Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

Summary

C'è un crescente interesse per la caratterizzazione quantitativa dei linfociti intestinali a causa del crescente riconoscimento che queste cellule svolgono un ruolo critico in una varietà di malattie intestinali e sistemiche. In questo protocollo, descriviamo come isolare singole popolazioni cellulari da diversi compartimenti dell'intestino tenue per la successiva caratterizzazione citofluorimetrica.

Abstract

L'intestino - che contengono il maggior numero di cellule immunitarie di qualsiasi organo del corpo - sono costantemente esposti ad antigeni estranei, sia microbica e dietetici. Dato una maggiore comprensione che questi antigeni luminali contribuiscono a formare la risposta immunitaria e che l'istruzione di cellule immunitarie all'interno dell'intestino è critica per un certo numero di malattie sistemiche, c'è stato un crescente interesse nel caratterizzare il sistema immunitario intestinale. Tuttavia, molti protocolli pubblicati sono arduo e richiede tempo. Presentiamo qui un protocollo semplificato per l'isolamento dei linfociti dalla propria nell'intestino tenue lamina strato intraepiteliale e placche di Peyer che è rapido, riproducibile e non richiede laboriose gradienti di Percoll. Sebbene il protocollo concentra sul piccolo intestino, è adatto anche per l'analisi del colon. Inoltre, si segnalano alcuni aspetti che possono avere bisogno di ulteriore ottimizzazione a seconda della specifica ques scientificozione. Questo approccio si traduce in l'isolamento di un gran numero di linfociti vitali che possono poi essere utilizzati per analisi di citometria di flusso o sistemi alternativi per la caratterizzazione.

Introduction

Il compito principale del piccolo intestino è spesso considerata la digestione e l'assorbimento dei nutrienti ^1. Anche se questa funzione metabolica è chiaramente essenziale, il piccolo intestino ha un ruolo altrettanto significativo nel proteggere l'host dallo sbarramento continuo di antigeni ambientali presenti all'interno del lume ^2. Il tratto intestinale separa il mondo esterno (ad es., Antigeni luminali) dall'ambiente interno dell'ospite con uno strato epiteliale che è soltanto un singolo strato di cellule di spessore. Come tale, il piccolo-intestinale sistema immunitario ha il compito arduo di bilanciare la sog....

Protocol

Tutti gli studi sono stati condotti in esame rigoroso e linee guida secondo il Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) presso la Harvard Medical School, che risponde alle norme veterinarie stabilite dalla American Association for Laboratory Animal Science (AALAS).

1. orizzontale trasmissione di batteri attraverso Co-housing (opzionale)

1. Per ridurre al minimo la contaminazione esogena (in particolare se si utilizza topi gnotobiotic), praticare la tecnica asettica, mentre l'assemblaggio gabbie sterili monouso, con cibo e acqua che sono stati entrambi in autoclave.
2. Utilizzare i punzoni auricolari o tag per contrassegnare individu....

Results

Flusso citometria di sospensioni singola cella di piccole-intestinale linfociti dovrebbe produrre una popolazione discreta di cellule che hanno caratteristiche simili in avanti e scatter laterale come splenociti (Figure 1A e 1B). I linfociti possono cominciare a morire se il tessuto non viene mantenuta a 4 ° C durante le fasi iniziali della isolamento, con conseguente popolazione linfocitaria avente un forward scatter inferiore ed essere più difficile da separare da altr.......

Discussion

Vi presentiamo un protocollo per l'isolamento e il flusso caratterizzazione mediante citometria di piccole-intestinale linfociti, tra cui il LPLS, IELS, e linfociti nel PP. Per chi è interessato a valutare come i cambiamenti nel microbiota influenzano la piccola-intestinale sistema immunitario, ci dettaglio i semplici passaggi coinvolti nella trasmissione orizzontale di organismi tra i topi che ospitano diverse microbiotas. Sebbene questo protocollo concentra sul piccolo intestino, la procedura è la stessa per l'.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Guanti sterili	Kimberly-Clark	555092
gabbia sterile per topi	Innovive	MS2-AD	contiene coperchio, fondo della gabbia e lettiera alfa-dri
Alimentatore in metallo	Innovive	M-FEED
Portacarte	Innovive	CRD-HLD-H
Roditore autoclavabile chow (NIH-31M)	Zeigler	4131207530
RPMI medium 1640	Gibco	11875-119
Ditiotreitolo (DTT)	Sigma	D5545-5G
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Ambion	AM9262
Siero fetale bovino (FBS)	GemBio	100-510
Dispase II	Invitrogen	17105-041	la concentrazione nel protocollo si basa su un livello di attività di 1,878 U/mg
di collagenasi, tipo II	Invitrogen	17101-015	la concentrazione nel protocollo si basa su un livello di attività di 245 U/mg
Forbici da dissezione	Roboz	RS-5882
Ago di alimentazione (18 G, lunghezza 2")	Roboz	FN-7905
Siringa da 10 ml	BD	305482
PBS	Gibco	14190-250
Bisturi monouso (15 lame)	Miltex	4-415
Pinza curva	Roboz	RS-5211
Pinza dritta	Roboz	RS-5132
Tazze multiuso, 120 ml	VWR	89009-662
Barra di agitazione	VWR	58949-062
Piastra di agitazione multiposizione, 9 posizioni	VWR	12621-048
Conica in acciaio inossidabile Filtro, 3 pollici	RSVP
1,5 ml Tubo	Eppendorf	0030 125.150
100 μ m Filtro cellulare	Falcon	08-771-19
40 μ m Filtro cellulare	Falcon	08-771-1
50 ml Tubo conico	Falcon	352098
Siringa da 1 ml	BD	309659
Piastra a 96 pozzetti, fondo tondo	Corning	3799
Anti-mouse CD16/32 (blocco Fc)	Biolegend	101320
(Opzionale) Colorante di vitalità fissabile eFluor 780	eBiosciences	65-0865-18
10% Formalina, tamponato neutro	Thermo Scientific	5725