Progettazione e sviluppo di aptameri delle nanoparticelle d'oro Based colorimetriche saggi per applicazioni in-the-field

Sommario

La progettazione e lo sviluppo di un saggio colorimetrico nanoparticelle aptameri oro per il rilevamento di piccole molecole per applicazioni sul campo è stata esaminata. Inoltre, una smart-dispositivo di applicazione colorimetrico (app) è stato convalidato e conservazione a lungo termine del test è stata stabilita per l'uso nel campo.

Abstract

La progettazione e lo sviluppo di una nanoparticella aptameri oro (AUNP) saggio colorimetrico per la rilevazione di piccole molecole per applicazioni sul campo è stata esaminata. saggi di colore a base di destinazione AUNP selettivo sono stati sviluppati in laboratorio proof-of-concept controllati. Tuttavia, questi sistemi non sono stati esercitato ad un punto di errore per determinare il loro uso pratico oltre impostazioni di laboratorio. Questo lavoro descrive un approccio generico per progettare, sviluppare e risolvere i problemi di un saggio colorimetrico aptameri-AUNP per piccole analiti molecola e con il saggio per le impostazioni in-the-field. Il saggio è vantaggioso perché aptameri adsorbiti passivazione delle superfici nanoparticelle e forniscono un mezzo per ridurre ed eliminare le risposte positive falsi per analiti non bersaglio. Transizione questo sistema per usi pratici necessario definire non solo la shelf-life del test aptameri AUNP, ma che fissa i metodi e le procedure per estendere l'capabil conservazione a lungo terminevità. Inoltre, una delle preoccupazioni riconosciuti con lettura colorimetrica è l'onere che gli analisti a identificare con precisione i cambiamenti spesso sottili di colore. Per diminuire la responsabilità analisti nel settore, un protocollo di analisi del colore è stato progettato per eseguire le funzioni di identificazione del colore senza la necessità di eseguire questa operazione su attrezzature di laboratorio di grado. Il metodo per la creazione e test del protocollo di analisi dei dati è descritto. Tuttavia, per capire e influenzare la progettazione di test aptamer adsorbite, le interazioni associate al aptamer, bersaglio, e AuNPs richiedono ulteriori studi. Le conoscenze acquisite potrebbe portare a sartoria aptameri per una migliore funzionalità.

Introduzione

Colorimetria è una delle tecniche più antiche utilizzate in chimica analitica. Per questa tecnica, una determinazione qualitativa o quantitativa dell'analita viene effettuata in base alla produzione di un composto colorato ^1. Tipicamente, saggi colori utilizzano reagenti che subiscono un cambiamento di colore in presenza della specie analiti, che si traduce in una variazione di colore osservabile o rilevabile nello spettro della luce visibile. Colorimetria è stato utilizzato nella rilevazione di bersagli che vanno da atomi, ioni e piccole molecole alle molecole biologiche complesse come gli acidi nucleici (DNA), peptidi e proteine ^​​2-4. Negli ultimi due decenni, i nanomateriali hanno rivoluzionato il campo di test di rilevazione, in particolare con test basati colore ^5-6. Combinando le proprietà chimiche e fisiche uniche di nanomateriali con un elemento di destinazione di riconoscimento selettivo, come gli anticorpi, aptameri oligonucleotide o aptameri peptidici, ha portato alla recrudescenza in la progettazione e lo sviluppo di test di rilevazione colorimetrici ^7.

nanoparticelle metalliche hanno una proprietà viraggio dipendente dalle dimensioni dimostrato, che è stato sfruttato nella progettazione di numerosi test colorimetrici. Nanoparticelle di oro (AuNPs) sono di particolare interesse per uno specifico spostamento di colore rosso al blu, quando la soluzione dispersa di particelle è indotta ad aggregare ^8, tipicamente attraverso la precisa aggiunta di sale. La capacità di controllare la transizione dalla disperso (rosso) alle (blu) stati aggregati ha portato alla creazione di sensori colorimetrici per ionica, piccolo molecolare, peptidi, proteine ​​e bersagli cellulari ^2-4,9. Molti di questi sensori impiegano aptameri come il motivo di puntamento.

Aptameri sono molecole di acido ribonucleico (RNA) DNA o selezionati da un pool casuale di 10 ¹² -10 ¹⁵ diverse sequenze ^10-11. Il processo di selezione individua re bersaglioElementi cognizione con affinità di legame nel regime bassa nanomolari, e l'evoluzione sistematica dei ligandi per arricchimento esponenziale (SELEX) è il processo più comunemente noto ^12-13. I vantaggi di aptameri a base di oligonucleotidi per applicazioni di rilevamento sono la facilità di sintesi, modifica chimica controllabile, e stabilità chimica ^14-15.

Un approccio per la creazione di un saggio colorimetrico combina nanomateriali con elementi di riconoscimento, consiste nel combinare queste due specie attraverso l'adsorbimento fisico di molecole di DNA-aptamer alle superfici AUNP. Attraverso obiettivo vincolante-aptamer, l'aptamero sperimenta un cambiamento strutturale ^16-18 che altera l'interazione del aptamer con la superficie AUNP, che porta ad una risposta inducibile colore rosso-to-blu ¹⁹ con l'aggiunta di sale. Questa caratteristica sorprendente di AuNPs fornisce un meccanismo di risposta colorimetrica osservabile per i dispositivi aptamer-based che possono essere utilizzati per defirmare test colorimetrici per i diversi analiti.

saggi di colore progettati utilizzando non covalenti, fisicamente assorbiti aptameri di DNA su superfici AUNP hanno lo stigma di essere una piattaforma sensore debole a causa di problemi con la robustezza, una propensione per il fallimento di fuori di impostazioni di laboratorio controllate, e la mancanza di informazioni disponibili per l'uso in pratica impostazioni. Tuttavia, il saggio colorimetrico basato aptameri AUNP era di interesse per la semplicità di funzionamento e risposta cromatica osservabile. L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo per la progettazione, lo sviluppo, il funzionamento, la riduzione della superficie correlata risposta falso positivo, e la conservazione a lungo termine di DNA-AUNP test colorimetrici basati uso di cocaina come l'analita rappresentante. Inoltre, abbiamo proposto questo adsorbito aptamer approccio test (figura 1) come vantaggioso per la semplicità e facilità d'uso che ha provocato meno passaggi rispetto all'approccio convenzionale per questi aptameri AUNP assAYS. Per questo test, l'aptamero è stato aggiunto ai AuNPs, che era permesso assorbire alla superficie per un periodo prolungato di tempo. Un ulteriore vantaggio di questo approccio è la riduzione della risposta non bersaglio nuove molecole legate alle interazioni di superficie AUNP. Tuttavia, la riduzione in risposta falsi positivi a scapito della sensibilità del test. Quindi un equilibrio tra la protezione superficiale e analita accessibilità è necessario mantenere una corretta funzione test. Inoltre, un grave difetto di analisi saggi colore attraverso mezzi diversi con strumentazione è che i risultati sono spesso soggettivi e aperto all'interpretazione da analista-a-analista, soprattutto quando si cerca di distinguere sottili differenze di colore. Al contrario, ci sono una serie di problemi con fare strumentazione basata laboratorio utilizzabile al di fuori del laboratorio, come la disponibilità di energia, la praticità con la portabilità, ecc In questo lavoro, un protocollo di analisi del colore è stato sviluppato per More la portabilità e per eliminare alcune delle congetture comunemente associati con l'interpretazione del test basato colore ^20-21. Rispetto ai precedenti approcci, questo sforzo è sforzato di spingere questi test ai loro limiti per applicazioni al di là delle impostazioni di laboratorio.

Protocollo

1. Sintesi via citrato Riduzione di oro nanoparticelle (AUNP) e caratterizzazione

1. Pulire una beuta (500 ml) e grande ancoretta con 5 ml di acido nitrico concentrato e 15 ml di acido cloridrico concentrate in cappuccio della sicurezza chimica.
   1. Bagnare l'intera superficie del pallone con il lavaggio acido, lavare il pallone con acqua priva di nucleasi, e consentire il pallone asciugare.
2. Aggiungere 100 ml di 1 oro cloruro mM (III); utilizzare un foglio di alluminio per coprire la parte superiore del decapaggio beuta e di calore con agitazione continua su una piastra calda fino ad ebollizione.
3. Aggiungere 10 ml di sodio citrato 38,8 mm. Il colore cambia da chiaro / grigio, al rosso blu / nero, e, infine, scuro scuro per diversi minuti. Continuare a mescolare con il riscaldamento spento per 10 min.
4. Lasciare che la sospensione AUNP raffreddare a temperatura ambiente e aggiungere 110 ml di dietilpirocarbonato (DEPC) con agitazione continua.
5. Coprire l'intero pallone confoglio di alluminio e consentono il trattamento DEPC di incubare una notte. Conservare tutti i AuNPs al buio, in contenitori di stoccaggio ambra o coperto con un foglio di alluminio.
6. Autoclave la sospensione AUNP, raffreddare a temperatura ambiente, e filtrare su un 0,22 micron pori della membrana di acetato di cellulosa. Conservare il filtrato, autoclavato soluzione madre AUNP al buio a 4 ° C.
   NOTA: Il trattamento con DEPC, la sterilizzazione tramite autoclave, e la conservazione a 4 ° C migliorerà la shelf-life del test aptameri AUNP. Bagagli in questo modo consentirà per il saggio a funzionare per più di 2 mesi.
7. Calcolare la concentrazione AUNP ottenendo Ultra Violet assorbimento-visibile a 520 nm, e utilizzare il coefficiente di estinzione (Ɛ) 2,4 x 10 ⁸ L mol ^-1 cm ^-1 con la legge di Beer calcolando la concentrazione (c). La concentrazione è stata determinata da 10 nM con una dimensione di 15 nm determinato dalla dispersione della luce dinamica.
   NOTA: Le concentrazioni variano from lotto a lotto. Diluire le scorte AUNP con acqua priva di nucleasi se necessario per mantenere la desiderata 10 nM AUNP sospensione.

2. DNA-aptameri, tampone, soluzione, e test di preparazione

1. Acquistare o sintetizzare la seguente cocaina sequenze aptamer utilizzando standard di fosforammidito chimica ²² rilegatura:
   MN4 ^19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
   MN6 ^19: 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 '
2. Purificare i aptameri utilizzando dissalazione standard ^23. Ricostituire oligonucleotidi in acqua priva di nucleasi sia a 100 micron o 1 soluzioni madre mm. Aliquotare e conservare a -20 ° C per diversi mesi.
3. Acquisto o preparare scorte di sterile 1 M 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) pH 7.4, 100 mM di cloruro di magnesio (MgCl ₂₎ e 1 M di cloruro di sodio (NaCl).
4. Preparare 50 ml di tampone in priva di nucleasi wi acquaLe concentrazioni Th di 20 mm HEPES, 2 mM MgCl _2, pH 7.4 e conservare a temperatura ambiente per mesi.
5. Incubare la DNA con soluzione madre AUNP (10 nM) per 3-4 ore a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. Variare il volume di AuNPs come desiderato per fornire abbastanza campione per le prove da eseguire (2.5-7.5 ml).
   1. Qui, utilizzare densità di carico di 90, 120, 150, e 180 molecole di DNA / AUNP in questo lavoro. Variare il volume e le concentrazioni di DNA di conseguenza. Tune la copertura del DNA per ridurre le indesiderate AUNP relative superficiali risposte a colori di analiti non bersaglio.
      NOTA: L'aumento della copertura DNA riduce la sensibilità del test. Le densità di carico sono calcolate dal conoscere la concentrazione dello stock AUNP, e calcolando il numero totale di AuNPs presenti nel volume desiderato per esperimenti. Se le densità di copertura attuali sono desiderati, i protocolli esistenti per ottenere quei valori ^7. La copertura DNA è stata determinata utilizzando un 50 kDa mpeso olecular colonna di cutoff di selezione per separare il DNA AUNP vincolati dal DNA libero. I AuNPs sono troppo grandi per passare attraverso la colonna di spin, mentre il DNA libero attraverserà facilmente. Il passo successivo è quello di quantificare il DNA libero raccolti con misure di assorbanza o un singolo colorante fluorescente DNA incagliato.
6. Aggiungere un uguale volume di 20 mM HEPES, 2 mM MgCl _2, pH 7,4 tampone e posizionare il campione a 4 ° C nella notte scura. Il saggio aptameri-AUNP era in 10 mM HEPES, 1 mM MgCl _2, pH 7.4 (tampone).

3. Sale Titolazione e configurazione Assay

1. Determinare la concentrazione di sale iniziale necessario per indurre la risposta colore saggio per titolazione del sale con il vuoto test. Aggiungere 20 ml di metanolo (vuoto) a 180 aliquote microlitri di test aptameri-AUNP in una piastra da 96 pozzetti. Titolare campioni con volumi crescenti di soluzione madre NaCl (1 M o 2 M) e determinare il punto di equivalenza (Figura 2 NOTA: Il test può essere scalata a volumi più piccoli, mantenendo il rapporto di metanolo vuoto (o analita disciolto) di aptameri AUNP test stesso.
   1. Qui, determinare il volume di NaCl necessaria a provocare il minimo cambiamento di colore mediante osservazione visiva. La concentrazione di partenza per il test è stata di 75 mm e 130 mm per MN4 e MN6, rispettivamente, ad una molecola di DNA 60 / AUNP densità di copertura.
      NOTA: Per una determinazione quantitativa della concentrazione iniziale del sale, il punto medio della curva di titolazione serve come un buon punto di partenza. Inoltre, le concentrazioni utilizzate variano in base alla aptamer, DNA densità di copertura, fin dal primo giorno per giorno le prestazioni, e da lotto a lotto.
2. Ottimizzazione della risposta del test, aggiungere 20 ml di nuove molecole diluito in metanolo a 180 aliquote microlitri di test aptameri-AUNP in una piastra da 96 pozzetti a temperatura ambiente. Aggiungere immediatamente la concentrazione di NaCl determinato nella fase precedente per avviare la risposta cromatica dosaggio.
   NOTE: Utilizzare una pipetta multicanale per effettuare esperimenti multipli contemporaneamente.
3. Ottenere la più grande cambiamento di colore possibile aumentando o diminuendo la concentrazione di NaCl, e confrontando la risposta obiettivo alla risposta vuota. Utilizzare la concentrazione di NaCl, che offre la più grande differenza di risposta.
4. Osservare e misurare la risposta del test 150 sec dopo NaCl aggiunta. Analizzare l'assorbanza a 650 nm e 530 nm con uno spettrometro o ottenere una macchina fotografica digitale della risposta dosaggio (vedere la sezione 4 per la foto protocollo di analisi).
   NOTA: un lettore di micropiastre è stato utilizzato per ottenere le misurazioni per questo lavoro.
5. Tracciare i risultati come il rapporto di assorbanza ottenuto a 650 nm e 530 nm (E ₆₅₀ / E ₅₃₀₎ in funzione della concentrazione dell'analita. Normalizzare la risposta del test al segnale vuoto come è stato fatto in questo lavoro.

4. Photo and Digital Image Analysis colori Protocollo di analisi

1. preparall'e i campioni di analisi come descritto (sezioni 3.2-3.3). Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un transilluminatore.
   Nota: un transilluminatore standard di laboratorio è in genere troppo luminoso per ottenere immagini digitali utilizzabili per questa analisi. Questi transilluminatori causare spaziate regolarmente "linee scure" a comparire nell'immagine digitale per l'intensità della fonte di luce. Fare un transilluminatore da un diodo ad emissione luminosa (LED) light box based e un pezzo di plastica opaca funziona bene.
2. Ottenere foto della piastra a 96 pozzetti a 150 sec dopo NaCl Inoltre, importare le immagini in software di analisi dell'immagine, e calcolare i valori medi di rosso, verde e blu (RGB), utilizzando una tecnica di averaging incrementale, come mostrato nell'equazione 1 ^24:
   (1)
3. Convertire i valori RGB da RGB (sRGB) spazio colore standard per lo spazio colore diagramma di cromaticità (CIExyY), utilizzando le seguenti equazioni ^24:
   (2)
   (3)
   (4)
4. Convertire i valori RGB esponenziali in valori RGB lineare utilizzando l'equazione 2. La matrice specificata nell'equazione 3 viene utilizzato per calcolare la X, Y e Z valori dello spazio colore CIE ^24.
5. Calcolare i valori X e Y cromaticità utilizzando la formula 4 che rappresenta il colore medio dei pixel nell'area selezionata per l'analisi ^24.
6. Eseguire l'analisi in ogni pozzetto e riportare i valori di cromaticità per generare una curva di calibrazione (Figura 4). Ottenere l'errore standard analizzando il colore delle diverse aree dello stesso bene.

5. Congelamento Aptamero-AUNP Assay per la conservazione a lungo termine

1. Preparare i componenti del dosaggio aptameri AUNP come descritto nelle sezioni 2.4 e 2.5. Realizzare soluzioni separate contenenti 1 g / trealosio ml e 1 g / ml di saccarosio in acqua priva di nucleasi per rendere la Soluzione Cryogen.
   NOTA: Elevate concentrazioni di trealosio e saccarosio sono stati usati per ridurre il fattore di diluizione durante la preparazione del test per il congelamento. Riscaldare le soluzioni di zucchero su una piastra calda in un bicchiere di acqua per sciogliere completamente gli zuccheri prima dell'uso.
2. Effettuare una soluzione contenente 19,2 mg / ml trealosio e 4,8 mg / ml di saccarosio con il test 60 MN4-DNA / AUNP ad un volume finale di 200 microlitri in provette da 1,5 ml microcentrifuga. Le concentrazioni di soluzioni cryogen finali varieranno con una copertura del DNA.
   Nota: I campioni da congelare non deve superare i 300 ml. volumi più grandi non possono bloccare in modo corretto.
3. Flash congelare i campioni utilizzando un C freezer -146 ° o in azoto liquido. Conservare i campioni congelati fino al momento dell'uso. Memorizzazione può essere in una -80 ° C o -20 ° C una volta congelamento flash è completa.
4. Per questo lavoro, lasciare i campioni in C congelatore -146 ° corsonotte e poi trasferire in un congelatore C -20 ° C per la conservazione a lungo termine.
   NOTA: Flash congelamento può causare la aptameri-AuNPs di aggregare. Testare l'integrità del processo di congelamento monitorando l'assorbanza profilo e confrontandola con un campione scongelati. Se si osserva aggregazione, aumentare la quantità di soluzione criogeno per compensare questo problema.
5. Scongelare i campioni a temperatura ambiente ed utilizzare solo sufficiente campioni necessari per la sperimentazione. Ottenere assorbanza spettri dei campioni scongelati e confrontare gli spettri della linea di base di un campione scongelato soluzione cryogen trattata. Misurare l'assorbanza da 400 nm a 700 nm.
6. Eseguire la titolazione sale (sezione 3.1), verificare il (punto 3.2) del test, e tracciare i risultati (sezioni 3.3 e 3.4), come descritto in precedenza.

Risultati

L'obiettivo principale di questo lavoro è stato quello di sviluppare e studiare la stabilità e la robustezza di aptameri basato AUNP test colorimetrici per l'utilizzo in campo. Come evidenziato in una precedente pubblicazione, due strategie distinte per la creazione del test sono stati esaminati ^7. I saggi sono stati chiamati il ​​Aptamero Assay libero e la Adsorbed Aptamero Assay. Il adsorbito Aptamero Assay era più attraente ai fini di un test di rilevazione fieldable

Discussione

Negli ultimi dieci anni, nanoparticelle basato test colorimetrici sono stati sviluppati per la rivelazione di bersagli includono piccole molecole, DNA, proteine ​​e cellule ^2-4. Assays che utilizzano DNA aptameri con nanoparticelle sono state guadagnando interesse. Tipicamente, questi test colorimetrici vengono eseguite mescolando il DNA-aptamer con nuove molecole seguita da aggiunta a AuNPs ^9-10. Tuttavia, questi test sono stati utilizzati in proof-of-concept dimostrazioni con le impostazioni di l...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cloruro d'oro(III) idrato	Sigma	254169	La purezza del 99,999% è importante e le soluzioni sono state rese fresche ogni volta
Diidrato di citrato di sodio	Sigma	W302600-1KG-K	Abbiamo riscontrato che il produttore influisce notevolmente sugli saghi AuNP, e le soluzioni sono state rese nuove ogni volta
Sinergia	Bio-TEK	HT	Qualsiasi spettrometro di assorbenza funzionerà, ma un lettore di placche fornisce analisi di più campioni
4-(2-idrossietil)piperazina-1-acido etanosulfonico (HEPES) Tampon, 1  M sterilizzato	Amresco	J848	Qualsiasi marca sterilizzata va bene
Corning, 250 ml Sistema di filtri, 0,22  & micro; Acetato di cellulosa	Pescatore	430767	Sono state trovate altre membrane capaci di rimuovere gli AuNP
Spettrofotometro UV	Varian	Cary 300	Qualsiasi spettrometro di assorbenza funzionerà
Cloruro di magnesio esaidrato	Fluka	63068	≥ Il 98% qualsiasi marca funziona
DNA	IDT	Costume	Il DNA è stato purificato con una colonna di desalinizzazione, possono essere utilizzate tecniche di purificazione più avanzate
Procaina Cloridrato	ACROS	AC20731-1000	È stato preparato il 99% di scorte di 1 mg/ml di metanolo
Acido cloridrico	Pescatore	A144S-500	36,5-38,0% con altri marchi vanno bene
Cocaina Cloridrato	Lipomed	COC-156-HC-1LM	Abbiamo riscontrato che il produttore influisce notevolmente sugli saghi AuNP
Acido nitrico	Pescatore	A509-SK212	Il 65% con altre marche funziona
Soluzione di cloruro di sodio, grado 5 M bioreagente	Sigma	S5150-1L	Le soluzioni sterili fatte di solido funzionano
Pirocarbonato dietilico	Sigma	D5758-25 mL	≥ Il 97% qualsiasi marca funzionerà
Cloridrato di ecgoninemetilestere	Lipomed	COC-205-HC-1LM	Abbiamo ottenuto il controllo EME dallo stesso produttore del target della cocaina
Tubi microcentrifughe, Axygen Scientific, non sterili, 1.7  Ml	VWR	10011-722	Abbiamo riscontrato che il produttore influisce molto sugli saghi AuNP, e i tubi sono stati autoclavati internamente
Acqua priva di nucleasi
metanolo