Articolo metodologico

Miglioramento Tecnica Swiss-laminazione per intestinale Preparazione del tessuto per immunoistochimica e analisi immunofluorescenza

DOI:

10.3791/54161

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13 luglio 2016

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1Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, 2Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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accurata identificazione e localizzazione delle cellule epiteliali lungo il rivestimento della mucosa intestinale sono essenziali per definire diverse linee cellulari. Corretta l'imaging dei tessuti intestinali è di fondamentale importanza per l'identificazione dei pattern di espressione della proteina con la massima risoluzione. Questo studio si propone di delineare i metodi e le condizioni ottimali per i tessuti intestinali lavorazione del mouse.

Abstract

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Comprendere il ruolo dei fattori che regolano l'omeostasi epiteliale intestinale e la risposta alle lesioni e alla rigenerazione è importante. La letteratura attuale descrive diversi approcci metodologici per ottenere immagini di tessuti intestinali per la convalida dei dati. In questo articolo, delineiamo un protocollo comune relativo alla derivazione e alla lavorazione dei tessuti intestinali del topo. Vengono discusse la corretta fissazione dei tessuti intestinali e le tecniche di Swiss-roll che migliorano la morfologia epiteliale intestinale. L'elaborazione post-resezione e il riorientamento dei tessuti intestinali incorporati sono fondamentali per ottenere blocchi inclusi in paraffina che mostrano caratteristiche strutturali intestinali intatte dopo il sezionamento. La tecnica dello swiss-rolling aiuta nella valutazione istologica dell'intero tratto intestinale o del colon esaminato. La capacità di differenziare le caratteristiche strutturali intestinali può essere vitale nelle misurazioni quantitative dell'infiammazione intestinale e della tumorigenesi lungo l'intera lunghezza. Infine, le sezioni incluse in paraffina sono ideali per l'elaborazione robusta utilizzando metodi di rilevamento immunoistochimici e immunofluorescenti. Le sezioni immunoistochimiche non fluorescenti forniscono un'immagine vibrante del tessuto che descrive in dettaglio le diverse caratteristiche strutturali cellulari, ma non forniscono flessibilità per esperimenti di co-localizzazione intracellulare. Più canali fluorescenti possono essere utilizzati in modo appropriato con la rilevazione in immunofluorescenza per esperimenti di co-localizzazione, fornendo supporto agli studi meccanicistici.

Introduzione

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L'epitelio intestinale di mammifero comprende un singolo strato di cellule colonnari. Nel piccolo intestino, le cellule proliferative sono limitati alle cripte mentre le cellule differenziate occupano la regione villi. Tuttavia, perché non ci sono villi nell'intestino crasso, le cellule proliferative sono localizzati nel fondo delle cripte e cellule differenziate occupano la regione superiore delle cripte. L'epitelio intestinale subisce rifornimento rapido (circa 3 - 5 giorni) che è guidato dalla divisione continua delle cellule proliferative all'interno delle cripte. Le cellule proliferative delle cripte non sono una popolazione omogenea e sono ulteriormente suddivisi in cellule staminali e cellule 1 di transito di amplificazione (TA). Le cellule staminali risiedono sul fondo della cripta, entro i primi 4 - 5 cellule dal fondo 2. L'attuale modello supporta l'esistenza di due tipi di cellule staminali: le cellule staminali cripta base a colonna (CBC) e le cellule staminali quiescenti di riserva. Il CBC sle cellule TEM sono attivamente proliferando e sono contrassegnati da G-proteine ​​repeat-contenenti ricchi di leucina recettore accoppiato 5 (Lgr5) 3, 4 Olfactomedin (Olfm4) 4 e Achaete scute-like 2 (Ascl2) 5. D'altra parte, le cellule staminali quiescenti di riserva sono etichettati in base al sito B specifici delle cellule Moloney murine leukemia virus integrazione 1 (BMI1) 6, la telomerasi del mouse trascrittasi inversa (mTert) 7, HOP Homeobox (Hopx) 8, doublecortin-like e CAM chinasi -Come 1 (Dclk1) 9, e leucina Rich ripetizioni e Immunoglobulina-Come domini 1 (Lrig1) 10. Le cellule staminali proliferano attivamente danno origine a cellule TA poi subire un'ulteriore differenziazione in cellule assorbenti (enterociti) e cellule secretorie (enteroendocrine, calice, cellule Paneth, e Tuft). divisione cellulare continua nella zona proliferativa traduce in movimento verso l'alto delle cellule epiteliali lungo l'asse cripta-villo fino a raggiungere sommità dei villi, dove subiscono apoptosi e sonosloughed dalla superficie dell'epitelio. I diversi tipi di cellule epiteliali intestinali sono contrassegnati mediante l'espressione di proteine ​​distinte (ad esempio, cellule caliciformi intestinali può essere riconosciuto dalla colorazione con anticorpi contro le cellule MUC2 e Paneth con anticorpi contro il lisozima). Studiamo il ruolo dei fattori Krüppel-like (KLFs) nella omeostasi e patobiologia dell'epitelio intestinale 11-13. I risultati qui presentati sostenere la fattibilità di una tecnica Swiss-rolling modificate sono basate su precedenti studi sul ruolo del fattore Krüppel-like 5 (KLF5) nella manutenzione delle attivamente proliferanti cellule staminali epiteliali intestinali 14. KLF5 è un fattore di trascrizione zinc-finger che è altamente espresso nel gambo intestinale attiva e le cellule TA 12. Studi precedenti hanno dimostrato che KLF5 è co-espresso con Ki-67, un marker proliferativa nota nelle cripte intestinali.

La gastrointestinale TR atto non è un tessuto strutturalmente o funzionalmente omogeneo. L'intestino tenue è suddiviso in duodeno, digiuno, ileo e e crasso in cieco e del colon, con quest'ultimo suddiviso in prossimale, centrale, e le porzioni distali. Ognuna di queste sezioni ha caratteristiche istologiche uniche e svolge ruoli distinti 15. Come tali, gli effetti di insulti e il grado della risposta dell'epitelio intestinale possono dipendere regione di tessuto studiato 16. Inoltre, vari ceppi di topi dimostrano la diversità della risposta a livello istologico base al tipo di insulto usato negli studi 16. Così, si addice preparazione dei tessuti è necessario consentire istologica appropriata e analisi molecolare dei tessuti intestinali. Come tale, il Swiss extra analisi tecnica sovvenzioni della lunghezza completa dell'epitelio intestinale in una sola volta e quindi accerta conclusioni ben informati basate su informazioni complete.

e_content "> La tecnica Swiss-rotolo è stato menzionato da Magnus 17, e descritto in dettaglio da Moolenbeck e Ruitenberg and Park et al. come metodo per la preparazione di tessuti e l'esecuzione di analisi istologica del roditore dell'intestino 18,19 rispettivamente. Il protocollo delineato in questa pubblicazione presenta una versione migliorata del metodo originale che permette per la preparazione dei tessuti tempestive e affidabili per scopi diagnostici. questa tecnica modificata permette di collezioni e la preparazione del epitelio intestinale per le tecniche universalmente utilizzati, come immunoistochimica, immunofluorescenza, così efficienti come ibridazione in situ (fluorescente e cromogenico 20). Inoltre, il tessuto modificato provino metodo di preparazione utilizza reagenti facilmente disponibili e relativamente poco costoso, mentre offrono un metodo di fissaggio del tessuto rapida e permette il recupero di proteine, DNA e RNA per valutazione supplementare. Tratto insieme, thitecnica s è eccellente per la valutazione completa delle caratteristiche istopatologiche, patologiche e molecolari del epitelio intestinale.

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Protocollo

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1. topi

  1. Tutti gli studi che coinvolgono i topi sono stati approvati dal Comitato Stony Brook University Istituzionale cura degli animali e Usa (IACUC). I topi sono stati mantenuti in un ciclo luce-buio 12:12 hr.
    1. Commercialmente ottenere C57BL 6 topi /. Ottenere C57BL / 6 topi portatori alleli Klf5 fiancheggiati da siti loxP (Klf5 f l / f l). Questi topi sono stati precedentemente descritti 21 e gentilmente forniti dal Dr. Ryozo Nagai.
  2. Acquisto C57BL / 6 topi portatori del gene inducibile Cre ricombinasi sotto controllo del promotore Lgr5 (topi Lgr5-EGFP / CreERT2).
  3. Per stabilire Lgr5-EGFP / créer T2 / Klf5 f l / f l topi, attraversare Klf5 fl / f topi l con topi Lgr5-EGFP / créer T2 e quindi backcross la progenie di Klf5 fl / f l topi.
  4. Topi Trattare con tamoxifene come da protocollo descritto in precedenza 22. Iniettare topi di controllo sperimentale e 8 settimane di età intraperitoneale (IP) con 1 mg di tamoxifene (10 mg / ml), disciolto in olio di mais sterili, per 5 giorni consecutivi.
  5. Il giorno 14 dopo la prima iniezione tamoxifene, sacrificare i topi con CO 2 asfissia mettendoli in una camera collegata al CO 2 fonte di gas. Lasciare che il gas di fluire nella camera fino a quando i topi sono inconscio e tutti i movimenti cessa. Per garantire l'eutanasia eseguire dislocazione cervicale.

2. Preparazione del tessuto e Swiss rotolamento

  1. Utilizzando pinze dissezione e forbici, tagliare un'incisione nella pelle del lato addominale. Con un paio di pinze, tenere la pelle in incisione e tirare delicatamente via dal tessuto muscolare addominale. Utilizzare un paio di forbici per tagliare la pelle addominale ed esporre i muscoli addominali.
  2. Tenere e tirare su la peritoneum con le pinze. Assicurarsi di non essere in possesso e tirando l'intestino. fare attenzione un'incisione nel tessuto peritoneale e continuare a tagliare via la pelle per esporre i muscoli addominali. fare attenzione un'incisione nei muscoli addominali e continuare a tagliare via per esporre l'intestino.
  3. Identificare i due punti e tracciare fino alla fine distale dove si unisce il retto / ano. Con un paio di forbici, tagliare il più vicino all'apertura anale possibile.
  4. Identificare lo stomaco e tracciare dove si unisce con il piccolo intestino. Con un paio di forbici, tagliare liberare l'intestino di circa 1 cm di distanza dallo stomaco. Trasferire l'intera lunghezza del piccolo intestino e colon liberato ad un piatto pulito Petri contenente tampone fosfato salino (PBS).
  5. Con una mano o un paio di pinze, tenere l'estremità distale del colon e utilizzare l'altra mano per svelare delicatamente l'intera lunghezza del colon da qualsiasi tessuto connettivo e / o grasso mesenterico.
  6. Identificare il cieco(Piccolo sacchetto tra intestino tenue e crasso) e tagliare dove il cieco e il colon uniscono (l'estremità prossimale del colon) per liberare il colon.
  7. Con una mano o un paio di pinze, tenere il piccolo intestino e utilizzare l'altra mano per svelare delicatamente l'intera lunghezza del piccolo intestino da qualsiasi tessuto connettivo e / o grasso mesenterico. Tagliare il cieco e scartare se non c'è bisogno.
    Nota: Il processo può essere fermato qui incubando intestini sezionati in modificato fissativo di Bouin (50% etanolo / 5% di acido acetico in dH 2 O) durante la notte e continuare la procedura del giorno successivo.
  8. Manipolazione un segmento di intestino (intestino tenue o del colon), riempire una siringa da 10 ml con fissativo modificata di Bouin e inserire un ago sonda gastrica ad esso. Inserire l'ago circa mezzo centimetro nell'apertura anteriore del segmento intestinale.
  9. Tenere l'ago sonda gastrica all'interno del segmento intestinale mediante l'applicazione di una pressione decisa con uno strumentosul segmento intestinale. Con l'altra mano che tiene la siringa, esercitare una leggera ma consistente pressione svuotare il contenuto del segmento intestinale utilizzando fissativo modificata di Bouin. Questa fase consente pulizia simultanea del segmento intestinale e fissaggio immediato. Utilizzare una capsula di Petri per raccogliere i rifiuti flow-through. Fixation può osservare dal colore colon tornitura opaco.
    Nota: Assicurarsi di non applicare troppa pressione durante il lavaggio o il segmento intestinale potrebbe scoppiare aperta.
  10. Utilizzando le forbici, tagliare aprire il segmento intestinale longitudinalmente lungo la linea mesenterica. Tenerlo con un paio di pinze e sciacquare brevemente in una capsula di Petri contenente PBS.
    1. Tagliare il piccolo intestino in 3 segmenti uguali: prossimale, medio e distale. Il segmento prossimale è quello immediatamente dopo lo stomaco, e il segmento distale è quella immediatamente prima del colon. Il segmento prossimale è equivalente al duodeno, la metà a digiuno, e distale perl'ileo.
    2. Per ogni segmento segnare prossimale e l'estremità distale. L'estremità prossimale è quella che originariamente rivolta verso lo stomaco, e distale puntato verso il colon.
  11. Usare la parte superiore di un piatto Petri per posizionare il segmento intestinale puliti e aperto. Posizionare il segmento intestinale con il lato luminale rivolto verso l'alto.
    1. Per il colon, identificare il lato luminale dalle screziature / creste che attraversano la sua larghezza e sono presenti alla fine prossimale. Le regioni medie e distali hanno alcuni variegature che corrono longitudinalmente. Per il piccolo intestino, identificare il lato luminale dalla superficie ruvida-apparire, che segna il villi.
      Nota: Per il piccolo intestino, non ci sono macroscopici delimitazione anatomica esterna prossimale, centrale e le regioni distali. Tuttavia queste regioni possono essere identificate possono nelle sezioni al microscopio. I villi sono più lungo della regione prossimale e diventano via via più breve distale dove sonola più breve in lunghezza. Microscopicamente, le cripte del colon sono più breve nella regione prossimale che può anche essere identificata dalla presenza di creste. Le cripte del colon sono più alto nella parte centrale e più brevi nella regione distale ma ancora più alto nella regione prossimale.
  12. Procedere con Swiss rotolare i due punti:
    1. Mantenere il colon piatta aperto e tirarlo con una pinza dalla sua estremità prossimale verso il bordo del piatto Petri.
    2. Mantenere lato luminale rivolto verso l'alto e l'estremità prossimale con la pinza con una mano e con l'altra mano tenere uno stuzzicadenti.
    3. Avvolgere il bordo della estremità prossimale intorno al stuzzicadenti con le pinze e un po 'pizzicare il bordo avvolto contro il stuzzicadenti per tenerlo in posizione.
    4. Delicatamente e lentamente iniziare a rotazione lo stuzzicadenti con le dita per rotolare i due punti intorno lo stuzzicadenti in modo da formare un rotolo svizzero.
    5. Una volta che l'intera lunghezza del colon è stato arrotolato, usare un paio di pinze a scivolare con attenzione il colon Swiss roll off lo stuzzicadenti e in un tessuto di elaborazione / cassette -embedding. Inserire la cassetta in 10% formalina tamponata notte a temperatura ambiente.
  13. Procedere con Swiss rotolare il piccolo intestino:
    1. Manipolazione un segmento alla volta, tenere il tratto piano aperto con lato luminale e tirarlo con una pinza dalla sua estremità prossimale verso il bordo del piatto Petri.
    2. Procedere con rotolamento Swiss come descritto per il colon.
  14. Procedere con l'elaborazione di tessuti fissati in formalina per paraffina. Procedere come segue:
    NOTA: utilizzare un processore automatizzato (vedi Materiali e attrezzature per i dettagli).
    1. Mentre il tessuto è nella cassetta, lavare tessuti con PBS fino fissativo viene completamente rimosso.
    2. Disidratare tessuto con etanolo nella seguente sequenza: 50% di etanolo per 10 min, 70% di etanolo per 10 min, 80% di etanolo per 10 min, 95% di etanolo per 10 minuti, 100% di etanolo per 10 min, 100% di etanolo per 10 min e 100% di etanolo per 10 min.
    3. Scambio etanolo con xilene nella seguente sequenza: 2: 1 etanolo: xilene per 10 - 15 min, 1: 1 etanolo: xilene per 10 - 15 min, 1: 2 etanolo: xilene per 10 - 15 min, 100% xilene per 10 - 15 min, 100% xilene per 10 - 15 minuti, e il 100% xilene per il 10 - 15 min. ATTENZIONE: xilene è un pericolo per la salute, così il posto di lavoro dovrebbe essere dotato di un sistema di aspirazione locale con una corretta cappuccio e l'attrezzatura di protezione deve essere indossato dal personale.
    4. xilene Exchange con paraffina. Effettuare le seguenti operazioni in un forno sotto vuoto impostato al 54 - 58 ° C: 2: 1 xilene: paraffina per 30 min, 1: 1 xilene: paraffina per 30 min, 1: 2 xilene: paraffina per 30 minuti, 100% paraffina 1 - 2 ore, e il 100% di paraffina per 1 - 2 ore o durante la notte.
      Nota: Non lasciate che la paraffina superi i 60 ° C per lunghi periodi di tempo perché questo si degradano i polimeri di paraffina e rendono difficile e fragile.
    5. Incorporare nel nuovo paraffina e orientare tessuto fresco come dedesiderato prima la paraffina indurisce. Per i rulli svizzeri, seguendo paraffinization tessuti, è importante riposizionare ogni rotolo sul suo lato durante incorporamento paraffina. Ciò garantisce che durante il taglio, saranno prodotte sezioni della intera lunghezza di ogni rullo.
  15. Per la colorazione, taglio a 5 micron sezioni spesse con microtomo. Raccogliere sezioni su vetrini carichi e (bake) asciugare in un forno a 65 ° C durante la notte; lasciare raffreddare a temperatura ambiente e successivamente utilizzato per la colorazione.
    Nota: Il tempo di cottura può essere ridotto a 1 - 2 ore a seconda di come appena tagliata le diapositive sono. Se meno di un mese da sezionamento, allora è consigliabile cuocere durante la notte. Se è stato più di un mese, poi 1 - 2 ore di cottura è sufficiente per risparmiare tempo. Se a corto di tempo, il sostegno durante la notte può sempre essere utilizzato.

3. analisi istologica e immunofluorescenza colorazione

Eseguire l'analisi istologica e immunofluorescence colorazione come precedentemente descritto 23,24, con modifiche. Per la proteina fluorescente verde (EGFP) immunofluorescenza:

  1. Cuocere le diapositive di una C forno a 65 ° per 1 ora per inattivare endogena fosfatasi alcalina e successivamente Deparaffinare in xilene.
  2. Incubare le sezioni in un bagno di perossido di idrogeno al 3% in metanolo di bloccare perossidasi endogene di tessuto; poi reidratare mediante incubazione in una serie decrescente vasca alcool (100%, 95%, 70%) seguita da antigene recupero in soluzione tampone citrato (10 mM citrato di sodio, 0,05% Tween-20, pH 6,0) a 125 ° C per 10 min utilizzando una camera decloaking.
  3. Disegnare un cerchio attorno sezioni di tessuto usando pennarello che fornisce barriera idrofobica e incubare sezioni con tampone di bloccaggio (albumina sierica bovina 2,5% BSA [] in TBS-Tween) per 30 minuti a 37 ° C e poi con anticorpo primario contro EGFP (diluizione 1 : 500) a 4 ° C per una notte in una camera umidificata agitatore.
  4. Lavare sezioni e incubare con anticorpo secondario fluorescente-tag alla concentrazione appropriata per 30 min a 37 ° C.
  5. Lavare i vetrini dopo secondarie di trattamento di anticorpi e macchia nuclei con Hoechst e montare con mezzi di montaggio.
    1. Per Klf5 / EGFP / Ki-67 co-colorazione, i vetrini di processo come descritto ai punti 3.1 - 3.3 ed eseguire Klf5 colorazione incubando con anticorpo Klf5 (diluizione 1: 150) durante la notte.
    2. Applicare coniglio rilevamento polimero AP alle diapositive come da protocollo.
    3. Rivela Klf4 colorazione utilizzando cromogeno colorazione immunoistochimica secondo il protocollo del produttore.
    4. Eseguire eluizione degli anticorpi utilizzando il protocollo descritto in precedenza 25. Incubare i vetrini a 50 ° C in Glycine-SDS (pH 2,0) la soluzione sotto agitazione per 1 ora.
    5. Lavare i vetrini accuratamente con acqua distillata e incubare con tampone di bloccaggio (2,5% BSA in TBS-Tween) per 30 minuti a 37 ° C.
    6. Aggiungere Ki-67 (diluizione 1: 500) e EGFP (diluizione 1:500) anticorpi simultaneamente e incubare a 37 ° C per 1 ora.
    7. Eseguire il rilevamento fluorescente con anticorpi secondari appropriati prima colorazione con Hoechst (dati non mostrati) e montare con mezzo di montaggio.
  6. Osservare la morfologia istologica dei tessuti sulla colorazione sezioni 5 micron con ematossilina e eosina (H & E) 26. Per le immagini a fluorescenza, utilizzare le lunghezze d'onda di emissione di 535, 646, e 700 di visualizzare EGFP, Klf5, e Ki-67 colorazione, rispettivamente.

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Risultati

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La tecnica di laminazione svizzero in combinazione con colorazione immunoistochimica permette di un'analisi completa del tessuto intestinale piccola o grande. L'esempio di colorazione H & E di un crasso di un C57BL / 6 del mouse (figura 1) è un esempio di fattibilità e l'efficacia di questa tecnica. Come mostrato in figura 1, l'immagine è in grado di catturare tutte le porzioni del colon: prossimale, medio e distale. Così, permette per valutazione gl...

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Discussione

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La tecnica di laminazione svizzero è un metodo efficace per la preparazione di tessuto intestinale per la valutazione istologica e morfologica su larga scala. In contrasto con la tecnica precedentemente descritta Swiss-rotolamento, che è stato originariamente sviluppato per la preparazione delle sezioni congelate 18,19, la procedura qui presentata consente rapida preparazione tessuto intestinale e la fissazione per fissazione in formalina e paraffina (FFPE). Rispetto ai tessuti congelati, tessuto FFPE ha dura...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare Ainara Ruiz de Sabando per aver fornito le immagini di H&E. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health (DK052230, DK093680 e CA172113) assegnate al Dr. Vincent W. Yang.

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Materiali

T2

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit di dissezione in acciaio inossidabileVWR25640-002
Camera di decloakingBiocare MedicalDC2012
Siringa da 10 mlVWR89215-218
Swingsette Cassetta per inclusione/lavorazione dei tessuti con coperchioVetrini SimportM515
Superfrost Plus [dimensioni: 25 x 75 x 1 mm]VWR48311-703
Set per la colorazione manuale dei vetriniTissue-Tek/Sakura4451
Piastra per la colorazione Pannoverde-Tek/Sakura4456
Piastra per la colorazioneTessuto bianco-Tek/Sakura4457
Supporto per vetrini da 24 vetrini con manico staccabileTissue-Tek/Sakura4465
FornoThermo Scientific6243per la cottura di vetrini a 65 gradi
Microscopio di dissezioneZeissStemi 2000C
Microscopio a fluorescenzaNikonEclipse 90iLuce brillante e fluorescente, con obiettivi: 10X, 20X
PAP Pen Super-Liquid Blocker MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
Etanolo 200 proofAAPR111000200
MetanoloVWRBDH1135-4LP
Acido acetico glacialeAAPR281000ACS
XileneFisher ScientificX5P-1GAL
Perossido di idrogeno 25% soluzione acquosaACROS202465000
formalina bufered 10%Fisher Scientific22-026-213
Frazione sierica bovina V, shock termicoRoche3116956001
Tween 20Sigma AldrichP7949
Citrato di sodioFisher ScientificS279
Ago GavageVWR20068-624
Coniglio anti Klf5 anticorpoSanta Cruz Biotechnologysc-22797Diluizione 1:150
Pollo anti EGFP anticorpoMilliporeAB16901Diluizione 1:500
Coniglio anti Ki67Kit:500Mach3
cromogeno rossoBiocare
Laboratori Jackson008875 
Processore automatizzatoLeicaLeica TP1020
di rilevamento del polimero AP di coniglio 1 Biocare Medical CRM325B Diluizione Kit di Medical M3R533L Warp Biocare Medical WR806 H Lgr5-EGFP/CreER topi 

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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