Articolo metodologico

Stripe Assay per studiare l'attività attrattiva o repulsiva di un substrato proteico Utilizzando dissociata neuroni dell'ippocampo

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DOI:

10.3791/54096

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19 giugno 2016

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1Anatomy and Neuroscience, Hamamatsu University School of Medicine, 2Cell and Neurobiology, Zoological Institute, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

In questo articolo

Sommario

Le molecole di guida degli assoni regolano la migrazione neuronale e la navigazione mirata dei coni di crescita. Presentiamo un metodo potente, il saggio a strisce, per valutare la capacità delle molecole guida di attrarre o respingere i neuroni. In questo protocollo, dimostriamo il saggio a strisce mostrando la capacità di FLRT2 di respingere i neuroni ippocampali in coltura.

Abstract

Gli assoni in crescita sviluppano una struttura altamente mobile sulla loro punta, chiamata cono di crescita. Il cono di crescita entra in contatto con i segnali ambientali extracellulari per navigare nella crescita assonale. La netrina, la fessura, la semaforina e le efrine sono molecole guida note che possono attrarre o respingere gli assoni dopo essersi legati ai recettori e ai co-recettori sull'assone. I recettori attivati avviano varie molecole di segnalazione nel cono di crescita che alterano la struttura e il movimento del neurone. Qui, descriviamo il protocollo dettagliato per un saggio a strisce per valutare la capacità di una molecola guida di attrarre o respingere i neuroni. In questo metodo, i neuroni ippocampali dissociati da topi E15.5 vengono coltivati su piastre rivestite di laminina lavorate con strisce alternate di ectodominio di fibronectina e proteina transmembrana ricca di leucina-2 (FLRT2) e proteina cristallizzabile del frammento di immunoglobulina G (IgG) di controllo (Fc). Sia gli assoni che i corpi cellulari sono stati fortemente respinti dalle regioni a strisce rivestite di FLRT2 dopo 24 ore di coltura. L'immunocolorazione con tau1 ha mostrato che ~90% dei neuroni erano distribuiti sulle strisce rivestite di Fc rispetto alle strisce rivestite di FLRT2-Fc (~10%). Questo risultato indica che FLRT2 ha un forte effetto repulsivo su questi neuroni. Questo potente metodo è applicabile non solo per i neuroni primari in coltura, ma anche per una varietà di altre cellule, come i neuroblasti.

Introduzione

Guida Axon è il processo attraverso il quale i neuroni appena formati inviano assoni al loro obiettivo durante lo sviluppo del sistema nervoso 1,2. assoni in via di sviluppo portano una struttura altamente mobili al loro punta chiamato il cono di crescita. Il cono di crescita rileva segnali extracellulari per navigare il percorso del assone. Molecole di guida, come ad esempio a fessura, semaphorin, e efrine, possono attrarre o respingere gli assoni a seconda della loro interazione con i recettori idonei e co-recettori presenti sulla assone 1,3,4. I recettori attivati ​​trasferire segnali al cono di crescita che riguardano l'organizzazione del citoscheletro per i movimenti degli assoni e la crescita-cono.

Vari metodi sono stati sviluppati per valutare l'azione di molecole attrattivi e repellenti. Chemio-attrattivi e repellenti possono essere somministrati nel mezzo di crescita / cultura con un gradiente di concentrazione (ad es., Camera di Dunn o μ-slides) 5,6, in una zona ad alta concentrazione da micro-pipette (ad es., test di tornitura) 7 o ad una concentrazione omogenea applicazione da bagno (ad es., test di caduta cono di crescita) 8,9.

Altri metodi includono un saggio banda o stampa microcontact (μCP), in cui un chemio-attrattivo o repellente è rivestito sulla superficie di una piastra come substrato 10-12. Thestripe saggio è stato originariamente sviluppato da Bonhoeffer e colleghi nel 1987 per analizzare la mappatura topografica del pulcino sistema di retino-tectal 13. Il metodo originale ha richiesto un sistema di vuoto a proteine ​​di rivestimento su membrane Nucleopore policarbonato utilizzando righe e matrici maglie. Nelle versioni successive, le proteine ​​ricombinanti sono stati stampati direttamente sulla superficie di una piastra di coltura in un modello a strisce utilizzando matrici di silicio stretta fessura 14,15. Recentemente, diversi gruppi di ricerca hanno applicato con successo questo test striscia per l'analisi delle attività di orientamento degli assoni molecola 16-21.

Qui, vi presentiamo il protocollo dettagliato per un test che misura la striscia di attrazione o repulsione di molecole di guida degli assoni di neuroni dell'ippocampo dissociati. In particolare, questo metodo può essere applicato in laboratorio minimamente attrezzate. Per questo test, alternando strisce di un substrato fluorescente e una proteina di controllo sono generati su un piatto di plastica utilizzando una matrice di silicio con feritoie 90 micron e rivestiti con laminina. Nella nostra dimostrazione, dissociato neuroni dell'ippocampo dei topi E15.5 sono state coltivate su strisce di ectodomain ricombinante di fibronectina e proteine ​​transmembrana-2 (FLRT2) ricchi di leucina e controllare Fc proteine ​​21 alternata. Dopo 24 ore di cultura, sia gli assoni e corpi cellulari dei neuroni sono stati fortemente respinti dalle strisce FLRT2. Colorazione con un anticorpo anti-Tau1 rivelato che ~ 90% dei neuroni sono stati distribuiti sulle regioni Fc rivestite, rispetto a ~ 10% sul FLRT2-Fc, indicando che FLRT2 ha una forte repulsivaFunzione per i neuroni dell'ippocampo 21.

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Protocollo

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso Hamamatsu University School of Medicine.

1. Preparazione di matrici

  1. Far bollire 4-8 matrici di silicone in un forno a microonde o su un piatto caldo per 5 minuti e permettere loro di asciugare completamente per 1 ora sotto flusso laminare (lato a strisce in alto).
    Nota: Le seguenti procedure devono essere eseguite in condizioni di flusso laminare.
  2. Soffiare aria compressa o usare nastro adesivo trasparente per rimuovere la polvere dal lato righe delle matrici. Mantenere il lato strisce pulito in modo che possa aderire saldamente alla superficie della piastra.
  3. Posizionare con cura le matrici sulle stoviglie di plastica 6 cm premendo con un dito (una matrice per ogni piatto; lato striscia verso il basso). Evitare che le bolle d'aria tra la matrice e il piatto. Segnare la posizione delle strisce sul lato inferiore del piatto cultura.
  4. Se la matrice non riesce a collegare, ripetere dal punto 1.2.

2. Stripe Generazione e laminina Coating per la Cultura Neuron

  1. Preparare fluorescente proteina ricombinante (25 ml ciascuno per iniezione [passo 2.2] o 100 ml ciascuno per il metodo di posizionamento [punto 2.2.1]) mescolando la proteina Fc-tag (10-50 mg / ml) e un dye fluorescente anticorpo coniugato anti-umano Fc (da 1 a 3 rapporto: 30-150 mcg / ml) in tampone fosfato (PBS). Poi, incubare la miscela per 30 minuti a RT.
  2. Utilizzando una siringa 22-G, iniettare 25 ml di proteina ricombinante preparato nel passaggio precedente (2.1) attraverso il piccolo foro sul lato della matrice (frecce in figura 1A, 1C e 1E).
    1. In alternativa, posizionare 100 microlitri della proteina ricombinante nella fessura superiore della matrice e aspirare circa metà della soluzione dal piccolo foro (frecce in figura 1A, 1C e 1E), in modo che la proteina ricombinante rimane nelle regioni strisce.
  3. Incubare il piatto per 30 min a 37 ° C in un incubatore di coltura cellulare.
  4. Mettere 300 ml di PBS nella feritoia superiore (Figura 1B) e aspirare dal piccolo foro situato sul lato della matrice (frecce in figura 1A, C ed E) per rimuovere le proteine ​​ricombinanti separati. Non aspirare il PBS completamente, perché le proteine ​​si asciugheranno. Ripetere questa operazione due volte. (3 volte totale)
  5. Rimuovere con attenzione la matrice e collocare immediatamente ~ 100 ml di proteina di controllo (10-50 mg / ml; Fc) per coprire l'intera area a righe, creando un rivestimento alternativo. Poi, incubare il piatto per 30 minuti a 37 ° C in incubatore di coltura cellulare.
  6. Dopo aver lavato la superficie piatto tre volte con PBS, cappotto con ~ 100 ml di 20 mg / ml in PBS laminina.
    Nota: laminina devono essere scongelati in ghiaccio per evitare la solidificazione.
  7. Incubare il piatto per 1 ha 37 ° C in incubatore di coltura cellulare.
  8. Lavare la superficie piatto tre volte con PBS e aggiungere la cultura medium. Porre la capsula rivestita con mezzo di coltura in un incubatore CO 2 5% a 37 ° C fino al momento dell'uso.

3. Coltura neuroni dell'ippocampo da E15.5 embrioni di topo

  1. Euthanize madre tramite dislocazione cervicale e isolare tre E15.5 embrioni.
  2. Tagliare la pelle e il cranio sagittalmente sulla linea mediana della testa con le forbici, e rimuovere il cervello utilizzando un cucchiaino. Trasferire il cervello attenzione ad un 60 mm Petri contenente 3 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS).
  3. Usando un bisturi, tagliare gli emisferi, tra cui corteccia, ippocampo e striato (Figura 2A). Poi, sezionare la regione dell'ippocampo rimuovendo accuratamente le meningi, e trasferire i tessuti ippocampali sezionato in un tubo da centrifuga da 15 ml contenente 2 ml di soluzione HBSS, su ghiaccio (Figura 2B-C). Raccogliere 6 ippocampi da 3 embrioni nel tubo, che sono sufficienti per la coltura di neuroni in 8 piatti.
  4. Sostituire la Hsoluzione BSS con soluzione di tripsina / EDTA (2 ml) e incubare il tubo a 37 ° C per 15 minuti in un bagno d'acqua.
    Nota: Aspirare HBSS senza centrifugazione e non decantare la soluzione HBSS inclinando il tubo.
  5. Neutralizzare l'attività tripsina aggiungendo 500 ml di siero bovino fetale (FBS).
  6. Centrifugare la miscela a 100 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 2 ml di mezzo di coltura. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
  7. Preparare la ippocampi su e giù per 10 volte in terreno di coltura con una punta di 1.000 ml, con un grande foro (cut-punta) per dissociare il tessuto.
  8. Passare a un normale (non tagliato) punta da 1.000 ml e seminare il dissociato tessuto su e giù per ottenere una cella singola sospensione.
  9. Separare le singole cellule facendoli passare attraverso un colino cella di rete 80-100 micron.
  10. Centrifugare la sospensione cellulare singola filtrata a 150 xg per 5 min.
  11. Eliminare il surnatante tramite aspirazione e risospendere il Pellet (neuroni) in 2 ml di mezzo di coltura.
  12. Contare le cellule utilizzando un emocitometro con trypan colorazione blu per determinare la densità e la vitalità. Poi, piastra 10.000 neuroni in 150 ml di terreno di coltura per ogni insieme di sospensione stripes.The deve essere posizionato con attenzione per coprire l'intera regione della banda.

4. Visualizzazione di corpi cellulari e degli assoni mediante immunofluorescenza colorazione con un anticorpo anti-Tau1

  1. Dopo 24 h di coltura, aspirare il terreno senza disturbare le cellule aderenti, e fissare i neuroni con pre-riscaldato paraformaldeide 4% (PFA) / 4% di saccarosio / PBS a temperatura ambiente per 15 min.
  2. Lavare la superficie della piastra 3 volte con PBS. Se lo si desidera, utilizzare una penna idrorepellente per disegnare un cerchio intorno alla regione strisce per diminuire la quantità di anticorpo necessaria.
  3. Permeabilize i neuroni con 0.3% Triton X-100 / PBS per 5 min.
  4. Incubare le neuroni con soluzione bloccante contenente 3% di siero asino e 0,1% Triton X-100 per30 min seguita da incubazione con un anticorpo anti-Tau1 (1: 200) in 1% di siero asino / 0,1% Triton X-100 / PBS O / N a 4 ° C.
  5. Lavare la superficie della piastra 3 volte con PBS. Incubare i neuroni con un anticorpo anti-topo IgG fluoroforo coniugato in 1% di siero albumina bovina (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS per 30 min.
  6. Lavare la superficie della piastra 3 volte con PBS. Coprire la regione a righe con una x 18 mm vetro di copertura 18 millimetri con 50 ml di soluzione antifade. evitare bolle d'aria, che interferiscono con l'imaging.
  7. Ottenere immagini fluorescenti con un microscopio a fluorescenza utilizzando il sistema appropriato, ad esempio, x10 lente obiettivo, set di filtri per GFP e RFP, e tempo di esposizione 1.000 msec (Figura 3).

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Risultati

Dissociati neuroni dell'ippocampo di topi E15.5 sono stati placcati e coltivate per 24 h su strisce di fluorescente controllo Fc (Figura 3A-C) o FLRT2-Fc (Figura 3D-F) in alternanza con Fc non etichettati controllo. In entrambi i casi, i neuroni sono stati aggregati e esteso le loro assoni come fasci. Sul controllo strisce Fc / Fc, i neuroni sono stati distribuiti in modo uniforme sulle strisce fluorescente e non etichettati, e hanno esteso i loro as...

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Discussione

Questo protocollo descrive un test che utilizza la banda proteina ricombinante e neuroni dissociato dal ippocampo E15.5 mouse. Questo test permette l'osservazione efficiente delle risposte repulsive, attraenti, o neutri di neuroni ad una proteina ricombinante di interesse collocato in un motivo a righe. Un importante vantaggio di questo protocollo è il metodo semplice per generare le strisce, in cui la proteina è stampato direttamente sulla superficie di un piatto di plastica, rispetto al metodo tradizionale che ric...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni per la ricerca scientifica della Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 e 26670090 a S.Y.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta da centrifuga da 15 mlViolamo 1-3500-01
4% Paraformaldeide (PFA)Nacalai01954-85
Alexa Fluor 488 Capra anticorpo IgG umanoThermo ScientificA11013
Alexa Fluor 594 Asino anti-topo Anticorpo IgGThermo ScientificA-21203Diluizione 1/500
Anticorpo Anti-Tau1ChemiconMAB3420Diluizione 1/200
AntifadeThermo ScientificP7481È possibile utilizzare mezzi di montaggio alternativi
Integratore B27Thermo Scientific17504-044Diluizione 1/50
Albumina sierica bovinaSigma01-2030-2
Filtro cellulare 100 umBD Falcon352360
CentrifugatriceKubota2410
Vetro di copertura 18mmx18mmMatsunami18x18 mm N. 1
Penna DAKODAKOS2002Si può usare una penna alternativa idrorepellente
Bisturi monousoPiuma2975#11
FBSThermo Scientific10437-028
Microscopio fluorescenteNikonE600
Pinze n. 5Strumenti per le scienze11254-20
GlutaMAXThermo Scientific35050-061Diluizione 1/100
Siringa HamiltonHamilton805Ncalibro 22, 50 uL
HBSSThermo Scientific14170-112
IgG umane, frammento FcJackson009-000-008
LamininThermo Scientific23017-015
Thermo neurobasale Scientific21103-049
Siero d'asino normaleJackson017-000-121
PBSNacalai14249-24
Penicillina-StreptomicinaThermo Scientific15070-063Diluizione 1/100
Piatto di coltura in plastica, 60 mmThermo Scientific150288
Matricidi siliconeDisponibile e acquistabile presso il Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
StereomicroscopioOlympusSZ61
Tip, 1000 uLWatson125-1000S
Nastro adesivo trasparenteTesa57315È possibile utilizzare un nastro adesivo alternativo
Triton X-100SigmaT8787
Trypan blue, 0,4%Bio-Rad145-0013
Tripsina/EDTAThermo Scientific25300-054
Terrenoneurobasale integrato con B27, GlutaMAX e Penicillina-Streptomicina.
di coltura

Riferimenti

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