accurata identificazione e localizzazione delle cellule epiteliali lungo il rivestimento della mucosa intestinale sono essenziali per definire diverse linee cellulari. Corretta l'imaging dei tessuti intestinali è di fondamentale importanza per l'identificazione dei pattern di espressione della proteina con la massima risoluzione. Questo studio si propone di delineare i metodi e le condizioni ottimali per i tessuti intestinali lavorazione del mouse.
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Articolo metodologico
Miglioramento Tecnica Swiss-laminazione per intestinale Preparazione del tessuto per immunoistochimica e analisi immunofluorescenza
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Comprendere il ruolo dei fattori che regolano l'omeostasi epiteliale intestinale e la risposta alle lesioni e alla rigenerazione è importante. La letteratura attuale descrive diversi approcci metodologici per ottenere immagini di tessuti intestinali per la convalida dei dati. In questo articolo, delineiamo un protocollo comune relativo alla derivazione e alla lavorazione dei tessuti intestinali del topo. Vengono discusse la corretta fissazione dei tessuti intestinali e le tecniche di Swiss-roll che migliorano la morfologia epiteliale intestinale. L'elaborazione post-resezione e il riorientamento dei tessuti intestinali incorporati sono fondamentali per ottenere blocchi inclusi in paraffina che mostrano caratteristiche strutturali intestinali intatte dopo il sezionamento. La tecnica dello swiss-rolling aiuta nella valutazione istologica dell'intero tratto intestinale o del colon esaminato. La capacità di differenziare le caratteristiche strutturali intestinali può essere vitale nelle misurazioni quantitative dell'infiammazione intestinale e della tumorigenesi lungo l'intera lunghezza. Infine, le sezioni incluse in paraffina sono ideali per l'elaborazione robusta utilizzando metodi di rilevamento immunoistochimici e immunofluorescenti. Le sezioni immunoistochimiche non fluorescenti forniscono un'immagine vibrante del tessuto che descrive in dettaglio le diverse caratteristiche strutturali cellulari, ma non forniscono flessibilità per esperimenti di co-localizzazione intracellulare. Più canali fluorescenti possono essere utilizzati in modo appropriato con la rilevazione in immunofluorescenza per esperimenti di co-localizzazione, fornendo supporto agli studi meccanicistici.
Introduzione
L'epitelio intestinale di mammifero comprende un singolo strato di cellule colonnari. Nel piccolo intestino, le cellule proliferative sono limitati alle cripte mentre le cellule differenziate occupano la regione villi. Tuttavia, perché non ci sono villi nell'intestino crasso, le cellule proliferative sono localizzati nel fondo delle cripte e cellule differenziate occupano la regione superiore delle cripte. L'epitelio intestinale subisce rifornimento rapido (circa 3 - 5 giorni) che è guidato dalla divisione continua delle cellule proliferative all'interno delle cripte. Le cellule proliferative delle cripte non sono una popolazione omogenea e sono ulter....
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Protocollo
1. topi
- Tutti gli studi che coinvolgono i topi sono stati approvati dal Comitato Stony Brook University Istituzionale cura degli animali e Usa (IACUC). I topi sono stati mantenuti in un ciclo luce-buio 12:12 hr.
- Commercialmente ottenere C57BL 6 topi /. Ottenere C57BL / 6 topi portatori alleli Klf5 fiancheggiati da siti loxP (Klf5 f l / f l). Questi topi sono stati precedentemente descritti 21 e gentilmente forniti dal Dr. Ryozo Nagai.
- Acquisto C57BL / 6 topi portatori del gene inducibile Cre ricombinasi sotto controllo del promotore Lgr5 (topi L....
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Risultati
La tecnica di laminazione svizzero in combinazione con colorazione immunoistochimica permette di un'analisi completa del tessuto intestinale piccola o grande. L'esempio di colorazione H & E di un crasso di un C57BL / 6 del mouse (figura 1) è un esempio di fattibilità e l'efficacia di questa tecnica. Come mostrato in figura 1, l'immagine è in grado di catturare tutte le porzioni del colon: prossimale, medio e distale. Così, permette pe.......
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Discussione
La tecnica di laminazione svizzero è un metodo efficace per la preparazione di tessuto intestinale per la valutazione istologica e morfologica su larga scala. In contrasto con la tecnica precedentemente descritta Swiss-rotolamento, che è stato originariamente sviluppato per la preparazione delle sezioni congelate 18,19, la procedura qui presentata consente rapida preparazione tessuto intestinale e la fissazione per fissazione in formalina e paraffina (FFPE). Rispetto ai tessuti congelati, tessuto FFPE ha dura.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Ainara Ruiz de Sabando per aver fornito le immagini di H&E. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health (DK052230, DK093680 e CA172113) assegnate al Dr. Vincent W. Yang.
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Materiali
T2
di rilevamento del polimero AP di coniglio 1 Biocare Medical CRM325B Diluizione Kit di Medical M3R533L Warp Biocare Medical WR806 H Lgr5-EGFP/CreER topi
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di dissezione in acciaio inossidabile | VWR | 25640-002 | |
| Camera di decloaking | Biocare Medical | DC2012 | |
| Siringa da 10 ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Cassetta per inclusione/lavorazione dei tessuti con coperchio | Vetrini Simport | M515 | |
| Superfrost Plus [dimensioni: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Set per la colorazione manuale dei vetrini | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Piastra per la colorazione Panno | verde-Tek/Sakura | 4456 | |
| Piastra per la colorazione | Tessuto bianco-Tek/Sakura | 4457 | |
| Supporto per vetrini da 24 vetrini con manico staccabile | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Forno | Thermo Scientific | 6243 | per la cottura di vetrini a 65 gradi |
| Microscopio di dissezione | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Microscopio a fluorescenza | Nikon | Eclipse 90i | Luce brillante e fluorescente, con obiettivi: 10X, 20X |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Etanolo 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Metanolo | VWR | BDH1135-4LP | |
| Acido acetico glaciale | AAPR | 281000ACS | |
| Xilene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Perossido di idrogeno 25% soluzione acquosa | ACROS | 202465000 | |
| formalina bufered 10% | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Frazione sierica bovina V, shock termico | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Citrato di sodio | Fisher Scientific | S279 | |
| Ago Gavage | VWR | 20068-624 | |
| Coniglio anti Klf5 anticorpo | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Diluizione 1:150 |
| Pollo anti EGFP anticorpo | Millipore | AB16901 | Diluizione 1:500 |
| Coniglio anti Ki67 | Kit | :500 | Mach3 |
| cromogeno rosso | Biocare | ||
| Laboratori Jackson | 008875 | ||
| Processore automatizzato | Leica | Leica TP1020 |
Riferimenti
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. ....
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Ristampe e permessi
