Screening per Funzionale non codificante Varianti genetiche Utilizzando Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) e DNA-affinità precipitazioni Assay (DAPA)

Summary

Presentiamo un piano strategico e un protocollo per identificare le varianti genetiche non codificanti che influenzano il legame del DNA con il fattore di trascrizione (TF). Viene fornito un protocollo sperimentale dettagliato per il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) e il saggio di precipitazione di affinità del DNA (DAPA) del legame del DNA TF genotipo-dipendente.

Abstract

Gli studi genetici basati sulla popolazione e sulla famiglia in genere portano all'identificazione di varianti genetiche che sono statisticamente associate a una malattia clinica o a un fenotipo. Per molte malattie e tratti, la maggior parte delle varianti non sono codificanti e quindi è probabile che agiscano influenzando meccanismi sottili e relativamente difficili da prevedere che controllano l'espressione genica. In questo articolo, descriviamo un approccio strategico generale per dare priorità alle varianti non codificanti e selezionarle per la loro funzione. Questo approccio prevede la prioritizzazione computazionale utilizzando database genomici funzionali seguita da un'analisi sperimentale del legame differenziale dei fattori di trascrizione (TF) agli alleli di rischio e non di rischio. Sia per il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) che per il saggio di precipitazione di affinità del DNA (DAPA) delle varianti genetiche, viene utilizzato un oligonucleotide di DNA sintetico (oligo) per identificare i fattori nel lisato nucleare della malattia o delle cellule rilevanti per il fenotipo. Per l'EMSA, gli oligonucleotidi con o senza fattori nucleari legati (spesso TF) vengono analizzati mediante elettroforesi non denaturante su un gel di poliacrilammide tris-borato-EDTA (TBE). Per il DAPA, gli oligonucleotidi sono legati a una colonna magnetica e i fattori nucleari che legano specificamente la sequenza di DNA vengono eluiti e analizzati attraverso spettrometria di massa o con un'elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato riducente (SDS-PAGE) seguita da analisi Western blot. Questo approccio generale può essere ampiamente utilizzato per studiare la funzione di varianti genetiche non codificanti associate a qualsiasi malattia, tratto o fenotipo.

Introduction

Sequencing e studi di genotipizzazione basato, compresi gli studi Genome-Wide Association (GWAS), studi locus candidato, e profondo-sequenziamento studi, hanno identificato molte varianti genetiche che sono statisticamente associati con una malattia, caratteristica, o fenotipo. Contrariamente alle previsioni iniziali, la maggior parte di queste varianti (85-93%) si trovano in regioni non codificanti e non cambiano la sequenza di amminoacidi delle proteine ^​​1,2. Interpretando la funzione di queste varianti non codificanti e determinare i meccanismi biologici che li collegano alla malattia associata, tratto, o fenotipo è dimostrato impegnativo ^3-6.

Protocol

1. preparazione di soluzioni e reagenti

1. Ordinare sonde oligonucleotidiche DNA personalizzati per l'utilizzo in EMSA e DAPA.
   1. Per ridurre la proteina non specifica vincolante, progettare oligos brevi (tra i 35-45 coppie di basi (bp) di lunghezza) ^30, e inserire la variante di interesse direttamente al centro affiancato da suo 17 bp endogena sequenza genomica. Per oligo EMSA, aggiungere un 'fluoroforo 5. Per oligo DAPA, aggiungere un tag 5 'biotina.
   2. Ordinare sia il filamento senso e il suo filone complemento inverso. In alternativa, l'ordine duplex (pre-ricotto) oligonucleotidi. Quando si nomina la oligo, basare l....

Results

In questa sezione, i risultati rappresentativi di cosa aspettarsi sono forniti durante l'esecuzione di un EMSA o DAPA, e la variabilità per quanto riguarda la qualità del lisato è caratterizzata. Ad esempio, è stato suggerito che il congelamento e scongelamento campioni proteici più volte può causare denaturazione. Al fine di esplorare la riproducibilità delle analisi EMSA nel contesto di questi cicli "gelo-disgelo", due 35 oligo bp diverse in una sola variante genetica sono stati incuba.......

Discussion

Nonostante i progressi nelle tecnologie di sequenziamento e genotipizzazione hanno notevolmente migliorato la nostra capacità di individuare le varianti genetiche associate alla malattia, la nostra capacità di comprendere i meccanismi funzionali colpite da queste varianti è in ritardo. Una fonte importante del problema è che molte varianti associate alla malattia sono situati in n on-regioni codificanti del genoma, che probabilmente incidere più difficile da prevedere meccanismi che controllano l'espressione g.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotidi DNA personalizzati	Tecnologie		http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
cloruro di potassio	Fisher Scientific	BP366-500	KCl, per tampone CE
HEPES (1 M)	Fisher Scientific	15630-080	per tampone CE e NE
EDTA (0,5 M), pH 8.0	Life Technologies	R1021	Per tampone CE, NE e ricottura
Cloruro di sodio	Fisher Scientific	BP358-1	NaCl, per tampone NE
Tris-HCl (1M), pH 8,0	Invitrogen	BP1756-100	Per tampone di ricottura
Soluzione salina tamponata con fosfato (1x)	Fisher Scientific	MT21040CM	PBS, per lavaggio cellulare
Soluzione di DL-ditiotreitolo (1 M)	Sigma	646563	Agente riducente
Inibitore della proteasi Cocktail	Thermo Scientific	87786	Previene il catabolismo dei TF
Inibitore della fosfatasi Cocktail	Thermo Scientific	78420	Previene la defosforilazione dei TF
Sostituto Nonidet P-40	IBI Scientific	IB01140	NP-40, per estrazione nucleare
Kit per il dosaggio delle proteine BCA	Thermo Scientific	23225	Per misurare la concentrazione di proteine
Kit tampone EMSA Odyssey	Licor	829-07910	Contiene tutti i tamponi EMSA necessari
Gel TBE, 6%, 12 pozzetti	Invitrogen	EC6265BOX	per EMSA
TBE Buffer (10x)	Thermo Scientific	B52	per EMSA
FactorFinder Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-092-318	Contiene tutti i tamponi DAPA necessari Licor
Odyssey CLx	Licor		Scanner consigliato per DAPA/EMSA
Antibiotico-Antimicotico	Gibco	15240-062	Contiene 10.000 unità/ml di penicillina, 10.000 µ g/ml di streptomicina e 25 µ g/ml di Fungizone®
Siero fetale bovino	Gibco	26140-079	FBS, per terreni di coltura
RPMI 1640 Medium	Gibco	22400-071	Contiene L-glutammina e 25 mM HEPES