Method Article

Screening per Funzionale non codificante Varianti genetiche Utilizzando Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) e DNA-affinità precipitazioni Assay (DAPA)

DOI:

10.3791/54093

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Autoimmune Genomics and Etiology, Cincinnati Children's Hospital, 2Medical Scientist Training Program, University of Cincinnati, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati, 4Divisions of Biomedical Informatics and Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un piano strategico e un protocollo per identificare le varianti genetiche non codificanti che influenzano il legame del DNA con il fattore di trascrizione (TF). Viene fornito un protocollo sperimentale dettagliato per il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) e il saggio di precipitazione di affinità del DNA (DAPA) del legame del DNA TF genotipo-dipendente.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli studi genetici basati sulla popolazione e sulla famiglia in genere portano all'identificazione di varianti genetiche che sono statisticamente associate a una malattia clinica o a un fenotipo. Per molte malattie e tratti, la maggior parte delle varianti non sono codificanti e quindi è probabile che agiscano influenzando meccanismi sottili e relativamente difficili da prevedere che controllano l'espressione genica. In questo articolo, descriviamo un approccio strategico generale per dare priorità alle varianti non codificanti e selezionarle per la loro funzione. Questo approccio prevede la prioritizzazione computazionale utilizzando database genomici funzionali seguita da un'analisi sperimentale del legame differenziale dei fattori di trascrizione (TF) agli alleli di rischio e non di rischio. Sia per il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) che per il saggio di precipitazione di affinità del DNA (DAPA) delle varianti genetiche, viene utilizzato un oligonucleotide di DNA sintetico (oligo) per identificare i fattori nel lisato nucleare della malattia o delle cellule rilevanti per il fenotipo. Per l'EMSA, gli oligonucleotidi con o senza fattori nucleari legati (spesso TF) vengono analizzati mediante elettroforesi non denaturante su un gel di poliacrilammide tris-borato-EDTA (TBE). Per il DAPA, gli oligonucleotidi sono legati a una colonna magnetica e i fattori nucleari che legano specificamente la sequenza di DNA vengono eluiti e analizzati attraverso spettrometria di massa o con un'elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato riducente (SDS-PAGE) seguita da analisi Western blot. Questo approccio generale può essere ampiamente utilizzato per studiare la funzione di varianti genetiche non codificanti associate a qualsiasi malattia, tratto o fenotipo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sequencing e studi di genotipizzazione basato, compresi gli studi Genome-Wide Association (GWAS), studi locus candidato, e profondo-sequenziamento studi, hanno identificato molte varianti genetiche che sono statisticamente associati con una malattia, caratteristica, o fenotipo. Contrariamente alle previsioni iniziali, la maggior parte di queste varianti (85-93%) si trovano in regioni non codificanti e non cambiano la sequenza di amminoacidi delle proteine ​​1,2. Interpretando la funzione di queste varianti non codificanti e determinare i meccanismi biologici che li collegano alla malattia associata, tratto, o fenotipo è dimostrato impegnativo 3-6. Abbiamo sviluppato una strategia generale di identificare i meccanismi molecolari che collegano le varianti di un importante fenotipo intermedio - l'espressione genica. Questo gasdotto è specificamente progettato per identificare la modulazione di legare da varianti genetiche TF. Questa strategia combina approcci computazionali e tecniche di biologia molecolare finalizzate a prevedereeffetti biologici delle varianti candidati in silico e verificare empiricamente queste previsioni (Figura 1).

figure-introduction-1
Figura 1:.. Approccio strategico per l'analisi dei passaggi non codificanti varianti genetiche che non sono inclusi nel protocollo dettagliato associato a questo manoscritto sono di colore grigio Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

In molti casi, è importante iniziare ampliare l'elenco delle varianti di includere tutti quelli in alta linkage disequilibrium (LD) con ciascuna variante statisticamente associato. LD è una misura di associazione non casuale di alleli in due differenti posizioni cromosomiche, che può essere misurata dal r 2 statistica 7. r 2 è una misura del linKage squilibrio fra due varianti, con una R 2 = 1 denota perfetto collegamento tra due varianti. Alleli in alta LD si trovano a co-separare sul cromosoma attraverso popolazioni ancestrali. array di genotipizzazione attuali non includono tutte le varianti conosciute nel genoma umano. Invece, sfruttano il LD all'interno del genoma umano e comprendono un sottoinsieme delle varianti note che agiscono come proxy per altre varianti di una particolare regione del LD 8. Così, una variante senza alcuna conseguenza biologica può essere associato ad una particolare malattia perché è in LD con causale variant-variante con un effetto biologico significativo. Procedurale, si consiglia di convertire l'ultima versione dei 1.000 genomi Project 9 file di chiamata variante (VCF) in file binari compatibili con PLINK 10,11, uno strumento open-source per l'intera analisi di associazione genoma. In seguito, tutte le altre varianti genetiche con LD r 2> 0.8 con ogni ingresso va geneticariant può essere identificato come candidati. E 'importante usare la popolazione di riferimento appropriato per questo passo- esempio, se una variante è stato identificato nei soggetti di origine europea, i dati provenienti da soggetti di origini simili dovrebbero essere utilizzati per l'espansione LD.

espansione LD si traduce spesso in decine di varianti candidati, ed è probabile che solo una piccola frazione di queste contribuiscono alla malattia meccanismo. Spesso, è praticamente impossibile esaminare sperimentalmente ciascuna di queste varianti singolarmente. E 'quindi utile per sfruttare le migliaia di pubblicamente disponibili i set di dati di genomica funzionale come filtro per dare priorità alle varianti. Ad esempio, il consorzio ENCODE 12 ha eseguito migliaia di esperimenti di ChIP-Seq che descrivono il legame del TF e co-fattori, e segni istoni in una vasta gamma di contesti, insieme ai dati della cromatina di accessibilità da tecnologie come DNasi-ss 13, ATAC -seq 14, e FAIRE-ss 15. databAsi e server web, come il browser UCSC Genome 16, tabella di marcia Epigenomics 17, Blueprint Epigenome 18, Cistrome 19, e Remap 20 fornire libero accesso ai dati prodotti da questi e altre tecniche sperimentali in una vasta gamma di tipi e condizioni di cellule. Quando ci sono troppe varianti per esaminare sperimentalmente, questi dati possono essere utilizzati per dare la priorità quelli situati all'interno probabili regioni regolatorie in materia tipi di cellule e tessuti. Inoltre, nei casi in cui una variante è all'interno di un picco ChIP-seq per una proteina specifica, questi dati possono fornire cavi potenziali per il TF specifico (s) o cofattori cui legame potrebbe essere che interessano.

Successivamente, le varianti risultanti priorità sono proiettati sperimentale per validare proteina genotipo-dipendente predetto legame con EMSA 21,22. EMSA misura la variazione della migrazione del oligo su un gel TBE non riducente. oligo fluorescente è incubato con illisato nucleare e legame di fattori nucleari ritardare il movimento del oligo sul gel. In questo modo, oligo che ha legato più fattori nucleari presenterà come un segnale fluorescente forte alla scansione. In particolare, l'EMSA non richiede previsioni circa le proteine ​​specifiche il cui legame saranno interessati.

Una volta che le varianti sono identificati che si trovano all'interno di regioni regolatorie previsti e sono in grado di fattori nucleari differenziale vincolanti, metodi computazionali sono impiegati per predire il TF specifico (s), il cui legame che potrebbero influenzare. Noi preferiamo usare CIS-BP 23,24, RegulomeDB 25, UNIProbe 26, e JASPAR 27. Una volta che il candidato TF sono identificate, queste previsioni possono essere specificamente testati utilizzando anticorpi contro questi TF (EMSA-supershifts e DAPA-western). Un EMSA-supershift comporta l'aggiunta di un anticorpo specifico TF al lisato nucleare e oligo. Un risultato positivo in un EMSA-supershift è represented come un ulteriore spostamento nella banda EMSA, o una perdita di banda (valutata in riferimento 28). Nel DAPA complementare, un duplex oligo 5'-biotinilato contenente la variante e il 20 paia di basi di accompagnamento nucleotidi sono incubati con lisato nucleare dal tipo di cellula in questione (s) per catturare eventuali fattori nucleari legame specifico gli oligonucleotidi. Il complesso fattore duplex-nucleare oligo è immobilizzato dalla streptavidina microsfere in una colonna magnetica. I fattori nucleari legati vengono raccolti direttamente tramite eluizione 29,48. previsioni vincolanti possono poi essere valutati da un Western blot utilizzando anticorpi specifici per la proteina. Nei casi in cui non ci sono previsioni evidenti, o anche molte previsioni, i eluizioni dalla variante di pull-down degli esperimenti DAPA possono essere inviati a un nucleo di proteomica per identificare TF candidati mediante spettrometria di massa, che possono in seguito essere convalidati utilizzando questi precedentemente descritte metodi.

Nel resto della articlE, viene fornito il protocollo dettagliato per EMSA e DAPA analisi delle varianti genetiche.

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Protocol

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1. preparazione di soluzioni e reagenti

  1. Ordinare sonde oligonucleotidiche DNA personalizzati per l'utilizzo in EMSA e DAPA.
    1. Per ridurre la proteina non specifica vincolante, progettare oligos brevi (tra i 35-45 coppie di basi (bp) di lunghezza) 30, e inserire la variante di interesse direttamente al centro affiancato da suo 17 bp endogena sequenza genomica. Per oligo EMSA, aggiungere un 'fluoroforo 5. Per oligo DAPA, aggiungere un tag 5 'biotina.
    2. Ordinare sia il filamento senso e il suo filone complemento inverso. In alternativa, l'ordine duplex (pre-ricotto) oligonucleotidi. Quando si nomina la oligo, basare la nomenclatura su un genoma di riferimento stabilito.
      Nota: "Rischio" e la designazione "non a rischio" può essere la malattia e specifico progetto, mentre "di riferimento" e "non-reference" sono più universalmente rilevanti.
    3. All'arrivo degli oligonucleotidi, far girare brevemente verso il basso i contenuti e risospendere in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione finale di 100 μ; M. Conservare risospeso magazzino a -20 ° C. Proteggere oligo contrassegnati con un fluoroforo dalla luce avvolgendo con un foglio di alluminio.
Nome Sequenza
rs76562819_REF_FOR GTAATGCCTTAATGAGAGAG A GTTAGTCATCTTCTCACTTC
rs76562819_REF_REV GAAGTGAGAAGATGACTAAC T CTCTCTCATTAAGGCATTAC
rs76562819_NONREF_FOR GTAATGCCTTAATGAGAGAG G GTTAGTCATCTTCTCACTTC
rs76562819_NONREF_REV GAAGTGAGAAGATGACTAAC C CTCTCTCATTAAGGCATTAC

Tabella 1: disegno oligonucleotide Esempio EMSA / DAPA per testare un SNP per bin differenzialeding. "REF" sta per l'allele di riferimento, mentre "nonref" sta per l'allele non di riferimento. "PER" sta per il filo in avanti, mentre "REV" indica il suo complemento. Il SNP è visto in rosso.

  1. Preparare estrazione citoplasmatica (CE) tampone con una concentrazione finale di 10 mM HEPES (pH 7,9), 10 mM KCl, e 0,1 mM EDTA in acqua deionizzata.
  2. Preparare estrazione nucleare (NE) tampone con una concentrazione finale di 20 mM HEPES (pH 7,9), 0,4 M NaCl, e 1 mM EDTA in acqua deionizzata.
  3. Preparare tampone di ricottura con una concentrazione finale di 10 mM Tris (pH 7.5-8.0), 50 mM NaCl, e 1 mM EDTA in acqua deionizzata.

2. Preparazione di lisato nucleare da cellule in coltura

Nota: Questo protocollo sperimentale è stato ottimizzato utilizzando linee cellulari B-linfoblastoidi, ma è stato testato in diverse altre linee di cellule aderenti / sospensioni indipendenti e lavora universalmente.

  1. culturi cellule B-linfoblastoidi a Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 2 mM L-glutammina, siero fetale bovino 10%, e 1x antibiotico-antimicotico contenente 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 250 ng / ml di amfotericina B.
    1. Seed ad una gamma di 200,000-500,000 vitali cellule / ml e incubare beute a 37 ° C con 5% di anidride carbonica in posizione verticale con tappi ventilati o allentati.
      Nota: La crescita delle cellule B-linfoblastoidi rallenta quando raggiungono oltre 1.000.000 cellule / ml. Break up esplosioni delle cellule pipettando su e giù parecchie volte e tornare alle cellule di 200,000-500,000 cellule / ml a mantenere un rapido tasso di crescita.
  2. Lavare le cellule in coltura due volte con 10 ml di ghiaccio freddo fosfato salina tamponata (PBS), centrifugare a 4 ° C, 300 xg per 5 min e rimuovere PBS tramite aspirazione.
  3. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e risospendere pellet in 1 ml di PBS freddo ghiaccio per 10 7 cellule.
    Nota: Ad esempio, se lisi 2 x 10 7 </ Sup> celle, risospendere in 2 ml di PBS.
  4. Aliquota 1 ml a 1,5 ml provette da microcentrifuga in modo tale che ogni tubo contiene 10 7 cellule in PBS. Centrifugare a 3.300 xg per 2 minuti a 4 ° C e aspirare fuori PBS.
  5. Prima dell'uso, aggiungere 1 mM ditiotreitolo (DTT), inibitore della fosfatasi 1x, e l'inibitore della proteasi 1x a un ceppo di lavoro di tampone CE. Risospendere pellet con 400 microlitri di tampone CE e incubare su ghiaccio per 15 minuti.
  6. Aggiungere 25 ml di 10% Nonidet P-40 e mescolare pipettando. Centrifugare a 4 ° C, velocità massima per 3 min. Decantare e scartare il surnatante.
  7. Prima dell'uso, aggiungere 1 mM DTT, inibitore della fosfatasi 1x e 1x inibitore della proteasi per uno stock di lavoro di tampone NE. Risospendere pellet con 30 ml di buffer di NE e mescolare nel vortex.
  8. Incubare a 4 ° C in un rotore tubo o in ghiaccio per 10 min. Centrifuga 3.300 xg per 2 minuti a 4 ° C.
  9. Raccogliere il surnatante chiaro (lisato nucleare) e un'aliquota prima di riporlo a -806; C per evitare più cicli di gelo-disgelo che possono degradare la proteina. Lascia un aliquota di 10 microlitri per misurare la concentrazione di proteine ​​usando il saggio di acido bichoninic (BCA) 31.

3. elettroforetica Mobility Shift Assay (EMSA)

  1. Preparare lavoro Oligo & Stock EMSA Gel.
    1. Se oligo sono state ordinate in duplex, scongelare il magazzino 100 micron e diluire 1: 2.000 in tampone ricottura per ottenere un titolo di lavoro 50 nm.
    2. Se oligonucleotidi sono state ordinate a singolo filamento, scongelare le scorte 100 micron e diluire 1:10 in tampone di ricottura per ottenere 100 titoli di lavoro nm. Combinare 100 microlitri della soluzione di complemento strand 100 nM con l'altro in una provetta.
      1. Mettere in un blocco di calore a 95 ° C per 5 min. Spegnere il blocco di calore e permettono oligonucleotidi raffreddare lentamente fino a temperatura ambiente per almeno un'ora prima dell'uso.
    3. Pre-eseguire il Gel EMSA.
      1. Rimuovere il vetrino da un pre-fusione 6% TBE gel e sciacquati con acqua deionizzata parecchie volte per rimuovere qualsiasi tampone dai pozzetti. Preparare 1 L di tampone 0,5x TBE con l'aggiunta di 50 ml di 10x TBE a 950 ml di acqua deionizzata.
      2. Montare l'apparecchiatura elettroforesi su gel e verificare eventuali perdite riempiendo la camera interna con tampone TBE 0.5x. Se il tampone non fuoriesce nella camera esterna, riempire la camera esterna circa due terzi della strada.
      3. Pre-eseguire il gel a 100 V per 60 min.
      4. Lavare ogni pozzetto con 200 ml di tampone 0,5x TBE.
  2. Preparare Binding Buffer Master Mix.
    1. Preparare 10x tampone di legame con una concentrazione finale di 100 mM Tris, 500 mM KCl, 10 mM DTT; pH 7,5 in acqua deionizzata.
    2. In una provetta, creare un master mix costituito dai reagenti comuni a tutte le reazioni (10 microlitri 10x tampone legante, 10 microlitri DTT / polisorbato, 5 microlitri Poly d (IC), e 2,5 ml di DNA di sperma di salmone; Tabella 2). Preparare un ulteriore 10%per tenere conto di perdita di volume a causa di pipettaggio.
Reagente Conc finale. RXN 1 # RXN 2 # RXN 3 # RXN 4 #
acqua ultrapura a 20 microlitri vol. 13,5 ml 11.98 ml 13.5μl 11.98 ml
10x Binding Buffer 1x 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
DTT / TW-20 1x 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
DNA sperma di salmone 500 ng / ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
1 ug / ml poli d (IC) 1 mcg 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Estratto nucleare (5,26 ug / ml) 8 mcg - 1,52 ml - 1,52 ml
NE Buffer 1,52 ml - 1,52 ml -
Riferimento allele oligo 50 fmol 1 ml 1 ml - -
Non Riferimento allele oligo 50 fmol - - 1 ml 1 ml

Tabella 2: Esempio EMSA reazione Setup. La tabella illustra un esempio EMSA per verificare l'ipotesi che non ci sia il genotipo-dipendente legame di TFS a uno specifico SNP.

  1. Aggiungere acqua priva di nucleasi a ciascuna provetta tale che il volume finale seguente aggiunta di tutti i reagenti sarà di 20 microlitri.
  2. Aggiungere la quantità appropriata (5.5 ml) di master mix per ogni provetta.
  3. Aggiungere 8 mg di lisato nucleare per le provette da microcentrifuga appropriate. Includere provette contenenti il oligo senza estratto nucleare come controlli negativi (ad esempio, tabella 2, Rxn # 1 e # Rxn 3).
    Nota: La quantità ottimale di lisato per reazione deve essere determinato sperimentalmente mediante titolazione. Generalmente, titolando un intervallo di 2-10 mg di lisato è sufficiente.
  4. Aggiungere 50 fmol di oligo ai tubi microcentrifuga appropriate. Flick per mescolare e brevemente girare il contenuto sul fondo della provetta. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
    Nota: Se attempting un supershift, incubare la miscela lisato con l'anticorpo per 20 minuti a temperatura ambiente prima dell'aggiunta di oligo. Si consiglia di utilizzare 1 mg di un anticorpo ChIP-grade per i migliori risultati.
  5. Aggiungere 2 ml di 10x Arancione colorante di caricamento per ogni provetta. Pipetta su e giù per mescolare.
  6. Caricare i campioni nella pre-run gel TBE 6% pipettando su e giù per mescolare e poi espellendo ogni campione in un pozzo separato. Attivare il gel a 80 V fino a quando il colorante arancione è migrata 2/3 a 3/4 fino in fondo il gel. Questo dovrebbe prendere circa 60-75 min.
  7. Rimuovere il gel dalla cassetta di plastica facendo leva con un coltello gel e posizionare il gel in un contenitore con tampone TBE 0,5% per evitare che si secchi.
  8. Porre il gel sulla superficie di un sistema di imaging a infrarossi e chemiluminescenza, avendo cura di eliminare eventuali bolle o contaminanti che disturbare l'immagine.
  9. Utilizzando il software di sistema di scansione, fare clic sulla scheda "Acquisisci"quindi selezionare "Draw Nuovo" per disegnare una casella intorno all'area corrispondente in cui il gel si trova sulla superficie dello scanner.
  10. Nella sezione "canali" della scheda "Acquisisci", selezionare il canale che corrisponde alla lunghezza d'onda del tag fluoroforo sul oligo. Nella sezione "Scanner", fai clic su "Anteprima" per avere un'anteprima di scansione di bassa qualità. Regolare l'area di scansione trascinando il riquadro blu che circonda l'anteprima immagine acquisita verso la porzione del gel da acquisire.
    Nota: Per esempio, se si utilizza oligonucleotidi marcati con un fluoroforo nm 700, assicurarsi che il canale "700 nm" è selezionato prima della scansione.
  11. Nella sezione "Controlli di scansione", selezionare l'opzione di risoluzione "84 micron" e l'opzione di qualità "Medium". Impostare l'attivo a compensare alla metà dello spessore del gel. Nota: Ad esempio, un gel 1 millimetro userebbe un offset fuoco 0,5 mm.
  12. Nella sezione "Scanner", cliccare su "Start" per bEgin la scansione.
    Nota: Durante la scansione, il regime di luminosità, contrasto e colore può essere spesso regolata manualmente a seconda del produttore del sistema di scansione.
  13. Dopo la scansione è terminata, selezionare la scheda "Immagine" e fare clic su "ruotare o capovolgere" nella sezione "Crea" per correggere l'orientamento. Salvare il file immagine facendo clic su "Esporta" nel menu principale, quindi selezionare "Visualizzazione immagine singola".

4. DNA Affinity Purification Assay (DAPA)

  1. Preparazione di 5 micron Oligo funzionamento Stock.
    1. Se oligo sono state ordinate in duplex, scongelare il magazzino 100 micron e diluire 1:20 buffer di ricottura per ottenere un titolo di lavoro 5 micron.
    2. Se oligonucleotidi sono state ordinate a singolo filamento, scongelare le scorte 100 micron e diluire 1:10 in tampone di ricottura per ottenere 10 micron scorte di lavoro. Unire 10 ml di 10 mM filamenti complementari tra loro. Mettere in un blocco di calore a 95 ° C per5 minuti. Spegnere il blocco termico e permettere ai oligonucleotidi raffreddare lentamente fino a temperatura ambiente prima dell'uso.
  2. Prima di iniziare, riscaldare il tampone di legame, basso tampone di lavaggio rigore, tampone di lavaggio ad alta rigore, e tampone di eluizione a temperatura ambiente.
    Nota: Una concentrazione finale di 50 ng / mL Poly d (IC) può essere aggiunto al buffer vincolante, bassa stringenza tampone di lavaggio e tampone di lavaggio di alta stringenza per ridurre il potenziale di legame non specifico di proteine ​​agli oligo.
  3. Preparare le miscele vincolanti per ogni variante.
    1. Mescolare 1 volume di lisato nucleare con 2 volumi di tampone di legame.
      Nota: la quantità necessaria di lisato deve essere determinato in via sperimentale a causa di variazione abbondanza di TF. Usando tra 100-250 ug di lisato nucleare per colonna è sufficiente nella maggior parte dei casi.
    2. Aggiungere inibitore 1x fosfatasi, inibitore della proteasi 1x e 1x enhancer binding (opzionale) e mescolare muovendo il tubo più volte.
      Nota: 100x vincolanteenhancer è costituito da 750 mm MgCl 2 e 300mm ZnCl 2. Aggiungere enhancer binding se il legame di TF di DNA dipende cofattori o agenti riducenti. Se questa informazione non è nota, aggiungere il enhancer binding.
    3. Aggiungere 10 ml di 5 micron DNA cattura biotinilato (50 pmol) per ciascuna rispettiva miscela vincolante. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
      Nota: il tempo di incubazione e la temperatura possono variare a seconda del TF. I valori ottimali devono essere determinati sperimentalmente.
  4. Aggiungere 100 ml di microsfere streptavidina. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  5. Per ogni sonda oligo in fase di test, inserire una colonna vincolante nel separatore magnetico. Mettere una provetta direttamente sotto ogni colonna vincolante e applicare 100 ml di tampone di legame per lavare la colonna.
  6. Pipettare il contenuto di ciascuna miscela vincolante in colonne separate e consentire al liquido di fluire completamente attraverso la colonna in microcentrifugatubo prima di procedere. Assicurarsi di etichettare le colonne con l'oligo variante che è stato utilizzato nella miscela vincolante. Etichettare i campioni a flusso continuo e sostituirli con nuovi tubi microcentrifuga per raccogliere i lavaggi a bassa stringenza.
  7. Applicare 100 ml di bassa severità tampone di lavaggio alla colonna; attendere il serbatoio colonna è vuota. Ripetere il lavaggio 4x. Etichettare i campioni di lavaggio a bassa stringenza e sostituirli con nuovi tubi microcentrifuga per raccogliere i lavaggi ad alta stringenza.
  8. Applicare 100 ml di alta rigore tampone di lavaggio alla colonna; attendere il serbatoio colonna è vuota. Ripetere il lavaggio 4x. Etichettare i campioni di lavaggio ad alta stringenza e sostituirli con nuovi tubi microcentrifuga per raccogliere il pre-eluizione.
  9. Aggiungere 30 ml di tampone di eluizione nativo alla colonna e lasciar riposare per 5 minuti. Etichettare i campioni pre-eluizione e sostituirli con nuovi tubi microcentrifuga per raccogliere l'eluizione.
    Nota: Questo non eluire le proteine; lava il restante alta rigoretampone della colonna e lo sostituisce con tampone di eluizione per massimizzare l'efficienza del eluizione.
  10. Aggiungere un 50 microlitri di buffer aggiuntivo di eluizione nativo per eluire le TF legati. Per un rendimento superiore, ma eluato meno concentrata, aggiungere altri 50 ml di tampone di eluizione nativo e raccogliere il flusso continuo.
    Nota: Analizzare i campioni di eluizione attraverso la spettrometria di massa per determinare l'identità del legato TF 32. In seguito, verificare i risultati di proteomica attraverso sodio dodecil solfito di gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) seguita da una macchia occidentale 33. Se spettrometria di massa non è disponibile, eseguire una macchia d'argento con la tecnica standard invece di un Western blot per determinare le dimensioni della proteina (s) che mostra genotipo-dipendente vincolante. Utilizzare queste informazioni per ridurre l'elenco dei TF previsti dagli approcci computazionali dettagliati nell'introduzione.

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Results

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In questa sezione, i risultati rappresentativi di cosa aspettarsi sono forniti durante l'esecuzione di un EMSA o DAPA, e la variabilità per quanto riguarda la qualità del lisato è caratterizzata. Ad esempio, è stato suggerito che il congelamento e scongelamento campioni proteici più volte può causare denaturazione. Al fine di esplorare la riproducibilità delle analisi EMSA nel contesto di questi cicli "gelo-disgelo", due 35 oligo bp diverse in una sola variante genetica sono stati incuba...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nonostante i progressi nelle tecnologie di sequenziamento e genotipizzazione hanno notevolmente migliorato la nostra capacità di individuare le varianti genetiche associate alla malattia, la nostra capacità di comprendere i meccanismi funzionali colpite da queste varianti è in ritardo. Una fonte importante del problema è che molte varianti associate alla malattia sono situati in n on-regioni codificanti del genoma, che probabilmente incidere più difficile da prevedere meccanismi che controllano l'espressione g...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Erin Zoller, Jessica Bene, e Lindsey Hays per l'input e la direzione nello sviluppo del protocollo. MTW è stata supportata in parte da NIH R21 HG008186 e da una sovvenzione Trustee Award della Cincinnati Children's Hospital Research Foundation. Lo ZHP era supportato in parte dal T32 GM063483-13.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Oligonucleotidi DNA personalizzatiTecnologiehttp://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
cloruro di potassioFisher ScientificBP366-500KCl, per tampone CE
HEPES (1 M)Fisher Scientific15630-080per tampone CE e NE
EDTA (0,5 M), pH 8.0Life TechnologiesR1021Per tampone CE, NE e ricottura
Cloruro di sodioFisher ScientificBP358-1NaCl, per tampone NE
Tris-HCl (1M), pH 8,0InvitrogenBP1756-100Per tampone di ricottura
Soluzione salina tamponata con fosfato (1x)Fisher ScientificMT21040CMPBS, per lavaggio cellulare
Soluzione di DL-ditiotreitolo (1 M)Sigma646563Agente riducente
Inibitore della proteasi CocktailThermo Scientific87786Previene il catabolismo dei TF
Inibitore della fosfatasi Cocktail Thermo Scientific78420Previene la defosforilazione dei TF
Sostituto Nonidet P-40IBI ScientificIB01140NP-40, per estrazione nucleare
Kit per il dosaggio delle proteine BCAThermo Scientific23225Per misurare la concentrazione di proteine
Kit tampone EMSA OdysseyLicor829-07910Contiene tutti i tamponi EMSA necessari
Gel TBE, 6%, 12 pozzettiInvitrogenEC6265BOXper EMSA
TBE Buffer (10x)Thermo ScientificB52per EMSA
FactorFinder Starting KitMiltenyi Biotec130-092-318Contiene tutti i tamponi DAPA necessari Licor
Odyssey CLxLicorScanner consigliato per DAPA/EMSA
Antibiotico-AntimicoticoGibco15240-062Contiene 10.000 unità/ml di penicillina, 10.000 µ g/ml di streptomicina e 25 µ g/ml di Fungizone®
Siero fetale bovinoGibco26140-079FBS, per terreni di coltura
RPMI 1640 MediumGibco22400-071Contiene L-glutammina e 25 mM HEPES
DNA integrate antimicotico

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