Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte-Uso sinoviociti fibroblasti-come isolato da Giunti dell'artrite reumatoide pazienti

Sommario

Qui si descrive un protocollo per la generazione di cellule staminali indotte pluripotenti-umani da sinoviociti fibroblasti come derivati ​​da pazienti, utilizzando un sistema lentivirale senza cellule di alimentazione.

Abstract

cellule somatiche maturi possono essere invertiti in uno stato di cellule staminali pluripotenti, come usando un insieme definito di fattori di riprogrammazione. Numerosi studi hanno generato indotto cellule staminali pluripotenti (iPSCs) da vari tipi di cellule somatiche da trasduzione quattro fattori di trascrizione Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Lo studio di iPSCs rimane all'avanguardia della ricerca biologica e clinica. In particolare, iPSCs paziente-specifici possono essere utilizzati come strumento pionieristica per lo studio della malattia pathobiology, poiché iPSCs possono essere indotte dal tessuto di ogni individuo. L'artrite reumatoide (AR) è una malattia infiammatoria cronica, classificati per la distruzione della cartilagine e struttura ossea nelle articolazioni. iperplasia sinoviale è uno dei motivi principali o sintomi che portano a questi risultati in RA. Sinoviociti fibroblasti-like (FLSS) sono le principali cellule del componente della membrana sinoviale iperplastica. FLSS nel giunto senza limiti proliferano, alla fine invadere il cartil adiacenteetà e osso. Attualmente, la membrana sinoviale iperplastica può essere rimosso solo da un intervento chirurgico. La sinovia rimosso viene utilizzato per la ricerca RA come un materiale che riflette la condizione infiammatoria dell'articolazione. Come un giocatore importante nella patogenesi della RA, FLSS può essere utilizzato come materiale per generare e studiare le iPSCs di pazienti affetti da AR. In questo studio, abbiamo usato il FLSS di un paziente RA per generare iPSCs. Utilizzando un sistema lentivirale, abbiamo scoperto che FLSS può generare RA paziente-specifici IPSC. I iPSCs generati da FLSS possono essere ulteriormente utilizzati come strumento per studiare la fisiopatologia della RA in futuro.

Introduzione

Le cellule staminali pluripotenti sono la piattaforma di prossima generazione in vari campi clinici e biologici. Sono uno strumento promettente che può essere utilizzato in modelli di malattia, screening di farmaci, e la terapia medica rigenerativa. Umani cellule staminali embrionali (hESC) sono stati utilizzati principalmente per studiare e comprendere le cellule pluripotenti. Tuttavia, isolato dalla distruzione della blastocisti umana, hESC sono associati a diverse preoccupazioni etiche. Nel 2007, il dottor Shinya Yamanaka e il suo team invertito il processo di programmazione delle cellule e hanno sviluppato le cellule staminali adulte da cellule somatiche umane ^1,2. Pertanto, a differenza di hESC, indotto cellule staminali pluripotenti (iPSCs) possono essere generati da cellule somatiche mature, evitando gli ostacoli etici.

Di solito, iPSCs vengono generati con la consegna di quattro geni esogeni: Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc. Questi fattori Yamanaka sono originariamente forniti con sistemi lentivirali e retrovirali. I primi iPSCs sono stati ottenuti da topo somatica cells ^3. Successivamente, la tecnica è stata applicata ai fibroblasti dermici umani ^1,2. Studi successivi hanno generato con successo iPSCs da varie fonti, come ad esempio urina ^4, il sangue ^5,6, i cheratinociti ^7, e diversi altri tipi di cellule. Tuttavia, ci sono alcune cellule somatiche che non sono stati utilizzati nella riprogrammazione, e lo screening delle capacità riprogrammazione dei vari tipi di cellule provenienti da tessuti specifici in stato di malattia, è ancora necessaria.

L'artrite reumatoide (AR) è una malattia che può colpire tutte le articolazioni e portare a condizioni autoimmuni in altri organi. RA colpisce circa l'1% degli adulti nel mondo sviluppato. Si tratta di una malattia piuttosto comune e la sua incidenza aumenta ogni anno ^8. Tuttavia, RA è difficile da individuare nelle fasi iniziali e oncebone distruzione si verifica non esiste alcun trattamento in grado di recuperare il danno. Inoltre, l'efficacia dei farmaci differisce da paziente a paziente, ed è difficile prevedere il medicoine che è richiesto. Pertanto, è necessario lo sviluppo di un metodo di screening droga, ed è richiesto un materiale cella che può riflettere le condizioni di RA.

Sinoviociti fibroblasto-simili (FLSS) sono un partecipante cellulare attivo nella patogenesi di RA ^9,10. FLSS esiste nel rivestimento intimale sinoviale tra la capsula articolare e la cavità, che viene indicato anche come sinovia. Sostenendo la struttura comune e fornendo nutrienti alla cartilagine circostante, FLSS di solito giocano un ruolo cruciale nella funzione e la manutenzione delle articolazioni. Tuttavia, FLSS in AR hanno un fenotipo invasivo. RA FLSS hanno un fenotipo cancro-come, eventualmente distruggendo l'osso circostante dalla proliferazione infinita ^10. Con questa caratteristica unica, FLSS può essere utilizzato come materiale promettente che può riflettere la pathobiology di RA. Eppure, queste cellule sono raramente prodotte, ei fenotipi cellulari alterano le cellule passano attraverso diversi passaggi in vitro condizioni. Pertanto, può essere complicato da usare RA FLSS come uno strumento che può rappresentare la condizione del paziente.

Teoricamente, RA iPSCs paziente-derivati ​​(RA-iPSCs) possono diventare uno strumento ideale per lo screening di farmaci e ulteriori ricerche. IPSCs generati hanno la capacità di auto-rinnovamento e possono essere mantenuti e ampliati in vitro. Con pluripotenza, queste cellule possono essere differenziate in maturi condrociti e osteociti lignaggi, che possono contribuire materiale cellulare per la ricerca specifica in AR e altre malattie delle ossa legate ^11.

In questo studio, abbiamo dimostrato come isolare ed espandere FLSS da una sinovia rimosso chirurgicamente, e come generare RA-iPSCs da FLSS utilizzando lentivirus contenenti fattori di Yamanaka.

Protocollo

Etica Dichiarazione: Questo protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università Cattolica di Corea (KC12TISI0861).

1. Isolamento sinoviociti ed espansione

1. Isolamento sinoviociti
   1. Sterilizzare due paia di forbici chirurgiche e un paio di pinze.
   2. Trasferire il tessuto sinoviale ad un piatto 100 mm e lavare con 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 1% di penicillina / streptomicina.
   3. Tagliare i residui di tessuto grasso e ossa giallastre. Trasferire il tessuto tagliato per un pozzo di un 6-pozzetti e aggiungere 5 ml di terreno di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) con il 20% di siero fetale bovino (FBS).
   4. Tagliare i tessuti con le forbici finché i pezzi sono abbastanza piccole da penetrare in una pipetta monouso.
   5. Trasferire il supporto tissutale contenente in una provetta conica da 50 ml. Raccogliere il materiale rimanente aggiungendo 5 ml di DMEM con 20% FBS a 6 pozzetti e poi trasferire al tubo.
   6. collagenasi disgelo sul ghiaccio. Aggiungere collagenasi ad una concentrazione finale di 0,01% e sigillare il tubo con parafilm. Incubare a bagnomaria a 37 ° C con agitazione per 4 ore.
   7. Dopo l'incubazione, riempire il tubo con DMEM con 20% FBS, finché il volume totale è 50 ml e centrifugare a 300 xg, RT per 10 min.
   8. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e aggiungere 40 ml di media per risospendere il pellet.
   9. Ripetere i passaggi 1.1.10-1.1.11.
   10. Risospendere il pellet in 25 ml di DMEM con 20% FBS e aspettare che i grandi ciuffi di tessuto a depositarsi sul fondo.
   11. Trasferire il supernatante in un piatto 100 mm e incubare a 37 ° C in 5% CO ₂ per 14 giorni.
2. Sinoviociti mantenimento e l'espansione
   1. Eliminare i supporti utilizzati dalla piastra e lavare le cellule con 5 ml di PBS.
   2. Aggiungere 1 ml di PBS / 1 mM EDTA e incubare a 37 ° C in 5% CO ₂ per 2 min.
   3. Toccare il piatto delicatamente e transfer le cellule in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare le cellule a 250 xg, RT per 2 min.
   4. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet in 30 ml di DMEM con 20% FBS.
   5. Trasferire le cellule a 3 x 100 mm piatti, senza lasciare alcun materiale residuo visibile.
   6. Sostituire il supporto con mezzi freschi ogni 3 d. Dividere le cellule a 80% di confluenza con 1 ml di PBS / 1 mM EDTA. Mantenere fino a passaggio 3 prima dell'uso. Dividere ogni piatto di cellule in 3 piatti in ogni frazione.
      NOTA: Dopo aver raggiunto il passaggio 3, cellule che non stanno per essere utilizzato immediatamente possono essere congelati.

2. Riprogrammazione FLSS Utilizzando Lentivirus-codificano fattori di Yamanaka

1. Trasduzione (D0)
   1. Seed 3 × 10 ⁴ cellule per pozzetto di un 6-pozzetti in terreni di crescita (500 ml di DMEM supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina). Incubare le cellule O / N a 37 ° C in 5% CO2.
   2. Il giorno seguente, togliere un flaconcino di lentivirus contenente 4 Yamanaka fattori: Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc dal freezer e scongelare a 4 ° C. Nota: Lentivirus è stato prodotto mediante il procedimento descritto nel precedente studio ^11.
   3. Mentre lo scongelamento il virus, cambiare i mezzi di comunicazione a supporto della crescita FLS (20% FBS più antibiotici in DMEM) contenente 10 mg / ml di bromuro hexadimethrine e acido ascorbico 50 mg / ml.
   4. Dopo aver cambiato i media, aggiungere 30 ml di lentivirus alle cellule e mescolare delicatamente. Per migliorare l'infezione, centrifugare la piastra a 680 xg, 35 ° C per 30 min.
   5. Dopo centrifugazione, incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO _2.
2. Manutenzione fino riprogrammazione è visibile
   1. Per 3 giorni, sostituire il supporto giornaliero con i media la crescita FLS contenente 0,1 mm butirrato di sodio e acido ascorbico 50 mg / ml.
   2. Il giorno successivo, sostituire il supporto con una miscela di mezzi di crescita FLS esupporti COPSI (rapporto 1: 1) contenente 0,1 mM di butirrato di sodio e acido ascorbico 50 mg / ml.
      Nota: I componenti del supporto IPSC è dato nella lista materiali / attrezzature.
3. Dividere le celle di Colony Formazione
   1. Preparare un 6-pozzetti vitronectina rivestite.
      1. Aggiungere 60 ml vitronectina a 6 ml di PBS senza Ca ²⁺ e Mg ^2+. Mettere 2 ml di miscela in ciascun pozzetto ed incubare a RT per almeno 1 ora. Nota: La concentrazione di lavoro del vitronectina è di 5 mg / ml.
   2. In D5, lavare le cellule con PBS.
   3. Aggiungere 1 ml di PBS / 1 mM EDTA per staccare le cellule e incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ per 2 min.
   4. Raccogliere le cellule e centrifugare a 250 xg, RT per 2 min.
   5. Dividere le celle a 3 diversi rapporti (1: 3, 1: 6 e 1: 9) per ottenere diversi confluencies. Aggiungere 900 ml di media per il pellet e risospendere. Aggiungere 300, 150, e 100 microlitri della miscela di cellule per pozzetto di una 6-pozzetti per ottenere un rapporto di 1: 3, 1: 6 e 1: 9, rispettivamente.
   6. Sostituire il supporto giornaliero con i media IPSC fino all'apparizione di colonie. Le colonie vengono visualizzati dopo circa D18. Nota: In questa fase, le colonie IPSC coesistere con il FLSS non riprogrammato.
4. Colony raccolta
   1. Preparare una piastra vitronectin rivestita 48 pozzetti aggiungendo 500 microlitri vitronectin ai pozzetti e incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
   2. Posizionare il microscopio su una panchina pulita, e rimuovere la piastra da 6 pozzetti dal termostato.
   3. Rimuovere la soluzione vitronectin dalla piastra 48 pozzetti e aggiungere 500 microlitri mezzi IPSC integrato con 10mM Rho-associata, coiled-coil contenente proteina chinasi (ROCK) inibitore.
   4. Utilizzando una punta 10p pipetta, tagliare intorno alla colonia. Trasferire la colonia scelto per un pozzetto della piastra a 48 pozzetti.
   5. Dopo la raccolta diverse colonie, incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO _2.
   6. Mantenere le cellule fino a quando le colonie sono grandi enough per il trasferimento. Nota: Noi di solito rovesciato le cellule quando la colonia esce dal campo visibile del microscopio, se visti a ingrandimento 100X.

3. immunofluorescenza colorazione

1. Preparazione delle cellule
   1. Posizionare un vetro di copertura sterile, 18 millimetri in un 12-pozzetti.
   2. Aggiungere 1 ml di PBS raffreddare e risciacquare il vetro di copertura.
   3. Sostituire con 1 ml di una soluzione 10 mg / ml vitronectina.
   4. Incubare la piastra a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
   5. Scartare la soluzione vitronectina e iPSCs piastra in 12 pozzetti vitronectina rivestite e cultura per 7 giorni a 37 ° C, 5% di CO _2, cambiando i media giornaliera.
2. La colorazione delle cellule
   1. Eliminare il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS una volta.
   2. Fissare le cellule in 0,4% paraformaldeide (PFA) per 30 minuti a RT.
   3. Permeabilize le cellule con 0,1% Triton X-100 per 5 minuti a temperatura ambiente.
   4. Rimuovere la permeabilizzazionesoluzione e blocco con PBS contenente 2% di albumina di siero bovino (BSA) per 30 minuti a RT.
   5. Diluire gli anticorpi in PBS contenente 2% BSA in base alla tabella 1. Incubare le cellule con gli anticorpi primari per 2 ore a temperatura ambiente.
   6. Aggiungere l'anticorpo secondario (diluito 1: 200) e incubare le cellule per 1 ora a RT, evitando la luce.
   7. Trattare le cellule con 1 ml / ml DAPI per 10 min.
   8. Posizionare il vetro coperchio sulla parte superiore del vetrino con antifade reagente e incubare a temperatura ambiente per 24 ore, evitando la luce.
   9. Verifica un'espressione con un microscopio a fluorescenza.

4. in tempo reale Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

1. Estrarre mRNA dal pellet cellulare utilizzando il guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio metodo di estrazione ^11.
2. Amplificare cDNA da 2 mg di mRNA totale utilizzando la trascrizione inversa ^11.
3. Miscelare i componenti necessari per la PCR usando 2 ml di cDNA TEMpiatto ^11.
4. Eseguire la RT-PCR e verificare i risultati di elettroforesi su gel ^11.

5. fosfatasi alcalina (AP) La colorazione

1. IPSCs di coltura per 5-7 giorni a 37 ° C, 5% di CO ₂ prima della colorazione.
2. Aspirare media e fissare le cellule con 4% PFA per 1 min.
3. Eliminare il fissativo e lavare le cellule con tampone di lavaggio 1X.
4. Preparare i reagenti per AP colorazione. Mescolare i reagenti nelle seguenti proporzioni: Fast Red Violet: soluzione di fosfato naftolo AS-BI: acqua = 2: 1: 1.
5. Incubare le cellule con la soluzione colorante a temperatura ambiente per 15 min, evitando la luce.
6. Eliminare la soluzione colorante e lavare le cellule con tampone di risciacquo.
7. Coprire le cellule con PBS per prevenire l'essiccazione e verificare espressione utilizzando un microscopio campo chiaro.

Risultati

In questo studio, descriviamo un protocollo per generare iPSCs da FLSS utilizzando un sistema lentivirale. La figura 1A mostra un semplice schema del protocollo di isolamento FLS. Dopo la rimozione chirurgica della membrana sinoviale, il tessuto è stato tagliato in piccoli pezzi con le forbici chirurgiche. Collagenasi inserito isolare le cellule dai ciuffi di tessuto. Le cellule sono state incubate per 14 giorni prima di ulteriori trasformazioni. Figura ...

Discussione

Prima della scoperta di iPSCs, gli scienziati hanno utilizzato principalmente CES per studiare la biologia delle cellule staminali e di altre linee cellulari attraverso la differenziazione. Tuttavia, CES provengono dalla massa interna della blastocisti, che è un embrione in fase iniziale. Per isolare CES, la distruzione della blastocisti è inevitabile, sollevando questioni etiche che sono impossibili da superare. Inoltre, anche se i CES hanno caratteristiche di staminalità e pluripotenza, non possono essere ottenuti da ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra da 100 mm	TPP	93100
Piastra a 6 pozzetti	TPP	92006
Provetta cornica da 50 ml	SPL	50050
Provetta cornica da 15 ml	SPL	50015
Pipetta monouso da 10 ml	Falcon	7551
Pipetta monouso da 5 ml	Falcon	7543
Piastra a 12 pozzetti	TPP	92012
FLS Materiali di isolamento
Forbici
Pinza
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilina Streptomicina	Sigma Aldrich	P4333
Siero fetale bovino (FBS)	Life Technologies	16000-044
Collagenasi	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoetanolo	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilina Streptomicina	Life Technologies	P4333
Siero fetale bovino (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 ml)
Bicarbonato di sodio	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μ g/ml)
Selenito di sodio	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingrediente  (Conc.: 14 ng/mL)
Integratore multimediale per transfferina	umana Sigma Aldrich	T3705	iPSC (Conc.: 10.7 μ g/ml)
Ingrediente base del terreno FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC  (Conc.: 100 ng/ml)
Insulina umana	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingrediente (Conc.: 20 μ g/ml)
TGF umanoβ 1	Peprotech	100-21	iPSC (Conc.: 2 ng/ml)
Acido ascorbico	Sigma Aldrich	A8960	iPSC ingrediente del terreno (Conc.: 64 μ g/ml)
Polibrene	Chemicon	TR-1003
Butirrato di sodio	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
Inibitore ROCK	Sigma	Aldrich Y0503
Controllo della qualità Materiali
18 mm Vetro di copertura	superiore	HSU-0111580
4% Paraformaldiide (PFA)	Tech & Innovazione	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Albumina sierica bovina (BSA)	Vector Lab	SP-5050
Anticorpo anti-SSEA4	Millipore	MAB4304
Anticorpo anti-Oct4	Santa Cruz	SC9081
Anticorpo anti-TRA-1-60	Millipore	MAB4360
Anticorpo anti-Sox2	Biolegend	630801
Anticorpo anti-TRA-1-81	Millipore	MAB4381
Anticorpo anti-Klf4 Abcam		ab151733
Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H+L) anticorpo	Sonda molecolare	A11029
Alexa Fluor 594 capra anti-coniglio IgG (H+L) anticorpo	Sonda molecolare	A11037
Sonda molecolare	DAPI	D1306
Reagente antisbiadimento in oro prolungato	Invitrogen	P36934
Vetrino, rivestito	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Cloroformio	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Etanolo	Duksan	64-17-5
RevertAid Kit di sintesi del cDNA del primo filamento	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polimerasi	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
stella di carico	Dyne Bio	A750
Agarosio	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) marcatore a scala del DNA	Enzimiche	DM003
Fosfatasi alcalina	Millipore	SCR004