Abbiamo descritto un protocollo per la prevenzione degli effetti dello stress da calore nei ratti mediante pre-trattamento orale con batteri benefici. Questo protocollo può essere modificato e utilizzato per varie vie di somministrazione e per l'analisi di diversi composti.
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Articolo metodologico
La prevenzione di stress termico effetti avversi nei ratti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo studio è stato disegnato per valutare l'effetto protettivo del ceppo Bacillus subtilis contro complicazioni legate allo stress da calore. Trentadue ratti Sprague-Dawley sono stati utilizzati in questo studio. Gli animali sono stati trattati per via orale due volte al giorno per due giorni con B. subtilis ceppo BSB3 o PBS. Il giorno dopo l'ultimo trattamento, ciascun gruppo è stato diviso e due gruppi sperimentali (uno trattato con PBS e uno trattato con B. subtilis) sono stati posti a 45 ° C per 25 min. Due gruppi di controllo alloggiato per 25 min a temperatura ambiente. Tutti i ratti sono stati sacrificati e diversi parametri sono stati analizzati in tutti i gruppi. Gli effetti avversi di stress da calore sono registrati dalla diminuzione di altezza villi e lo spessore della mucosa totale a livello dell'epitelio intestinale; traslocazione di batteri dal lume; aumento vescicolazione degli eritrociti ed elevazione dei lipopolisaccaridi (LPS) concentrazione nel sangue. L'efficacia protettiva di trattamento viene valutata preintervento di questi effetti collaterali. Il protocollo è stato istituito per il trattamento orale di ratti con batteri per la prevenzione delle complicanze di stress termico, ma questo protocollo può essere modificato e utilizzato per altre vie di somministrazione e per l'analisi di composti diversi.
Introduzione
Diversi fattori di stress influenzano la salute umana e animale. La temperatura è uno dei fattori più stressanti, causando malattie croniche, acute e persino letali1. In molti casi sono stati documentati cambiamenti nella morfologia intestinale e una perdita di integrità della barriera intestinale dopo stress da calore2,3. Questa barriera protettiva è responsabile della difesa contro la traslocazione dei batteri intestinali e delle loro tossine, in particolare dei lipopolisaccaridi (LPS), dal lume alla circolazione interna4,5. La stabilità del microbiota intestinale influenza in modo significativo la funzione della barriera intestinale, la risposta immunitaria dell'ospite e la tolleranza alle condizioni di stress6. Pertanto, la modulazione del microbiota intestinale può fornire un nuovo approccio per la prevenzione degli effetti avversi legati allo stress.
I batteri benefici sono stati utilizzati come strategia promettente per modificare il microbiota intestinale per una gestione efficace di varie condizioni cliniche, come diarrea, malattia infiammatoria intestinale, dermatite atopica, disturbi metabolici7-10. Gli effetti probiotici dei batteri benefici includono la produzione di metaboliti essenziali per sostenere la salute intestinale, la stimolazione del sistema immunitario, la promozione della tolleranza al lattosio, il ripristino della disfunzione epiteliale. I probiotici si sono dimostrati efficaci nella prevenzione delle complicanze legate allo stress in vitro e in modelli animali11,12.
I ricercatori hanno prestato maggiore attenzione ai batteri Bacillus come probiotici perché questi batteri supportano l'omeostasi intestinale13 e hanno effetti benefici sull'ospite14. I nostri dati precedenti hanno dimostrato un'elevata efficacia dei probiotici Bacillus contro i patogeni in vitro15,16 e in studi clinici17,18. Qui, miriamo a valutare l'effetto preventivo del ceppo B. subtilis BSB3 contro le complicanze dopo lo stress da calore.
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal IACUC della Auburn University, Auburn, in Alabama.
1. Preparazione della Cultura Media, Piatti e coltura batterica
- Seminare 10 ml di brodo nutritivo in un pallone con una singola colonia della cultura BSB3 Bacillus subtilis, cresciuto durante la notte su una piastra di agar nutriente.
- Rendere 500 ml di terreno di sporulazione 19 (per litro: Bacto Nutrient Broth, 8 g; 10% (w / v) KCl, 10 ml; 1,2% (w / v) MgSO 4 x 7H 2 O, 10 ml, agar, 15 g) e in autoclave a 121 ° C per 20 min. Lasciare raffreddare a 50 ° C e aggiungere le seguenti soluzioni sterili: 1 M Ca (NO3) 2, 1 ml; 0.01 M MnCl 2, 1 ml; 1 mM FeSO 4, 1 ml.
- Raffreddare medio disposti a 40 ° C per 20 min a temperatura ambiente e versare 25 ml in ciascuna delle 20 piastre di Petri sterili nell'armadio sterile. Lasciate che il mezzo di solidificare durante la notte.
- Stendere 0,5 ml di cultura durante la notte di Bacillus subtilis BSB3 sulla superficie del terreno in piastre Petri. Incubare coltura a 37 ° C per 5 giorni fino al 90% sporulazione. Rivela spore di fase luminosa di microscopia ad alta risoluzione.
- batteri Harvest aggiungendo 1 ml di fosfato sterile salina tamponata (PBS) alla piastra e raschiando batteri da una superficie utilizzando una spatola cellulare sterile. Conservare la sospensione in frigorifero fino al momento.
- Conferma vitalità dei batteri placcatura 0,1 ml della diluizione appropriata (10 -5 a 10 -6) di una sospensione batterica su piastre di terreno sporulazione seguita da incubazione per 18 - 24 ore a 37 ° C.
- Contare le colonie batteriche sulle piastre utilizzando un contatore di colonie e calcolare il titolo di batteri in sospensione testato. Preparare sospensione batterica con la concentrazione finale 1 x 10 8 UFC / ml in PBS.
2. Gli animali
- Utilizzare 32 ratti maschi Sprague-Dawley (250-300 g). Mantenere gli animali sotto specifiche condizioni esenti da organismi patogeni, con libero accesso a chow pellet standard ed acqua. Stabilire una temperatura media (21 ± 1 ° C), umidità (50 ± 5%) e un ciclo luce-buio 12 hr.
3. Progettazione sperimentale
- Inizia trattamento degli animali mediante sonda gastrica 11, dopo 2 giorni di acclimatazione. Usare la siringa con l'ago sonda gastrica. Trattare 16 ratti con B. sospensione subtilis BSB3 (1 ml per topo) due volte al giorno per due giorni (B. subtilis gruppo). Trattare 16 ratti con PBS (1 ml per topo) due volte al giorno per due giorni (gruppo PBS) (Figura 1).
- Dopo il trattamento, suddividere ogni gruppo (8 ratti per gruppo): Gruppo 1- controllo (PBS / no stress), Gruppo 2- B. subtilis (B. subtilis / no stress), Gruppo 3- lo stress (PBS / stress da calore) e Gruppo B. 4- subtilis + lo stress (B. subtilis lo stress / calore).
- Misurare la temperatura rettale ogni ratto utilizzando un elettronic termometro digitale. Mantenere ratti dei gruppi 1 e 2 a temperatura ambiente per 25 min. Luogo animali dei gruppi 3 e 4 in una camera climatica a 45 ° C e umidità relativa del 55% per 25 min.
- Successivamente, misurare la temperatura rettale di ogni ratto in tutti i gruppi con un termometro elettronico digitale. Mettere tutti gli animali a temperatura ambiente per 4 ore.
- Anestetizzare ratto con isoflurano (di 2 - 4%) in un vaso anestesia sigillabile e osservare finché i ratti sono profondamente anestetizzati (assenza di risposta a pinch tep). Eutanasia ratti da una rapida decapitazione con una ghigliottina.
- Raccogliere il sangue del tronco da ogni ratto 20 (15 - 16 ml) con le pipette apirogena in provette apirogena per ottenere siero e immediatamente prelevare campioni di sangue (7 microlitri da ogni ratto) con una pipetta per l'esame microscopico.
- Mettere provette con il sangue in frigorifero per almeno 30 minuti per consentire la coagulazione. Provette da centrifuga a 20 ° C, 7.000 xg per 10 min e rapidamenterimuovere siero con una pipetta. Siero Aliquota ottenuti da ogni ratto in 50 volumi microlitri e conservare a -20 ° C fino al dosaggio.
4. Procedura chirurgica
- Cut / tagliare tutta pelliccia dall'addome e del torace della parte inferiore della carcassa con cesoie elettriche. Posizionare la carcassa in un armadio sterile e trattare la superficie rasata di carcassa con il 70% di alcol.
- Utilizzare un bisturi sterile per creare un'incisione mediana dell'addome. Rimuovere il fegato, linfonodi mesenterici, milza e intestino tenue da ogni ratto con una pinzetta sterile.
5. Analisi di traslocazione batterica
- Posizionare ogni campione di fegato, linfonodi mesenterici e la milza in provette sterili pre-pesati e pesare. Calcolare il peso del campione come una differenza tra il peso di un tubo con un campione e il peso di un tubo vuoto.
- Aggiungere PBS sterile al tubo per ottenere una diluizione 1:10 (w / v) del campione e omogenize ciascun campione con un omogeneizzatore tessuto di vetro sterile per ottenere una sospensione omogenea 21.
- Effettuare diluizioni seriali (10 -1 a 10 -4) di ogni campione in PBS sterile. Piatto 0,1 ml di tutte le diluizioni di ciascun tessuto sulla superficie del MacConkey e di 5% agar sangue e Brucella agar sangue con emina (0.005 g / L) e vitamina K1 (0.01 g / L) piastre.
- Incubare MacConkey e di 5% piastre di agar sangue aerobico e piastre di agar sangue Brucella in condizioni anaerobiche a 37 ° C 22.
- Contare le colonie di batteri aerobici dopo 24 ore, e le colonie di batteri anaerobici dopo 48 ore di incubazione con un contatore di colonie. Esprimere i risultati come il numero di unità formanti colonie (CFU) in un grammo di tessuto.
6. analisi istologica
- Rimuovere piccoli campioni intestino da ogni ratto dalla procedura chirurgica (passi 4,1-4,2). Fissare i campioni in fissativo di Bouin, incorporare in paraffina,preparare 6 sezioni micron e sezioni macchia con ematossilina eosina utilizzando le procedure standard 23.
- Utilizzare un sistema di microscopia ad alta risoluzione per la misurazione dell'altezza dei villi intestinali e spessore totale della mucosa in ciascun campione (ingrandimento 100X) 24. Analizzare i 4 campioni provenienti da ogni ratto e fare almeno una ventina di misure in ogni campione. Esprimere i risultati in micrometri.
7. citochine Assay
- Utilizzare kit commerciali ratto ELISA per IL-1β; IL-6; TNF-α; INF-γ e IL-10 per misurare i livelli di citochine nel siero secondo il protocollo del produttore.
- Generare curve standard per ogni set di campioni analizzati utilizzando standard per il kit in questione. Definire il livello di citochine in ciascun campione mediante confronto dei dati sperimentali con la curva standard appropriato.
8. Lipopolisaccaride Assay
- Analizzare il livello di LPS nel siero usando un topo kit ELISA LPS in base alleprotocollo del produttore. Stima concentrazione di LPS in campioni per confronto dei valori ottenuti con i valori della curva standard.
9. Alta Risoluzione microscopia ottica di Sangue
- Utilizzare il sistema del microscopio descritto in precedenza 25,26. Utilizzare una piattaforma isolamento delle vibrazioni come base per il sistema di microscopio e telecamera e il computer 25 per registrare le immagini in diretta. Calibrare immagini di prova utilizzando una diapositiva Richardson come descritto in precedenza 27.
- Mettere 7 ml di sangue appena prelevato da ogni ratto su un vetrino, vetrino, fotografia e registrare dieci fotogrammi di immagine di 72 × 53,3 micron 2 in ciascun campione (ingrandimento 1,700X).
- Misurare la concentrazione di vescicole usando il software che fornisce immagini ottiche con vista diretta ad alta risoluzione in tempo reale. Esaminare un minimo di 20 fotogrammi per ogni condizione sperimentale 28.
10. Statistic
- Esprimere tutti i valori come media e deviazione standard. Effettuare analisi statistiche e grafico tracciato. Analizzare i risultati con i due campioni t-test, impostare il livello di significatività a 0.05 per definire la significatività statistica.
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Risultati
La temperatura corporea media degli animali prima e subito dopo lo stress da calore era 36,7 ± 0,07 ° C e 40,3 ± 0,17 ° C, rispettivamente (P <0,05). L'esposizione di ratti a calore (gruppo 3) ha determinato una significativa inibizione di altezza villi e spessore della mucosa totale (figure 2, 3). La somministrazione orale di ceppo BSB3 prima lo stress protetto intestino dagli effetti dannosi del calore.
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Discussione
L'esposizione a risultati di alta temperatura in gravi condizioni di salute 29. La prevenzione e la diagnosi precoce delle complicanze legate allo stress termico sono di vitale importanza 30. Il protocollo presentato può essere utilizzato per valutare l'efficacia di vari approcci per la prevenzione degli effetti avversi tensione termica.
Passaggi critici all'interno di questo protocollo sono: la procedura di trattamento termico (45 °<...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal fondo dell'Università di Auburn FOP 101002-139294-2050.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| Alcool etilico | Pharmco products Inc. Brookfield, CT, Stati Uniti | 64-17-5 | |
| Agar | VWR | 97064-334 | |
| MacConkey agar | plates VWR | 470180-742 | |
| 5% blood agar | plates VWR | 89405-024 | |
| Brucella blood agar plate con hemin e vitamina K | VWR | 89405-032 | |
| Bouin' s Fissativo | Microscopia Elettronica Sciences, Hatfield, PA, USA | 15990 | |
| IL-10 Rat ELISA kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0101 | |
| IL-1beta Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0011 | |
| IL-6 Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0061 | |
| INF-gamma Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | ||
| Kit ELISA per ratti TNF-alfa | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | Kit ELISA LPS per KRC3011 | |
| ratto | NeoBioLab, MA, USA | RL0275 | |
| Camera ambientale 6020-1 | Caron, Marietta, OH, USA | 6020-1 | |
| Centrifuga. | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Optima L-90K | |
| Ultra Centrifuge | |||
| ottico per microscopio ottico | CitoViva Technology Inc., Auburn, AL | ||
| Contatore di colonie | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | RE-3325 | |
| Congelatore | Haier, Brooklyn, NY, USA | HCMO50LA | |
| Ultra micropiastra lettore | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx 808 | |
| Auto Strip Washer | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx50 | |
| Pipette | Gilson, Pipetman, Francia | P100, P200, P1000 | |
| C24 Incubatore Shaker | New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA | Classic C24 | |
| Rocking Shaker | Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA | 55 | |
| piastre di Petri | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, Sanford, ME, USA | SG403 | |
| Fiasche per la coltivazione di colture | Corning Incorporated, Corning, NY, USA | 4995 | Palloni di Erlenmeyer PYREX da 250 ml |
| Spettrometro ottico Genesys 20 | Thermo Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti. | 4001 | |
| Sony DXC-33 Videocamera | Sony | ||
| Richardson diapositiva di prova | Microscopia elettronica Scienza, Hatfield, PA, USA | 80303 | |
| Sistema di purificazione dell'acqua Millipore | Direct-Q | ||
| Image-Pro Plus software | Media Cybernetics, MD, USA | ||
| Triple Beam Balance | OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA | ||
| Omogeneizzatore di tessuti, Dounce | VWR | 71000-518 |
Riferimenti
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