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Articolo metodologico

Misurazione del Tempo di sopravvivenza in

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DOI:

10.3791/54126

⸱

22 luglio 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Aquatic Bioscience, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 2School of Marine Biosciences, Department of Marine Biosciences, Kitasato University, 3Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory, 4School of Arts and Sciences, University of Houston-Victoria

In questo articolo

Sommario

I rotiferi sono zooplancton microscopici utilizzati come modelli in studi ecotossicologici e sull'invecchiamento. Qui forniamo un protocollo per la misurazione potente e riproducibile del tempo di sopravvivenza nei rotiferi Brachionus. La sincronizzazione delle condizioni di coltura nel corso di diverse generazioni è di particolare importanza perché la condizione materna influenza la storia di vita della prole.

Abstract

I rotiferi sono microscopici zooplancton cosmopoliti utilizzati come modelli negli studi ecotossicologici e sull'invecchiamento grazie ai loro numerosi vantaggi come la breve durata della vita, la facilità di coltura e la partenogenesi che consente la coltura clonale. Tuttavia, è necessaria cautela quando si misura il loro tempo di sopravvivenza in quanto è influenzato dall'età materna e dalle condizioni di alimentazione materna. Qui forniamo un protocollo per la misurazione potente e riproducibile del tempo di sopravvivenza nei rotiferi Brachionus a seguito di un'attenta sincronizzazione delle condizioni di coltura per diverse generazioni. Empiricamente, una scarsa sincronizzazione si traduce in una mortalità precoce e in una graduale diminuzione del tasso di sopravvivenza, con conseguente debole potenza statistica. Infatti, in tali condizioni, la restrizione calorica (CR) non è riuscita a prolungare significativamente la durata della vita di B. plicatilis, sebbene la longevità indotta dalla CR sia stata dimostrata con campioni di rotiferi ben sincronizzati in studi passati e presenti. Questo protocollo è probabilmente utile per altri modelli di invertebrati, tra cui il moscerino della frutta Drosophila melanogaster e il nematode Caenorhabditis elegans, perché in queste specie sono stati riportati anche effetti sull'età materna.

Introduzione

Rotiferi sono microscopici cosmopolita zooplancton (<1 mm), che costituiscono il phylum Rotifera 1. Hanno un semplice piano corpo composto di circa 1.000 cellule somatiche, nonché un apparato ciliare ruota-come caratteristica denominata corona, che viene utilizzato per la locomozione e l'alimentazione. La maggior parte dei rotiferi appartengono a classi Monogononta o Bdelloidea, che contengono circa 1.600 e 500 specie, rispettivamente 2. Rotiferi Monogonont hanno generalmente entrambe le fasi riproduttivo sessuale e asessuale (partenogenesi ciclico), mentre rotiferi bdelloid si riproducono per partenogenesi obbligatoria 3. È così possibile ottenere individui rotifere geneticamente identici, che assicura un'elevata riproducibilità in esperimenti. Inoltre, essi hanno diversi altri vantaggi come organismi modello, come una vita breve, facilità di coltura, la disponibilità dei dati di sequenza genomica e trascrittomica 4-7, ed una posizione filogenetica unica distante da unarthropods e nematodi 8. Rotiferi sono quindi promettenti modelli di invertebrati in ecologico, tossicologico, e l'invecchiamento studi 9-12.

Il tempo di sopravvivenza in condizioni di esposizione a stress ambientale o sostanze chimiche è un parametro spesso misurato in questi campi di ricerca 13-19. Tuttavia, la cautela è necessaria quando si misura il tempo di sopravvivenza dei rotiferi, perché è suscettibile a condizioni ambientali delle loro madri. Vale a dire, nel monogonont Manjavacas rotifero Brachionus, prole femminile da madri di età hanno una durata più breve rispetto a quelli da giovani madri; tuttavia, la restrizione calorica materna (CR) compensa in parte gli effetti deleteri di avanzata età materna 20. In B. plicatilis, materna CR fornisce longevità prole, il tempo di sopravvivenza a lungo sotto la fame, ed elevata resistenza stress ossidativo associato con una maggiore espressione di enzimi antiossidanti 21,22. L'effetto dell'età maternaè stato osservato anche in rotiferi bdelloid 23. Pertanto, le condizioni di rotiferi sperimentali devono essere attentamente sincronizzate su più generazioni prima di misurazioni del tempo di sopravvivenza.

Qui forniamo un protocollo per la misurazione del tempo di sopravvivenza in rotiferi Brachionus dopo la sincronizzazione delle condizioni di coltura per diverse generazioni. Digiuno intermittente (IF), una variazione di CR dove rotiferi vengono alimentati periodicamente, è stato applicato per rivelare l'effetto della sincronizzazione a causa degli effetti ben noti di IF sulla longevità 22,24.

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Protocollo

1. Preparazione di media

Nota: utilizzare metà diluita Brujewicz acqua di mare artificiale di salinità 16,5 ppt (PSU). Altri seawaters artificiali sono anche spesso utilizzate per cultura Brachionus rotiferi 25,26.

  1. Aggiungere 454 mM NaCl, 26 mM MgCl 2, 27 mM MgSO 4, 10 mM KCl, e 10 mM CaCl 2 al 4,5 l di acqua distillata (volume finale sarà di 5 L). In alternativa, utilizzare acqua di diluizione deionizzata invece di acqua distillata. Aggiungere CaCl 2 dopo aver sciolto tutti gli altri sali.
  2. Preparare la M NaHCO soluzione 0.48 3 stock (concentrazione 200x). Aggiungere 25 ml di esso alla soluzione precedente. La concentrazione finale di NaHCO 3 è di 2,4 mM.
  3. Preparare la soluzione di riserva M NaBr 0,4 (concentrazione 500x). Aggiungere 10 ml di esso alla soluzione precedente. La concentrazione finale di NaBr è 0,8 mM. Portare a 5 L con acqua distillata.
  4. Filtrare la soluzione con un filtro a membrana da 0,45 micron.Diluire due volte con acqua sterile prima dell'uso (v / v).
    Nota: E 'possibile effettuare una concentrazione 2x di Brujewicz acqua di mare artificiale come una soluzione madre.

2. Condizioni generali Culture

  1. Cultura laboratorio rilievo o rotiferi selvatici catturati in una sterile bicchiere da 100 ml tra 20 e 30 ° C. Temperature più elevate si traducono in durate di vita più brevi e la riproduzione accelerata. Utilizzare 25 ° C per la comodità di esperimenti. La densità rotifero o il volume di acqua di mare artificiale non è un grosso problema qui.
  2. Cultura specie di microalghe alimentari in acqua di mare artificiale 11. Vedere Snell et al. (2014) per i dettagli 11. In genere, usare Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 cellule / ml 27,28), T. suecica (~ 6 x 10 5 cellule / ml 25,29), e Nannochloropsis oculata (~ 7 x 10 6 cellule / ml 30,31). Dal momento che le alghe dieta (specie, la cultura Conditioni, composizioni biochimiche) influenza in modo significativo il tempo di sopravvivenza dei rotiferi Brachionus, utilizzare lo stesso lotto di microalga in tutti i gruppi sperimentali.
  3. Mantenere una popolazione magazzino di rotiferi in una cultura lotto alimentando e cambio di un supporto di tanto in tanto (ad esempio, da mangiare ogni 2 giorni e inoculare ogni settimana). Molti neonati e adulti che portano 2-3 uova possono essere osservati quando rotiferi sono in condizioni ottimali.
    Nota: Un modo alternativo per ottenere rotiferi sperimentali è a covare le uova di riposo. Rotiferi nati dalle uova di riposo sono considerati essere ben sincronizzati, e la loro durata di vita non è significativamente diversa da quella dei rotiferi nati da uova amictic 11. Tuttavia, rotiferi da uova di riposo iniziare la riproduzione prima di quelli da uova amictic. Quindi, cautela è necessaria per la misura delle loro caratteristiche riproduttive.

3. La sincronizzazione dei rotiferi da Pre-cultura

  1. Selezionare una singola rotifero dalla stock popolazione e cultura come descritto in 2.1-2.3 per stabilire una sottopopolazione che verrà utilizzato per esperimenti. In genere la cultura per due settimane.
  2. Raccogliere rotiferi uova recanti dalla sotto-popolazione (raccogliere un numero doppio di persone che verranno utilizzati per l'esperimento). Li cultura come singola coorte (densità: ~ 50 individui / ml) in una piastra di coltura a 6 così come descritto in 2.1-2.3 in un fresco supporto sotto alimentazione ad libitum. Controllare la densità di popolazione è importante perché il mezzo condizionato incide sulla fisiologia della riproduzione Brachionus rotiferi 32,33.
  3. Trasferire i neonati nati da uova prima degli adulti a terreni di coltura appena preparata. Ripetere questa procedura per 2-3 generazioni.
  4. Utilizzare neonati nati entro un certo periodo di tempo (ad esempio, <3 hr) per la misura del tempo di sopravvivenza. Per evitare possibili distorsioni nella scelta del singolo individuo, anche se molto improbabile, controllare la riproducibilità utilizzando diversi independenti sottopopolazioni.
    Nota: Come rotiferi solito riproducono solo asessuata in questa condizione, garantire l'assenza di maschi sono presenti in tutto l'esperimento. I maschi sono più piccoli di neonati e in genere si muovono più velocemente rispetto alle femmine. Femmine Mictic hanno differenti durate di vita da femmine amictic a determinate condizioni 29.

4. Le misurazioni del Tempo di sopravvivenza

  1. Luogo neonati in piatti di plastica (in genere 24 o 48 pozzetti, con ogni ben contenente 1 ml di acqua di mare artificiale).
  2. A intervalli hr 24, trasferire i rotiferi per terreni di coltura appena preparati o ad intervalli di 12 h se a temperatura elevata (30 ° C o superiore). Registrare il numero di figli e se ogni individuo è vivo o morto. Registrare il rotifero come morto quando il movimento delle ciglia della corona ha completamente fermato.
    Nota: Rotiferi spesso attaccano alle pareti laterali dei pozzi. pipettaggio delicato dell'acqua aiuta a trovarli. Se rotiferi non si trovano o are danneggiato accidentalmente dal pipettaggio, registrarli come "censurato", non come "morto".
  3. Rimuovere i neonati quando rotiferi sperimentali sono attivamente riprodursi. I neonati crescono rapidamente ed è a volte difficile distinguerli dai rotiferi sperimentali.

Analisi 5. I dati

  1. Creare la curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier (figure 1 e 2) riportando tasso di sopravvivenza cumulativo sull'asse Y e tempo sull'asse X. Questa è la rappresentazione più comune di dati di sopravvivenza. Utilizzare il log-rank test non parametrico (chiamato anche test di Mantel-Cox) per il confronto statistico del tempo di sopravvivenza 34. Il log-rank test è incluso anche in altri pacchetti statistici standard come JMP e R.
    Nota: non utilizzare t-test o analisi della varianza (ANOVA) seguita da parametrico confronto multiplo di Student distribuzione normale perché di solito non è soddisfatta da dati di sopravvivenza 35. Inoltre, questi methods non prendono gli individui Censored in considerazione. Mann-Whitney U test può essere utilizzato se non ci sono dati censurati.

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Risultati


La figura 1 mostra le curve rappresentative di sopravvivenza delle popolazioni mal sincronizzati (su due repliche). In questo esperimento, rotiferi erano o tutti i giorni della Fed [ad libitum (AL) gruppo] o ogni altro giorno (se il gruppo). La sopravvivenza mediana è stata di 13 e 18 giorni nel AL e se i gruppi, rispettivamente. Sebbene sia ben noto che se prolunga la vita della rotifero, questo esperimento non ha rilevato una differenza statisticamente s...

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Discussione

L'attuale protocollo descrive un metodo per misurare il tempo di sopravvivenza in rotiferi Brachionus. Il passo fondamentale è la sincronizzazione delle condizioni di rotiferi per diverse generazioni. Quando rotiferi sperimentali sono ben sincronizzati, una curva di sopravvivenza che tipo tipico è osservata con molto poco mortalità precoce come riportato in diversi studi precedenti 18,24,37,38. Le deviazioni standard del loro tempo di sopravvivenza di conseguenza diventano più piccoli rispetto ai...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Siamo grati a George Jarvis, Martha Bock, e Bette Hecox-Lea, Marine Biological Laboratory, per il loro aiuto in riprese.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cloruro di sodioWako190-13921
Cloruro di magnesioWako136-03995
Solfato di magnesioWako131-00427
Cloruro di potassioWako168-22111
Cloruro di calcioWako035-00455
Bicarbonato di sodioWako199-05985
Bromuro di sodioWako190-01515
Filtro a membrana (0,45 &; micro; m dimensione dei pori)MilliporeHAWP04700
Piastra di coltura, 6 pozzetti, non trattataThomas Scientific6902D01a fondo piatto
, 48 pozzetti, non trattataThomas Scientific6902D07Tetraselmo a fondo piatto
, LivingCarolina Biological Supply Company152610
PRISM 6GraphPadSoftware versione 6.0d
Piastra di coltura

Riferimenti

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