Articolo metodologico
Le cellule del midollo osseo coltivate con il fattore stimolante le colonie di macrofagi granulociti (GM-CSF) generano una coltura eterogenea contenente macrofagi e cellule dendritiche (DC). Questo metodo evidenzia l'utilizzo del legame MHCII e ialuronano (HA) per differenziare i macrofagi dalle DC nella coltura GM-CSF. I macrofagi in questa cultura hanno molte somiglianze con i macrofagi alveolari.
I macrofagi e le cellule dendritiche (DC) sono cellule immunitarie innate trovati nei tessuti e negli organi linfoidi che giocano un ruolo chiave nella difesa contro gli agenti patogeni. Tuttavia, essi sono difficili da isolare in numero sufficiente per studiarli in dettaglio, di conseguenza, sono stati sviluppati modelli in vitro. In vitro culture di osso macrofagi derivate dal midollo e cellule dendritiche sono metodi di valore ben consolidati e per gli studi immunologici. Qui, un metodo per la coltura e l'identificazione sia DC e macrofagi da una sola coltura di cellule del midollo osseo principale del mouse utilizzando il fattore stimolante le colonie di granulociti macrofagi citochina (GM-CSF) è descritto. Questo protocollo si basa sulla procedura stabilita prima sviluppato da Lutz et al. nel 1999 per l'osso DC derivate dal midollo. La cultura è eterogenea, e MHCII e acido ialuronico fluoresceinato (FL-HA) sono utilizzati per distinguere i macrofagi da DC immature e mature. Questi GM-CSF derivato macrofagi provide una comoda fonte di in vitro macrofagi derivati che ricordano da vicino macrofagi alveolari sia in fenotipo e la funzione.
Diversi metodi in vitro di coltura sono stati descritti per generare osso macrofagi derivate dal midollo (BMDMs) e DC derivate dal midollo osseo (BMDCs) utilizzando uno o una combinazione di fattori di crescita. BMDMs può essere generato da coltura di cellule di midollo osseo utilizzando il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) o GM-CSF 1,2. Per BMDCs, l'aggiunta di FLT3 ligando alla cultura midollo osseo comporta non aderenti DC classici e plasmacitoidi (alta CD11c / MHCII alta e CD11c lo, B220 + rispettivamente) dopo 9 giorni di coltura 3,4. Al contrario, le cellule non ader....
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I topi sono stati sacrificati in accordo con il Consiglio canadese sugli orientamenti cura degli animali per la ricerca animale etica da procedure approvate dalla University of Columbia Comitato Animal Care britannico.
1. L'acquisizione di una singola cella di midollo osseo Sospensione dal mouse femore e tibia
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Un diagramma di flusso che sintetizza le fasi principali di questo metodo è illustrato in Figura 1. La densità e la morfologia della cultura midollo osseo in diversi momenti della coltura sono mostrati in Figura 2. Al giorno 1, le cellule sono piccole e sparse, ma al giorno 3, ci sono più celle, alcuni sono più grandi e alcuni hanno cominciato ad aderire. Di giorno 6 c'è un aderente definito e frazione non aderente (Figura 2A). La co.......
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In questo manoscritto, forniamo un metodo per generare macrofagi e cellule dendritiche GM-CSF derivati da una singola coltura di midollo osseo di topo che è adattato da Lutz et al. 6. Espressione MHCII e FL-HA distingue tra DC immature e macrofagi vincolante in questa cultura (vedi Figura 3C), che in precedenza è stato difficile. Questo, insieme con un altro rapporto da Helft et al. 19, dimostra l'eterogeneità all'interno di GM-CSF culture BMDC indotte c.......
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Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari.
Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (Grant MOP-119503) e le scienze e ingegneria Consiglio Naturale del Canada (NSERC). NSERC supportato anche borse di studio estive per YD e AA YD è sostenuto dalla University of British Columbia (UBC), con un premio borsa di studio di 4 anni, AA è supportato da CIHR con il premio di Master studente laureato (CGS-M). Ringraziamo Calvin Roskelley per l'assistenza con il microscopio utilizzato per generare le immagini nella Figura 2. Riconosciamo inoltre sostegno da parte dei UBC animali e citometria a flusso strutture.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Citometro a flusso | BD | LSR-II | |
| Leica | Centrifuga DMI4000 B | ||
| Thermo Fisher | ST-40R | ||
| Cabina di Biosicurezza | Nuaire | NU-425-600 | |
| Siringa 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Ago | BD | 305111 | |
| 50 ml Tubo Conico | Corning | 357070 | *Provette Eppendorf marca Falcon |
| (1,5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polistirene provette a fondo tondo | Corning | 352052 | |
| Strumenti di dissezione | Strumenti per la scienza fine | *Vari | *Forbici da dissezione, pinza dumont e pinza standard |
| Emocitometro | Reichert | 1490 | |
| Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon marca |
| 2-Mercaptoetanolo | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Cloruro di ammonio | BDH | BDH0208-500G | |
| Siero bovino Albumina Fisher | Bioreagenti | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Acido etilendiamminotetraacetico |
| Fetale Siero bovino | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hank | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico |
| acido L-glutammina | Sigma | G8540-100G | |
| LPS | Ultrapure Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillina/Streptomicina 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Fosfato di potassio monobasico | BDH | BDH0268-500G | |
| Cloruro di potassio | BDH | BDH9258-500G | |
| Ricombinante GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Pettine di gallo ialuronato di sodio | Sigma | H5388-1G | * Utilizzato per produrre acido ialuronico fluoresceinato |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | Senza piruvato di sodio, senza glutammina. Media caldi a 37 ° C prima dell'uso. |
| Cloruro di sodio | Fisher | 5271-10 | |
| Fosfato di sodio bibasico | Sigma | 50876-1Kg | |
| Piruvato di sodio | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(idrossimetil)amminometano | Fisher Bioreagenti | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Recettore (non marcato), surnatante per colture tissutali | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinilato Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Capra policlonale IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Ioduro di Propidio | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo) | Sigma | D9542-5MG |
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