Le mucine sono glicoconiugati ad alto peso molecolare, con dimensioni che vanno da 0,2 a 200 megadalton (MDa). A causa delle loro dimensioni, le mucine non penetrano nei gel di poliacrilammide convenzionali e richiedono pori più grandi per la separazione. Forniamo un protocollo dettagliato per l'elettroforesi su gel di mucina agarosio per valutare la quantificazione relativa e studiare l'assemblaggio del polimero.
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Articolo metodologico
Mucina Agarosio elettroforesi su gel: Western Blotting per glicoproteine ad alto peso molecolare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mucine, le proteine pesantemente glicosilata che rivestono le superfici mucose, si sono evoluti come componente chiave di difesa innata proteggendo l'epitelio contro gli agenti patogeni invasori. Il ruolo principale di queste macromolecole è di facilitare la cattura delle particelle e la clearance favorendo la lubrificazione della mucosa. Durante la sintesi proteica, mucine subiscono intensa O-glicosilazione e multimerizzazione, che aumentano notevolmente la massa e le dimensioni di queste molecole. Queste modificazioni post-traduzionali sono critici per le proprietà viscoelastiche del muco. Come risultato della complessa natura biochimica e biofisica di queste molecole, lavorando con mucine fornisce molte sfide che non possono essere superati mediante metodi di analisi proteica convenzionali. Per esempio, il loro alto peso molecolare impedisce migrazione elettroforetica mediante gel di poliacrilammide regolari e la loro natura appiccicosa provoca l'adesione al tubo sperimentale. Tuttavia, indagando il ruolo di mucine nella salute(Ad es., Mantenendo l'integrità della mucosa) e malattia (ad es., Iperconcentrazione, mucostasis, cancro) ha recentemente guadagnato interesse e mucine sono oggetto di indagine come un obiettivo terapeutico. Una migliore comprensione della produzione e della funzione di macromolecole mucina può portare ad approcci farmaceutici innovativi, ad esempio, inibitori di mucina esocitosi di granuli e / o agenti mucolitici. Pertanto, i protocolli coerenti e affidabili per indagare la biologia mucina sono fondamentali per il progresso scientifico. Qui, descriviamo i metodi convenzionali per separare mucina macromolecole mediante elettroforesi utilizzando un gel, il trasferimento della proteina in membrana di nitrocellulosa, e rilevare il segnale con anticorpi specifici mucina così come lettore di gel a fluorescenza a raggi infrarossi. Queste tecniche sono ampiamente applicabile per determinare mucina quantificazione, multimerizzazione e per testare gli effetti dei composti farmacologici su mucine.
Introduzione
Mucine sono normalmente prodotti da superfici mucose che rivestono le cavità esposti all'ambiente esterno (ad es., Respiratorio, digestivo, tratto riproduttivo, superficie oculare), così come gli organi interni (ad esempio, pancreas, della cistifellea, ghiandole mammarie). La presenza di queste glicoproteine mantiene l'idratazione superficiale e forma una barriera fisica contro i patogeni. Anche se la produzione di mucina è essenziale per la salute della mucosa, mucina iperconcentrazione e / o muco aberranti può portare a ostruzione del dotto, la colonizzazione batterica e infiammazione cronica, che può causare danni ai tessuti irreversibi....
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Protocollo
1. Preparare buffer per Mucin Gel Western Blotting
- Preparare 1 litro di 50x TAE (Tris-acetato-EDTA) buffer.
- In 700 ml di acqua distillata (dH 2 O) aggiungere 242 g di Tris base (0,4 M), 57,1 g di acido acetico glaciale (pesare liquido) (0,2 M) e 14.61 g di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (50 mM).
- Regolare il pH a 8,0 e rendere il volume fino a 1 litro con dH 2 O.
- Preparare 10 ml di 10x tampone di caricamento.
- Preparare 5 ml di tampone 1x TAE. A tale scopo, aggiungere 5 ml di glicerolo (50%), 25 mg di blu di bromofenolo (0,25%) e 100 mg di sodio dodecil solfato (SDS) (1%).
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Risultati
Mostriamo risultati rappresentativi di espressione mucina seguenti elettroforesi su gel di agarosio in BALF dai polmoni di topi (Figura 1). In questo esempio, abbiamo usato il gel per mostrare upregulation di mucina produzione di IL-13 dopo il trattamento del modello di topo Tg-MUC5AC. Il Western blot mostra una rappresentazione visiva di espressione mucina, che può essere utilizzato per l'analisi quantitativa di multimero o l'intensità del segnale di banda monom.......
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Discussione
Il protocollo di mucina Western blotting descritto in questo video combina tecniche convenzionali utilizzate in biologia molecolare per separare e trasferire grandi macromolecole, come il DNA, con tecniche regolari per il rilevamento di proteine, cioè., Immunoblotting. La stessa tecnica può essere applicata per studiare la biologia di glicosaminoglicani complessi, quali la ripartizione di alta peso molecolare dell'acido ialuronico 18. Sebbene questa tecnica potrebbe essere utilizzata in un'am.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. John Sheehan e la Dr. Lubna Abdullah per la loro guida e mentoring che sono stati fondamentali per il completamento di questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi del National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) e della Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey è supportata da una borsa di studio NHMRC Early Career Research.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1 kg |
| Acido Acetico Glaciale | Sigma | ARK2183-1L | 1 L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100 g |
| Glicerolo | Fisher | BP229-1 | 1 L |
| Bromofenolo Blu | Sigma | 114391-5g | 5 g |
| SDS (Sodio Dodecil Solfato) | Sigma | L6026-50g | 50 g |
| 20x SSC (citrato salino di sodio) tampone | Promega | V4261 | 1 L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1 kg |
| citrato trisodico (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1 kg |
| 10 mM DTT (ditiotreitolo) | Sigma | D0632 | 25 g |
| Latte in polvere | Saco | Latte in polvere scremato istantaneo | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato Dulbecco (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500 ml |
| Anticorpo primario di capra anti-GFP (campioni di topo) | Anticorpi e saggi Rockland | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Anticorpo primario di coniglio (campioni di topo) | UNC | ||
| H300 Anticorpi primari anti-MUC5B (campioni umani) | Santa Cruz | sc-20119 | 200 μ g |
| 45M1 Anticorpi primari anti-MUC5AC (campioni umani) | Abcam | ab3649 | 100 μ g |
| Asino Anti-coniglio 800CW IR Colorante | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0,5 mg |
| Asino Anti-topo 680LT IR Colorante | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0,5 mg |
| Elettroforesi Gel Box e vassoio di colata | Sistemi di separazione | ||
| Scatola di alimentazione | Biorad | Modello 200/20 | |
| Carta assorbente a membrana | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Carta e membrana in nitrocellulosa | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 V | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Sistema di fluorescenza a infrarossi | LI-COR Biosciences |
Riferimenti
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotei....
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Ristampe e permessi
