Trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare cellule T del recettore Retrogenic Mice

Sommario

Presentiamo un protocollo rapido e flessibile per un sistema di espressione in vivo basato su un singolo recettore delle cellule T (TCR) basato su retrovirus. I vettori retrovirali sono utilizzati per trasdurre le cellule progenitrici del midollo osseo per studiare lo sviluppo delle cellule T e la funzione di un singolo TCR in vivo come alternativa ai topi transgenici TCR.

Abstract

La segnalazione del recettore delle cellule T (TCR) è essenziale nello sviluppo e nella differenziazione delle cellule T rispettivamente nel timo e nella periferia. La vasta gamma di TCR dimostra che lo studio di una specifica risposta antigenica è difficile. Pertanto, i topi transgenici TCR sono stati fatti per studiare la selezione positiva e negativa nel timo, nonché l'attivazione, la proliferazione e la tolleranza delle cellule T periferiche. Tuttavia, relativamente pochi topi transgenici TCR sono stati generati specifici per un dato antigene. Pertanto, sono mancati studi che coinvolgessero TCR di varie affinità per lo stesso peptide antigenico. La generazione di una nuova linea transgenica TCR può richiedere sei o più mesi. Inoltre, eventuali reincroci specifici possono richiedere altri sei mesi. Al fine di consentire una più rapida generazione e screening di TCR multipli, è stato stabilito un protocollo per la trasduzione retrovirale del midollo osseo con l'espressione stechiometrica delle catene TCRα e TCRβ e la generazione di topi retrogeni. Ogni topo retrogenico è essenzialmente un fondatore, negando virtualmente un effetto fondatore, mentre il periodo di tempo per generare un TCR retrogenico è ridotto da sei mesi a circa sei settimane. Qui presentiamo un'alternativa rapida e flessibile ai topi transgenici TCR che può essere espressa su qualsiasi sfondo scelto con qualsiasi TCR particolare.

Introduzione

Recettore delle cellule T (TCR) repertorio di esseri umani e topi è stato stimato a 1 x 10 ⁸ e 2 x 10 ⁶ TCR unici rispettivamente ^1,2. Questa grande diversità permette cellule T di riconoscere una vasta gamma di epitopi antigenici derivati ​​da auto-peptidi e da agenti patogeni presentati dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) sulle cellule presentanti l'antigene (APC). Le sottili differenze nelle interazioni dei TCR con unici complessi peptide-MHC determinano se una cellula T subirà apoptosi, anergia, l'attivazione, la differenziazione, la produzione di citochine e citotossicità. Tuttavia, a causa della grande repe....

Protocollo

Etica Dichiarazione: Ogni sforzo è fatto per mantenere il disagio degli animali o di stress al minimo durante l'irradiazione e la coda vena iniezioni. I topi sono utilizzati come fonte di cellule in questi esperimenti; in quanto tale, non ci sono procedure o manipolazioni a parte l'eutanasia. I topi saranno sacrificati da CO ₂ inalazione seguita da dislocazione cervicale per confermare la morte. Questa procedura è coerente con le raccomandazioni del gruppo sull'eutanasia della American Veterinary Medical Association.

1. Preparare retrovirale Construct

1. Sotto-clone catene del recettore delle cellule T (TCR) alf....

Risultati

Bone efficienza osseo trasduzione viene controllato nel passo 13.3 del protocollo prima del midollo osseo viene iniettato in vena della coda iv In rappresentante midollo osseo trasduzione figura (Figura 1A), circa 10 ml di midollo osseo raccolto è stato aggiunto a 100 ml di PBS e analizzate per l'espressione ametrino. Generalmente la percentuale di cellule positive fluorescenti è tra il 25% e il 70%, a seconda del costrutto e titolo retrovirale. Dopo 6 settimane inie.......

Discussione

Nel protocollo, abbiamo dettaglio diversi passaggi critici per garantire la salute del midollo osseo ottimale, l'efficienza di trasduzione e la ricostituzione. Il primo passo fondamentale è la generazione e la corretta manutenzione delle cellule produttrici virale GP + E86. Utilizzare linee cellulari produttori di passaggio precoce e mantenere a 80% di confluenza o inferiore prima dell'uso. Quando si effettuano fresche cellule produttrici virale GP + E86, garantire le cellule 293T sono di passaggio precoce e in .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM, alto glucosio + glutammina	Corning Cellgro	10-013-CV	Modifica di Dulbecco del terreno di Eagle con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio
FBS	Atlanta Biological	S11550
Tripsina-Versene	Lonza	17-161F
0,45 µ m filtro per siringa	Thermo Scientific	194-2545
polybrene	Sigma	H9268-10G	Sterile Filtrato in dH2O
Ciprofloxacina	VWR	AAJ61970-06
5-fluorouracile (5-FU)	VWR	AAA13456-06
Piruvato di sodio	Corning Cellgro	25-000-CI
MEM aminoacidi non essenziali	Corning Cellgro	25-025-CI
HEPES 1 M soluzione	Corning Cellgro	25-060-CI
2-Mercaptoetanolo	Gibco di Life Technologies	21985-023
Pen/Strept	Corning Cellgro	30-002-CI
L-glutammina	Corning Cellgro	25-005-CI
Piastre per coltura tissutale da 150 mm	Greiner Bio-one	639160
Piastra piana a 6 pozzetti trattata con coltura Tisue	Greiner Bio-one	657160
70 µ m filtri cellulari in nylon	Falcon	352350
Mouse IL-3	Invitrogen	PMC0033
Human IL-6	Invitrogen
Fattore di cellule staminali di topo	Invitrogen	PMC2113L
10x PBS	Corning Cellgro	46-D13-CM
HANKS Buffer	Corning Cellgro	21020147
BD Siringa da 10 ml	BD	300912
BD Siringa da 1 ml	BD	309659
27 G x 1/2 BD Ago per scivolamento di precisione	BD
Ago per scivolamento di precisione 30 G x 1/2 BD	BD	305106

PHC0063305109