Qui vi presentiamo un protocollo per indagare genoma metilazione del DNA in studi clinici di screening dei pazienti su larga scala utilizzando il metil-Binding sequenziamento del DNA di cattura (MBDCap-ss o MBD-ss), la tecnologia e la successiva analisi bioinformatica pipeline.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente
In questo articolo
Sommario
Abstract
La metilazione è una delle modificazioni epigenetiche essenziali al DNA, che è responsabile per la precisa regolazione dei geni necessari per lo sviluppo stabile e differenziazione dei diversi tipi di tessuto. Disregolazione di questo processo è spesso il segno distintivo di varie malattie come il cancro. Qui, si delineano uno dei recenti tecniche di sequenziamento, Metil-Binding DNA Capture sequenziamento (MBDCap-ss), utilizzato per quantificare la metilazione in vari tessuti normali e di malattia per i grandi coorti di pazienti. Descriviamo un protocollo dettagliato di questo approccio arricchimento affinità con un oleodotto bioinformatica per raggiungere quantificazione ottimale. Questa tecnica è stata utilizzata per sequenziare centinaia di pazienti in vari tipi di cancro come parte del progetto 1.000 methylome (Cancer Methylome System).
Introduzione
Regolazione epigenetica di geni attraverso metilazione del DNA è uno dei meccanismi essenziali necessari per determinare il destino della cellula dalla differenziazione stabile di diversi tipi di tessuto nel corpo 1. Disregolazione di questo processo è stato conosciuto per causare varie malattie tra cui il cancro 2.
Questo processo comporta principalmente l'aggiunta di gruppi metilici sul residuo citosina in dinucleotidi CpG del DNA 3. Esistono alcune tecniche diverse attualmente utilizzate per indagare questo meccanismo, ciascuno con i propri vantaggi come indicato in molti studi 2-8. Qui discuteremo una di queste tecniche chiamati....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti i tessuti sono ottenuti a seguito approvazione del comitato Institutional Review Board e quando tutti i partecipanti acconsentito ad entrambe le analisi molecolari e studi di follow-up. I protocolli sono approvati dal Comitato studi sugli esseri umani presso l'Università del Texas Health Science Center a San Antonio.
1. Metil-legame al DNA di cattura (MBDCap)
- Raccolta dei campioni e l'isolamento del DNA
- Raccogliere tumore alla rinfusa o normali campioni di tessuto da campioni di tessuto inclusi in paraffina paziente.
- Utilizzare un mini DNA kit commerciale per isolare DNA genomico da campioni di tess....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Abbiamo usato MBDCap-seq per studiare alterazioni di metilazione del DNA in un gran numero di pazienti da diversi tipi di cancro compresi seno 12, dell'endometrio 13, prostata 14, e tumori del fegato, tra gli altri. Qui mostriamo alcune informazioni dallo studio del cancro al seno pubblicato di recente 12. In questo caso, abbiamo utilizzato l'intero approccio di sequenziamento del genoma per identificare isole CpG che sono differenziale metilato nei tumori rispetto al normale nelle diverse.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La tecnica MBDCap-seq è un approccio arricchimento affinità 3, considerata un'alternativa economica nell'ambito delle indagini coorti con un grande numero di pazienti 15. Il gasdotto presentato qui descrive un approccio globale da approvvigionamento di esempio per l'analisi e l'interpretazione dei dati. Uno dei passi più importanti è la creazione di una procedura di amplificazione PCR per migliorare l'efficienza della PCR delle regioni GC arricchito nel genoma come questo è dove si verifica la metil.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Questo protocollo è stato sviluppato nei laboratori del Dr. Tim Huang e il Dr. Victor Jin presso l'Università del Texas Health Science Center a San Antonio.
Ringraziamenti
Il lavoro è sostenuto da CPRIT Research Training Award RP140105, così come in parte sostenuto da Stati Uniti National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni R01 GM114142 e da William & Ella Owens Medical Research Foundation.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di arricchimento del DNA Methylminer | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Dispositivo di sonicazione | diagenode | B01020001 | |
| 3 M acetato di sodio, pH 5,2 | Sigma | S7899 | 100 mL |
| SPRIworks Sistema di libreria di frammenti I | Beckman Coulter | A50100 | Sistema di costruzione di librerie completamente automatizzato |
| Adattatori Primer | Bioo Scientific | 514104 | Miscela di primer per PCR |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Sistema di quantificazione fluorimetrica |
| Miscela master per PCR | KAPA scientific | KK2621 | Miscela master per PCR |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Perle di purificazione per PCR Tampone |
| EB | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sistema di sequenziamento | Illumina |
Riferimenti
- Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
- Nair, S. S., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
