Articolo metodologico

L'impianto e la registrazione di Wireless Elettroretinogramma e potenziale visivo evocato ratto conscio

DOI:

10.3791/54160

⸱

29 giugno 2016

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1Department of Optometry and Vision Sciences, University of Melbourne, 2Pfizer Neusentis

In questo articolo

Sommario

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Mostriamo le procedure di impianto e di registrazione chirurgiche per misurare i segnali elettrofisiologici visivi dall'occhio (elettroretinogramma) e il cervello (visivo potenziale evocato) nei ratti coscienti, che è più simile alla condizione umana in cui le registrazioni sono effettuate senza anestesia confonde.

Abstract

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L'elettroretinogramma pieno campo (ERG) e potenziali evocati visivi (PEV) sono strumenti utili per valutare retina e l'integrità via visiva sia in ambito clinico e di laboratorio. Attualmente, le misure ERG e PEV preclinici sono eseguiti con l'anestesia per garantire posizionamento degli elettrodi stabili. Tuttavia, la presenza di anestesia ha dimostrato di contaminare le normali risposte fisiologiche. Per superare questi confonde anestesia, sviluppiamo una nuova piattaforma per saggiare ERG e PEV nei ratti coscienti. Gli elettrodi sono impiantati chirurgicamente sotto-conjunctivally sull'occhio per saggiare la ERG e epidurale sopra la corteccia visiva per misurare il VEP. Una gamma di ampiezza e di sensibilità / parametri di temporizzazione sono analizzati sia per la ERG e PEV ad aumentare le energie luminose. I segnali ERG e PEV sono dimostrato di essere stabile e ripetibile per almeno 4 settimane impiantazione post-chirurgico. Questa capacità di registrare i segnali ERG e PEV senza anestesia confonde nelle s precliniciEtting dovrebbe fornire la traduzione superiore ai dati clinici.

Introduzione

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L'ERG e VEP sono minimamente invasiva in strumenti vivo per valutare l'integrità delle vie della retina e visivi, rispettivamente, sia in laboratorio e clinica. Il tutto campo ERG produce una forma d'onda caratteristica che può essere suddiviso in diverse componenti, con ogni elemento che rappresentano diverse classi di cellule del 1,2 percorso della retina. Il classico pieno campo ERG forma d'onda consiste di una pendenza iniziale negativo (a onda), che ha dimostrato di rappresentare fotorecettori attività post esposizione alla luce 2-4. L'a-onda è seguita da una sostanziale forma d'onda positiva (b-wave), che riflette l'attività elettrica di retina centrale, prevalentemente le cellule ON-bipolari 5-7. Inoltre, si può variare l'energia luminosa e inter-stimolo-intervallo per isolare cono dalle risposte asta 8.

Il flash VEP rappresenta potenziali elettrici del tronco della corteccia cerebrale e visiva in risposta alla stimolazione della retina luce9,10. Questa forma d'onda può essere suddiviso in componenti precoce e tardiva, con la componente precoce che riflette l'attività dei neuroni della via retino-genicolo-striata 11-13 e alla fine del componente che rappresenta l'elaborazione corticale esibito in varie lamine V1 nei ratti 11,13. Pertanto la misurazione simultanea del ERG e PEV ritorna valutazione globale delle strutture coinvolte nel percorso visivo.

Attualmente, al fine di registrare elettrofisiologia negli animali, anestesia viene impiegato per consentire il posizionamento stabile di elettrodi. Ci sono stati tentativi di misurare ERG e PEV nei ratti coscienti 14-16 ma questi studi impiegata una configurazione cablata, che può essere ingombrante e può portare a stress degli animali, limitando il movimento degli animali e il comportamento naturale 17. Con i recenti progressi nella tecnologia wireless, tra cui una maggiore miniaturizzazione e la durata della batteria, è ora possibile implementare un approccio telemetria per ERG und registrazione VEP, diminuendo lo stress associato con le registrazioni cablate e migliorare la redditività a lungo termine. Implantologia stabili completamente interiorizzato di sonde di telemetria hanno dimostrato di essere efficace per il monitoraggio cronico della temperatura, la pressione del sangue 18, l'attività 19 così come elettroencefalografia 20. Tali progressi nella tecnologia sarà anche aiutare con ripetibilità e stabilità delle registrazioni coscienti, aumentando l'utilità della piattaforma per gli studi cronici.

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Protocollo

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Etica dichiarazione: Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con il Codice australiano per la cura e l'uso di animali a scopi scientifici (2013). approvazione etica animale è stato ottenuto dal Comitato Etico degli animali, Università di Melbourne. I materiali sono qui per esperimenti di laboratorio solo, e non destinati ad uso medico o veterinario.

1. Gli elettrodi Preparazione

Nota: Un trasmettitore a tre canali è usato per l'impianto chirurgico che consente 2 ERG e la registrazione 1 VEP essere condotta simultaneamente. I tre attivi e non attivi tre elettrodi devono essere pre-modellato in una forma ad anello prima dell'impianto in modo da collegare ad occhio. Ai fini dell'identificazione, il produttore ha racchiuso elettrodi attivi a metà bianco, guaine in plastica colorata mezzo mentre gli elettrodi inattive sono coperti in guaine colorate piene. L'elettrodo di massa (guaina di plastica trasparente) viene lasciato inalterato. Per tutti elettr attivo e inattivocondotta odi i punti 1.1, 1.2, 1.3 e 1.7.

  1. Districare il doppio elettrodo di acciaio inossidabile flessibile con due belle pinze a punta.
  2. Tagliare uno dei filoni in acciaio inox (circa 1 cm dalla punta), lasciando un unico filo più lungo rettilineo rimanente per modellare l'elettrodo ad anello.
  3. Piegare il singolo filo di acciaio inossidabile di nuovo su se stesso e torsione, formando un anello liscio sulla punta dell'elettrodo.
  4. Per elettrodi attivi moda ERG questo ciclo ~ 0,2 - 0,5 mm di diametro ruotando la base del ciclo (per gli scopi descritti qui, modellare due elettrodi attivi in ​​questo modo per registrare ERG da entrambi gli occhi), e per la ERG inattivo e elettrodi PEV rendono il diametro anello ~ 0,8 mm di diametro (in questo esempio, fare questo per un elettrodo VEP attiva e tutte tre elettrodi inattive).
  5. Agganciare circolare VEP elettrodo attivo intorno una vite acciaio inossidabile (diametro 0,7 mm lunghezza 3 mm) per l'elettrodo appoggia contro la testa della vite.
  6. Hook i 3 elettrodi inattivi (2 ERG, 1 PEV) intorno una seconda vite in acciaio inox (diametro 0,7 mm lunghezza 3 mm).
  7. Tirare il manicotto di plastica in avanti sopra le estremità taglienti del filo in acciaio inox a due per ridurre l'irritazione.
  8. Sterilizzare i trasmettitori telemetrici immergendola in 2% glutaraldeide per più di 10 ore a circa 25 ° C. Risciacquare il trasmettitore con soluzione salina sterile per 3 volte.

2. Trasmettitore impianto

  1. Preparazione degli animali
    1. Disinfettare l'area chirurgica prima sperimentazione pulendo con il 70% di etanolo. Autoclave tutte apparecchi chirurgici prima dell'uso e mantenere in apparecchiature clorexidina quando non in uso durante la chirurgia. Coprire l'animale con un telo chirurgico durante l'intervento chirurgico per mantenere un ambiente sterile. Assicurarsi che tutti gli sperimentatori indossano maschere chirurgiche, guanti e camici sterili.
    2. Indurre l'anestesia con 1,5 - 2% isoflurano, ad una portata di 3 l / min e manutenzione suned a 1,5 - 2% a 2 L / min durante l'intervento chirurgico. Confermare la sufficiente profondità di anestesia dall'assenza di un riflesso pedale sul pizzicare il muscolo tra le dita.
    3. Rasatura a 40 mm Area x 30 mm sopra l'addome dall'alto all'inguine allo sterno.
    4. Rasatura 30 mm Area x 20 mm sopra la fronte, posteriormente agli occhi e anteriore alle orecchie.
    5. Disinfettare le due aree rasate. Per la zona della fronte disinfettare con 10% povidone-iodio tre volte (evitare l'uso di antisettici a base alcolica per l'area vicino all'occhio, essere coerente con la norma di condotta stabilito dalla Association of tecnologi chirurgici). Sopra l'addome disinfettare con 10% di iodio povidone e il 70% di etanolo.
    6. Applicare 1 goccia di proximetacaina alla cornea per ulteriori anestesia topica.
    7. Applicare 1 goccia di sodio carbossimetilcellulosa alla cornea per evitare l'essiccazione degli occhi.
  2. impianto chirurgico
    1. Effettuare una incisione 10 millimetrisulla testa lungo la linea mediana verticale tra le orecchie con un bisturi chirurgico.
    2. Eseguire un'incisione 5 mm addome attraverso lo strato di pelle lungo la linea mediana sotto lo sterno.
    3. Tunnel a 5 mm di diametro cannula sottocutanea dall'incisione addome per l'incisione testa.
    4. Far passare i fili degli elettrodi (3 attivi e 3 inattivo) del trasmettitore attraverso la cannula dall'addome alla testa.
    5. Lasciare l'elettrodo di riferimento con la base del trasmettitore e coprire la punta dell'elettrodo con garza asettica.
    6. Coprire le punte degli elettrodi (3 attivi e inattivi 3) con garza asettica.
    7. Fissare la testa del topo ad una piattaforma stereotassico.
    8. Estendere l'incisione fronte a 30 mm di lunghezza con le forbici chirurgiche.
    9. Esporre area chirurgica ritraendo la pelle sciolto con 2 punti di sutura (3 - 0) a ~ 3 e 09:00.
    10. Raschiare il periostio sovrastante il cranio con garza sterile per esporre Bregma, lambda e della linea mediana suture.
    11. Praticare due fori attraverso il cranio al VEP attiva (7 millimetri ventrale a Bregma 3 millimetri laterale a linea mediana) e inattivi (5 mm rostrale al Bregma sulla linea mediana) stereotassica coordinate.
    12. Fissare VEP elettrodi attivi e inattivi con le viti pre-attached in acciaio inox (diametro 0,7 mm lunghezza 3 mm) per il cranio con un piccolo cacciavite a ~ 1 mm di profondità nei fori predefiniti. Questo ancora la vite all'osso senza danneggiare il tessuto corticale sottostante.
    13. Per impiantare gli elettrodi attivi ERG utilizzare un 8-0 sutura per rientrare temporaneamente la palpebra superiore.
    14. Inserire un 16 a 21 G cannula sottocutanea da dietro l'occhio attraverso la fornice congiuntivale superiore.
    15. Rimuovere l'ago guida.
    16. Feed l'elettrodo attivo attraverso il catetere di plastica accorciata dalla fronte verso l'occhio. Quindi rimuovere il catetere di plastica.
    17. Utilizzare una sutura temporanea (8 - 0.), che viene infilato attraverso il loop elettrodo, per evitare che i electrode dalla scomparsa di nuovo nel tunnel.
    18. Eseguire un'incisione 0,5 millimetri sulla congiuntiva superiore a ore 12, 1 mm dietro limbus. Utilizzare smussa per esporre la sclera sottostante.
    19. Impiantare un 8-0 o 9-0 sutura immediatamente dietro il limbus a metà spessore sclerale.
    20. Rimuovere sutura temporanea da ERG elettrodo attivo.
    21. Ancorare l'elettrodo attivo ERG alla metà sclerale sutura spessore legando 3 nodi consecutivi che assicurano la punta dell'elettrodo è situato vicino al limbus.
    22. Chiudere lo sportello congiuntivale con 1 o 2 punti staccati (8 - 0 a 9 - 0). Assicurarsi che la congiuntiva copre completamente l'elettrodo ERG per migliorare il comfort.
    23. Rimuovere la palpebra scomparsa di sutura.
    24. Ripetere la procedura per l'occhio controlaterale.
    25. Applicare il gel cianoacrilato sul cranio per fissare tutte le viti inox e fili degli elettrodi. Assicurarsi che gli elettrodi attivi ERG non sono tirati troppo stretto prima di fissare a eni movimenti degli occhi capaci.
    26. Chiudere la ferita alla testa con un non-assorbibile 3-0 di sutura.
    27. Ruotare roditore per esporre zona addominale. Allungare l'incisione cutanea addominale a 40 mm lungo la linea alba con le forbici chirurgiche.
    28. Effettuare una incisione 35 millimetri attraverso la parete muscolare interna per esporre la cavità addominale interna.
    29. Utilizzando due punti di sutura (3 - 0) fissare il corpo del trasmettitore a parete addominale interna lato destro dell'animale. Evitare il contatto con il fegato.
    30. Loop l'elettrodo di massa e sicuro in questa forma con una sutura (3-0). Posizionarlo libero di fluttuare nella cavità addominale.
    31. Chiudere il peritoneo con una sutura continua (3-0).
    32. Chiudere l'incisione pelle con punti staccati (3 - 0).
  3. Cure post-operatorie
    1. Monitorare l'animale fino a che non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Casa l'animale singolarmente dopo l'intervento.
    2. somministrare carprofen sottocutanea per l'analgesia (5 mg / kg) una volta al giorno per 4 giorni.
    3. Aggiungere antibiotici per via orale profilattici (Enrofloxin, 5 mg / kg) per l'acqua potabile per 7 giorni dopo l'intervento chirurgico.
    4. Applicare una pomata antinfiammatoria per siti di incisione della pelle per ridurre l'irritazione per i primi 7 giorni dopo l'intervento chirurgico.

3. Comportamento ERG e PEV Recordings nel ratto conscio

  1. Scuro adattarsi animale per 12 ore prima di registrazioni ERG e PEV
  2. Condurre tutte le manipolazioni sperimentali sotto illuminazione fioca rosso (17,4 cd.m -2, λ max = 600 nm)
  3. Applicare anestesia topica (0,5% proximetacaina) e dilatando (0,5% tropicamide) scende alla cornea.
  4. Guida il roditore consapevole in una misura, restrainer chiaro.
    Nota: La lunghezza di questo tubo di plastica può essere regolata per accogliere ratti di dimensioni diverse con il diametro complessivo fissato a 60 mm. L'estremità anteriore del dispositivo è rastremato per minimizzare mo testavimento e contiene perforazioni per consentire la respirazione normale. Questo fronte affusolata consente l'allineamento e la stabilizzazione della testa e gli occhi del ratto all'apertura della sfera Ganzfeld. Si noti che il roditore è stato acclimatato al dispositivo di immobilizzazione (da 3 a 5 volte) prima di un intervento chirurgico.
  5. Posizionare il roditore anteriore della ciotola Ganzfeld con gli occhi allineati con l'apertura del contenitore.
  6. Accendere il trasmettitore a permanenza passando un magnete all'interno di ~ 5 cm del trasmettitore. Verificare che il trasmettitore è acceso controllando la luce LED di stato sulla base del ricevitore.
  7. Raccogliere segnali su un intervallo di energie luminose (cioè, -5.6 a 1,52 log cd.sm -2) come descritto in precedenza 21. In breve, più segnali medi a livello commutazione luce (~ 80 ripetizioni), inferiore a energie più luminosi luminosi (~ 1 ripetizione). A poco a poco allungare l'intervallo interstimulus da 1 a 180 secondi dal più debole al livello di luce più brillante.
  8. Per isolare l'asta ERGe le risposte cono utilizzano un paradigma twin-Flash 8. Ad esempio, avviare due flash a 1,52 log cd.sm -2 con un intervallo di 500 msec inter-stimolo in-between.
  9. Per registrare i segnali VEP, media di 20 ripetizioni alle energie più luminoso luminosi (cioè 1,52 log cd.sm -2, 5 sec intervallo inter-stimolo).
  10. Per valutare la stabilità dell'impianto, che viene valutato dalla variabilità del segnale nel tempo, condurre ERG e PEV registrazioni 7, 10, 14, 21 e 28 giorni post-intervento chirurgico.
  11. Dopo periodo sperimentale, eutanasia topi mediante iniezione intracardial di pentobarbiturate (1,5 ml / kg) dopo ketamina: anestesia xilazina (12: 1 mg / kg).

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Risultati

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La risposta fotorecettore viene analizzato montando una gaussiana ritardata al bordo anteriore del tratto discendente iniziale della risposta ERG gli ultimi 2 energie luminose (1,20, 1,52 log CSM -2) per ciascun animale, in base al modello di agnello e Pugh 22, formulato da Hood e Birch 23. Questa formula restituisce una ampiezza ed un parametro di sensibilità, (Figura 1C e 1D, rispettivamente). Una funzione iperbolica fu...

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Discussione

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A causa della natura mini-invasiva di elettrofisiologia visiva, ERG e PEV registrazioni in pazienti umani sono condotte in condizioni coscienti e richiedono solo l'uso di anestetici topici per il posizionamento degli elettrodi. Al contrario, elettrofisiologia visiva nei modelli animali è convenzionalmente condotto in anestesia generale per consentire il posizionamento degli elettrodi stabile, eliminando gli occhi del corpo e movimenti volontari. Tuttavia, anestetici generali comunemente utilizzati alterano le rispos...

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Dichiarazioni

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RG e RF sono dipendenti del finanziatore commerciale di questa ricerca (Pfizer Neusentis e Pfizer Global Research). MI è stato un dipendente di Pfizer Global Research durante questa ricerca ed è attualmente un dipendente di Proteostasis Therapeutics (Cambridge, USA).

Ringraziamenti

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JC desidera ringraziare il David Hay Memorial Fund, l'Università di Melbourne per il sostegno finanziario nella stesura di questo manoscritto. Il finanziamento per questo progetto è stato fornito da una sovvenzione ARC Linkage 100200129 (BVB, AJV, CTON).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BioamplificatoreADInstrumentsML 135Amplifica i segnali ERG e VEP
Carbossimetilcellulosa sodica 1,0%AllerganCAS 0009000-11-7Mantiene l'idratazione corneale durante l'intervento chirurgico
Carprofene 0,5%Pfizer Animal Health GroupCAS 53716-49-7Analgesia post-operatoria, somministrata con soluzione salina iniettabile per il reintegro dei liquidi
Cloresadina 0,5%Orion Laboratories27411, 80085Disinfezione dello strumento chirurgico
Attivatore di gel cianoacrilatoComponenti RS473-439Asciuga rapidamente il gel cianoacrilato
Gel cianoacrilatoComponenti RS473-423Fissare le viti in acciaio inossidabile al cranio
Fresa dentaleStorz Instruments, Bausch e LombE0824ATesta di trapano in miniatura di ~ 0,7 mm di diametro per praticare un piccolo foro nel cranio su ciascun emisfero per impiantare viti VEP
TrapanoBoschDremel serie 300Trapano automatico per trapanazione
EnrofloxinTroy LaboratoriesPerno antibiotico profilattico chirurgia
Ganzfeld sfera integratriceSoluzioni fotometriche InternationalStimolatore di luce progettato su misura: diametro 36 mm, apertura 13 cm
Tamponi di garzaMultigate Medical Products Pty Ltd57-100BAsciuga l'incisione chirurgica e la superficie del cranio esposta durante l'intervento
chirurgico Isoflurano 99,9%Abbott Australasia Pty LtdCAS 26675-46-7Nome proprietario: Isoflo(TM) Anestetico per inalazione. Anestetico per inalazione di grado farmaceutico miscelato con ossigeno gassoso per la chirurgia dell'impianto di elettrodi VEP
Unguento KenacombAspen Pharma Pty LtdPer ridurre l'irritazione e il prurito della pelle dopo l'intervento chirurgico
Luxeon LEDPhillips Lighting Co.Per la stimolazione della luce, venti LED da 5 W e uno da 1 W, controllati dal software Scope
Ago (macrochirurgia)World Precision Instruments501959per suturare la chirurgia addominale e della testa, utilizzato con sutura 3 - 0, ago per occhiello, bordo tagliente 5/16 cerchio Misura 1, 15 mm
Porta ago (macrochirurgia)World Precision Instruments500224Per tenere l'ago durante la chirurgia
addominale e della testaPorta ago (microchirurgia)World Precision Instruments555419NTPer tenere l'ago durante la chirurgia oculare
Catetere OptivaSmiths Medical International LTD16 o 21 GGuida gli elettrodi attivi corneali dal cranio alla congiuntiva
Iodio povidone 10%Sanofi-AventisCAS 25655-41-8Nome proprietario: Betadine, Antisettico per preparare la pelle rasata per l'intervento chirurgico 10%, 500 ml
Sistema di acquisizione dati PowerlabADInstrumentsML 785Acquisisci il segnale dal trasmettitore di telemetria, abbinato al convertitore di dati di telemetria
Proxymetacaine 0.5%Alcon Laboratories CAS 5875-06-9Analgesia oculare topica
Cutom delsistemadi ritenuta realizzato La parte anteriore del sistema di ritenuta è affusolata per ridurre al minimo il movimento della testa, la lunghezza può essere regolata per adattarsi a diverse lunghezze del ratto, il diametro complessivo è di 60 mm.
Lama ScapelR.G. Medical SuppliesSNSM0206Per incisioni chirurgiche
Forbici (macrochirurgia)World Precision Instruments501225per il taglio di tessuti su abete e forbici per la fronte
(microchirurgia)World Precision Instruments501232Per sezionare la congiuntiva per l'attacco dell'elettrodo
Scope SoftwareADInstrumentsversione 3.7.6Attiva contemporaneamente lo stimolo tramite il sistema ADI Powerlab e raccoglie i dati
Rasoio OsterGolden A5Rasatura della pelliccia dalle aree chirurgiche
Viti streel in acciaio inox MicroFastenersL001.003CS304diametro albero 0,7 mm, lunghezza 3 mm 
Telaio stereotassicoDavid KopfModello 900Uno strumento stereotassico per piccoli animali per localizzare i punti di riferimento dell'impianto sul cranio
Telo chirurgicoForniture mediche vitaliGM29-612EEGarantire un ambiente sterile durante l'intervento chirurgico
Sutura (macrochirurgia)Aghi medici Ninbo3-0per sutura chirurgia addominale e della testa, seta sterile intrecciata, ago da sutura da 60 cm
( microchirurgia)Aghi medici Ninbo8-0 o 9-0per chirurgia oculare tra cui, elettrodo di sutura alla sclera e chiusura della ferita congiuntivale, sutura in nylon, 3/8 cerchio 1 & volte; 5, 30 cm
Convertitore di dati di telemetria DataSciences InternationalR08consente al segnale di telemetria di interfacciarsi con il software di raccolta dati
Matrice di scambio dati di telemetriaDataSciences InternationalRaccoglie i dati dai trasmettitori, li accoppia con il ricevitore
Ricevitore di dati di telemetriaDataSciences InternationalRPC-1Riceve i dati di telemetria dal trasmettitore
telemetriaDataSciences Trasmettitore diF50-EEEa 3 canali
Tropicamide 0,5%Alcon Laboratoriesper dilatazione dell'iride
(macrochirurgia)World Precision Instruments500092Manipolare i tessuti durante la chirurgia addominale e della testa
Pinzette (microchirurgia)World Precision Instruments500342Manipolare i tessuti durante la chirurgia oculare
di telemetria internazionale Pinzette

Riferimenti

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