Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

Sommario

C'è un crescente interesse per la caratterizzazione quantitativa dei linfociti intestinali a causa del crescente riconoscimento che queste cellule svolgono un ruolo critico in una varietà di malattie intestinali e sistemiche. In questo protocollo, descriviamo come isolare singole popolazioni cellulari da diversi compartimenti dell'intestino tenue per la successiva caratterizzazione citofluorimetrica.

Abstract

L'intestino - che contengono il maggior numero di cellule immunitarie di qualsiasi organo del corpo - sono costantemente esposti ad antigeni estranei, sia microbica e dietetici. Dato una maggiore comprensione che questi antigeni luminali contribuiscono a formare la risposta immunitaria e che l'istruzione di cellule immunitarie all'interno dell'intestino è critica per un certo numero di malattie sistemiche, c'è stato un crescente interesse nel caratterizzare il sistema immunitario intestinale. Tuttavia, molti protocolli pubblicati sono arduo e richiede tempo. Presentiamo qui un protocollo semplificato per l'isolamento dei linfociti dalla propria nell'intestino tenue lamina strato intraepiteliale e placche di Peyer che è rapido, riproducibile e non richiede laboriose gradienti di Percoll. Sebbene il protocollo concentra sul piccolo intestino, è adatto anche per l'analisi del colon. Inoltre, si segnalano alcuni aspetti che possono avere bisogno di ulteriore ottimizzazione a seconda della specifica ques scientificozione. Questo approccio si traduce in l'isolamento di un gran numero di linfociti vitali che possono poi essere utilizzati per analisi di citometria di flusso o sistemi alternativi per la caratterizzazione.

Introduzione

Il compito principale del piccolo intestino è spesso considerata la digestione e l'assorbimento dei nutrienti ^1. Anche se questa funzione metabolica è chiaramente essenziale, il piccolo intestino ha un ruolo altrettanto significativo nel proteggere l'host dallo sbarramento continuo di antigeni ambientali presenti all'interno del lume ^2. Il tratto intestinale separa il mondo esterno (ad es., Antigeni luminali) dall'ambiente interno dell'ospite con uno strato epiteliale che è soltanto un singolo strato di cellule di spessore. Come tale, il piccolo-intestinale sistema immunitario ha il compito arduo di bilanciare la soglia per la reattività, permettendo antigeni estranei dalla dieta e commensali microbi per immettere la mucosa con minima o nulla, la risposta immunitaria nel montare una risposta forte contro patogeni e altri antigeni "nocivi". Risposte immunitarie eccessive o inappropriate a questi antigeni possono portare a malattie patologiche (ad es., Infiammazionimalattia Tory intestinali, diabete di tipo I, la sclerosi multipla) e deve essere evitato ^3-6.

Complessivamente, il tratto gastrointestinale è pensato per rappresentare il più grande organo immunitario del corpo, contenente più del 70% di tutte le cellule secernenti anticorpi ^7. Il sistema immunitario del piccolo intestino è composto da 3 compartimenti principali - lamina propria (LP), lo strato intraepiteliale e placche di Peyer (PP) - che ogni contiene un particolare gruppo di linfociti ^2. I linfociti LP (LPLS) sono principalmente ^cellule T TCRαβ con ~ cellule del 20% B; linfociti intraepiteliali (IELS) contengono pochissime cellule B con più ^cellule T TCRγδ di ^cellule T TCRαβ; e PP, che sono gli organi linfoidi secondari incorporati nel piccolo-intestinale muro, contengono cellule ~ 80% B. Anche se ciascuna di queste regioni anatomiche ha funzioni leggermente diverse e basi ontologiche, funzionano in ahmoda armonized per proteggere l'host da insulti patogeni.

Inoltre, vi è una crescente apprezzamento che il microbiota 'critico per lo sviluppo del sistema immunitario intestinale, con crescente riconoscimento del rapporto tra cognate microbi specifici e l'ontogenesi di particolari linee cellulari ^8,9. Inoltre, dato che l'educazione del sistema immunitario intestinale colpisce risposte immunitarie nei siti anatomicamente distanti (ad es., L'artrite, la sclerosi multipla, la polmonite), è diventato chiaro che lo sviluppo del sistema immunitario intestinale è rilevante per più processi di malattia rispetto al passato riconosciuto ^{10 -12.} Come tale, l'interesse per quantitativamente valutazione del sistema immunitario intestinale si è esteso al di là di interazioni ospite-patogeno per includere ora interazioni ospite-commensale e la patogenesi di molte malattie sistemiche come bene.

Data la variabilità dei metodi attuali nellaisolamento dei linfociti intestinali, un metodo che è ottimizzato per la resa, la vitalità e la coerenza bilanciando il tempo richiesto è sempre più critica. I protocolli che coinvolgono gradienti di Percoll sono tempo e lavoro e potenzialmente più inclini a errori umani, che porta a rendimento variabile e la vitalità ^13. Qui, forniamo un protocollo ottimizzato per l'isolamento e la caratterizzazione dei linfociti da tutti e 3 i comparti del sistema immunitario del piccolo intestino. Inoltre, data crescente interesse alterazioni microbo indotte nel sistema immunitario mucosale, includiamo passi che possono essere utilizzati per consentire la trasmissione orizzontale di microrganismi tra i topi di valutare come questi cambiamenti influenzano quantitativamente il sistema immunitario intestinale.

Protocollo

Tutti gli studi sono stati condotti in esame rigoroso e linee guida secondo il Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) presso la Harvard Medical School, che risponde alle norme veterinarie stabilite dalla American Association for Laboratory Animal Science (AALAS).

1. orizzontale trasmissione di batteri attraverso Co-housing (opzionale)

1. Per ridurre al minimo la contaminazione esogena (in particolare se si utilizza topi gnotobiotic), praticare la tecnica asettica, mentre l'assemblaggio gabbie sterili monouso, con cibo e acqua che sono stati entrambi in autoclave.
2. Utilizzare i punzoni auricolari o tag per contrassegnare individualmente 6 settimane di età C57BL / 6 topi che porto diverse microbiotas e li ospitano nella stessa gabbia. Dato che i topi sono coprofagiche e mangiare pellet fecali dal pavimento della gabbia, i microbi saranno naturalmente trasmesse orizzontalmente tra i topi.
3. topi Co-house per ≥1 settimana per dare il tempo per il trasferimento microbica e di cambiamento immunologico prima dell'analisi.

2. Preparazione di una cella singola sospensione dallo strato intraepiteliale piccola intestinale e lamina propria

1. Preparazione delle soluzioni
   1. Preparare mezzi di estrazione (per tenue): 30 ml RPMI + 93 microlitri 5% (w / v) ditiotreitolo (DTT) + 60 ml di 0,5 M EDTA + 500 microlitri di siero fetale bovino (FBS). Aggiungere il DTT immediatamente prima dell'uso.
   2. Preparare supporti digestione (per intestino tenue): 25 ml RPMI + 12,5 mg dispasi + 37,5 mg di collagenasi II + 300 microlitri FBS. Aggiungere il dispasi e collagenasi immediatamente prima dell'uso.
   3. Per tutte le incubazioni eseguite a 37 ° C, le soluzioni Preriscaldate a 37 ° C.
2. Eutanasia il mouse da CO ₂ asfissia seguita da dislocazione cervicale.
3. Posizionare il lato del mouse dorsale verso il basso e spruzzare l'addome con il 70% di etanolo. Utilizzare le forbici per eseguire una laparotomia dalla sequenza tagliare la pelle e la fascia poi peritoneale lungo la linea mediana ventrale from sinfisi pubica al processo xifoideo, esponendo così la cavità peritoneale.
4. Usare le forbici per separare il piccolo intestino dallo stomaco da sezionare lo sfintere piloro. Rimuovere delicatamente l'intestino tenue dal peritoneo, prendere in giro il grasso mesenterico.
   1. Per rimuovere completamente l'intestino tenue, effettuare un secondo taglio alla giunzione ileo-cecale. Posizionare il piccolo intestino isolato in fredda (es., 4 ° C) RPMI contenente 10% FBS per massimizzare la vitalità cellulare.
5. Rimuovere delicatamente grandi pezzi di grasso con pinze curve. Usare cautela per evitare di strappare il tessuto intestinale in sé durante il tentativo di rimuovere il grasso.
6. Per rimuovere contenuto intestinale, intestino delicatamente a filo con 15 - 20 ml di PBS freddo utilizzando un ago di alimentazione 18 G apposto una siringa.
7. Usare le forbici per recidere PP, e metterli in RPMI freddo contenente il 5% di FBS. PP si trovano sul lato antimesenterico dell'intestino tenue e appare come un bianco multi-lobulatimassa. A seconda del ceppo specifico, un mouse ha tipicamente 8 - 12 PP.
8. Tagliare il piccolo intestino in 3 - 4 segmenti pollici.
9. Rimuovere il grasso residuo da dolci ogni piccolo-intestinale segmento su un tovagliolo di carta inumidito con RPMI, utilizzando un bisturi noioso per prendere in giro il grasso dal tessuto.
10. Ruotare il tessuto all'interno da cannulating segmenti intestinali con pinze curve e afferrando l'estremità distale del tessuto. Quindi utilizzare un paio di pinze diritte per rimuovere delicatamente il segmento di tessuto dalle pinze curve (a partire dalla fine prossimale), con conseguente tessuto che viene invertita.
11. Posizionare i segmenti di tessuto in una tazza contenente 30 ml di mezzi di estrazione e un ancoretta. Fissare il coperchio sulla tazza, e mescolare a 500 rpm per 15 min a 37 ° C; agitazione dovrebbe essere vigoroso, ma non turbolenta.
12. Dopo l'incubazione, utilizzare un filtro in acciaio per separare pezzi di tessuto dal surnatante dell'epitelio contenente, che dovrebbe apparire torbida. Questo surnatante contiene ilinfociti ntraepithelial che può essere ulteriormente analizzati, se desiderato, procedendo a filtrare il campione in passi 2.18 - 2.23.
13. Agitare manualmente i pezzi di tessuto in RPMI per lavare via i media di estrazione residui.
14. Posizionare il tessuto su un tovagliolo di carta asciutto e capovolgere su se stesso più volte per facilitare la rimozione del muco residui che non è stato liberato dal mezzo di estrazione.
15. Posizionare frammenti di tessuto in una provetta da 1,5 ml con 600 ml di mezzo di digestione.
16. Usare le forbici per tritare il tessuto fino a pezzi aderiscono più alle forbici e la soluzione appare omogenea. Questo passaggio è fondamentale per garantire la completa digestione enzimatica del tessuto.
17. Aggiungere tenue macinata ad una tazza contenente 25 ml di mezzi di digestione. Mescolare a 500 rpm per 30 min a 37 ° C. A metà della digestione (cioè., A 15 min), pipettare su e giù con una pipetta sierologica per contribuire a spezzare eventuali grossi pezzi di tessuto.
18. Filtro tessuto digerito (o epithstrato Elial dal punto 2.12 se IELS di elaborazione) attraverso un colino cella di 100 micron in un tubo da 50 ml. Risciacquare il filtro con 20 ml di RPMI contenente 10% FBS.
19. Centrifugare la soluzione filtrata a 500 xg per 10 min a 4 ° C.
20. decantare con cautela il surnatante e risospendere pellet in 1 ml di RPMI contenente 10% FBS.
21. Filtro risospeso cellule attraverso un filtro 40 micron cellule in una provetta da 50 ml. Lavare il filtro con 20 ml di RPMI contenente 10% FBS.
22. Centrifugare soluzione filtrata a 500 xg per 10 min a 4 ° C.
23. decantare con attenzione il surnatante, e risospendere pellet in 1 ml di RPMI contenente il 2% FBS.

3. Preparazione di una cella sospensione singola da placche di Peyer

1. Trasferimento asportato PP ad una tazza con 25 ml di mezzi di digestione e di un ancoretta. coperchio sicuro, e far girare a 500 giri al minuto per 10 minuti a 37 ° C.
2. Filtro digerito PP attraverso un filtro 40 micron cellule in una provetta da 50 ml. Se una qualsiasi grumi remain, premerli attraverso il filtro utilizzando l'estremità piatta del pistone da una siringa da 1 ml.
3. Risciacquare il filtro con 10 ml di RPMI contenente 10% FBS.
4. Centrifugare soluzione filtrata a 500 xg per 10 min a 4 ° C.
5. decantare con attenzione il surnatante, e risospendere pellet in 1 ml di RPMI contenente il 2% FBS.

4. colorazione della superficie per citometria a flusso

1. Aliquota adeguato volume delle cellule (ad es., 200 ml di LPLS) in un piatto fondo rotondo da 96 pozzetti.
2. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante invertendo la piastra.
3. Risospendere le cellule in 90 ml di RPMI contenente il 2% FBS e una diluizione 1: 100 di CD16 anti-/ 32 (blocco FC). Incubare per 10 minuti a 4 ° C.
4. Aggiungere 10 ml di PBS. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante invertendo la piastra.
5. Risospendere le cellule in 250 l di PBS. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. surnatante decantareinvertendo la piastra.
6. cellule Stain (opzionale) con colorante vitalità, se lo si desidera, seguendo il protocollo del produttore.
7. Risospendere le cellule in 100 l 1% di formalina per fissare le cellule. Incubare per 1 ora al buio a 4 ° C.
8. Aggiungere 200 l di PBS. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante invertendo la piastra.
9. Risospendere le cellule in 250 l di PBS. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante invertendo la piastra.
10. Risospendere le cellule in 200 l di PBS. Analizzare le cellule utilizzando un citofluorimetro.

Risultati

Flusso citometria di sospensioni singola cella di piccole-intestinale linfociti dovrebbe produrre una popolazione discreta di cellule che hanno caratteristiche simili in avanti e scatter laterale come splenociti (Figure 1A e 1B). I linfociti possono cominciare a morire se il tessuto non viene mantenuta a 4 ° C durante le fasi iniziali della isolamento, con conseguente popolazione linfocitaria avente un forward scatter inferiore ed essere più difficile da separare da altr...

Discussione

Vi presentiamo un protocollo per l'isolamento e il flusso caratterizzazione mediante citometria di piccole-intestinale linfociti, tra cui il LPLS, IELS, e linfociti nel PP. Per chi è interessato a valutare come i cambiamenti nel microbiota influenzano la piccola-intestinale sistema immunitario, ci dettaglio i semplici passaggi coinvolti nella trasmissione orizzontale di organismi tra i topi che ospitano diverse microbiotas. Sebbene questo protocollo concentra sul piccolo intestino, la procedura è la stessa per l'...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Guanti sterili	Kimberly-Clark	555092
gabbia sterile per topi	Innovive	MS2-AD	contiene coperchio, fondo della gabbia e lettiera alfa-dri
Alimentatore in metallo	Innovive	M-FEED
Portacarte	Innovive	CRD-HLD-H
Roditore autoclavabile chow (NIH-31M)	Zeigler	4131207530
RPMI medium 1640	Gibco	11875-119
Ditiotreitolo (DTT)	Sigma	D5545-5G
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Ambion	AM9262
Siero fetale bovino (FBS)	GemBio	100-510
Dispase II	Invitrogen	17105-041	la concentrazione nel protocollo si basa su un livello di attività di 1,878 U/mg
di collagenasi, tipo II	Invitrogen	17101-015	la concentrazione nel protocollo si basa su un livello di attività di 245 U/mg
Forbici da dissezione	Roboz	RS-5882
Ago di alimentazione (18 G, lunghezza 2")	Roboz	FN-7905
Siringa da 10 ml	BD	305482
PBS	Gibco	14190-250
Bisturi monouso (15 lame)	Miltex	4-415
Pinza curva	Roboz	RS-5211
Pinza dritta	Roboz	RS-5132
Tazze multiuso, 120 ml	VWR	89009-662
Barra di agitazione	VWR	58949-062
Piastra di agitazione multiposizione, 9 posizioni	VWR	12621-048
Conica in acciaio inossidabile Filtro, 3 pollici	RSVP
1,5 ml Tubo	Eppendorf	0030 125.150
100 μ m Filtro cellulare	Falcon	08-771-19
40 μ m Filtro cellulare	Falcon	08-771-1
50 ml Tubo conico	Falcon	352098
Siringa da 1 ml	BD	309659
Piastra a 96 pozzetti, fondo tondo	Corning	3799
Anti-mouse CD16/32 (blocco Fc)	Biolegend	101320
(Opzionale) Colorante di vitalità fissabile eFluor 780	eBiosciences	65-0865-18
10% Formalina, tamponato neutro	Thermo Scientific	5725