Sigma	G8270	Concentrazione (mmol) 5,5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentrazione (mmol) 1,8          Per il carico di Fura 2AM, le concentrazioni di CaCl2 sono 0,25 mM e 0,5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentrazione (mmol) 1
Mannitolo	Sigma	M4125	Concentrazione (mmol) 14,5
Soluzione di collangenasi 1
Soluzione di isolamento (30 ml)
Albumina fetale bovina (soluzione BSA 5 ml)			Concentrazione (mmol) 1,67 mg/mL
Collagenasi Tipo 2	Worthington	LS004177	Concentrazione (mmol) 1 mg/mL
Proteasi	Sigma	P6911	Concentrazione (mmol) 0,1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentrazione (mmol) 0,05 mM
Soluzione di collangenasi 2
Soluzione di isolamento ( 20 ml)
Albumina fetale bovina (soluzione BSA 3,3 mL)			Concentrazione (mmol) 1,67 mg/mL
Collagenasi Tipo 2	Worthington	LS004177	Concentrazione (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentrazione (mmol) 0,05 mM
Soluzione
Soluzione di isolamento ( 40mL)
Albumina fetale bovina	Sigma	A7906	Concentrazione (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentrazione (mmol) 1mM

BSA