Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da Burnetii Coxiella Durante siRNA Silencing

Coxiella burnetii è un patogeno intracellulare unico che provoca la febbre Q infezione umana zoonotici. Questa malattia è associata con un ampio spettro di manifestazioni cliniche che si estendono dalla sieroconversione asintomatica a infezione cronica pericolosa per la vita, che spesso si manifesta come anni endocardite dopo l'esposizione ^1. L'infezione umana avviene principalmente attraverso l'inalazione di aerosol contaminati con ruminanti il ​​principale serbatoio di infezione, in particolare, vacche da latte, pecore e capre. Anche se l'infezione Coxiella in questi animali è in genere subclinica, l'infezione può innescare l'aborto e la notevole carica batterica all'interno del fluido parto e la placenta può contaminare l'ambiente locale ^1. Un esempio di enorme peso tale contaminazione può avere sia la salute pubblica e il settore agricolo è stato recentemente osservato nel focolaio febbre Q che si è verificato nei Paesi Bassi ^2. Tra il 2007 eIl 2010, oltre 4.000 casi umani di febbre Q sono stati diagnosticati e questa epidemia era legata alla contaminazione significativa delle aziende agricole di capra ^3. Inoltre, Coxiella è un potenziale arma biologica, come classificati dai Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie, a causa della stabilità ambientale dei batteri e bassa dose infettante necessaria per causare grave morbilità e mortalità ^4.

Coxiella esiste in due fasi: Fase I microrganismi, isolati da fonti naturali, sono estremamente virulenti e organismi di fase II sono molto attenuate in vivo. Ad esempio, dopo diversi passaggi in vitro degli organismi Coxiella burnetii Nine Mile Fase I, Fase II, i batteri sono stati prodotti che contengono una delezione cromosomica irreversibile conseguente lipopolisaccaride tronco (LPS) ^5. Questo ceppo, C. burnetii NMII, è fenotipicamente simile alla Fase I in modelli di coltura di tessuti e fornisce una modalità più sicural per i ricercatori di studiare Coxiella patogenesi nei laboratori ^5. Negli ultimi anni molti passi avanti sono rapidamente avanzato il campo della genetica Coxiella. Più in particolare, lo sviluppo dei mezzi di comunicazione axeniche (acidificato medio cisteina citrato - ACCM-2) ha permesso la crescita privo di cellule di Coxiella sia liquido e su supporti solidi ^6,7. Ciò ha determinato miglioramenti diretti di strumenti genetici disponibili per Coxiella tra cui un sistema di espressione del gene inducibile, vettori navetta e sistemi di trasposoni casuali ^8-11. Più di recente, sono stati sviluppati due metodi per l'inattivazione genica mirata, aprendo la strada per l'esame specifico di virulenza geni candidati ^12.

A seguito di interiorizzazione da parte dei macrofagi alveolari, Coxiella replica ai numeri elevati all'interno di un vano di membrana definito il Coxiella- contenente vacuolo (CCV). Il CCV richiede traffico endocitico ospite esimogrezzi precoce e tardiva endosomi fino a quando non matura in un organello lisosoma di derivazione ^13. In tutto questo processo, il CCV acquisisce fattori dell'ospite che o appaiono transitoriamente o rimanere connessi con il vacuolo, compresi, ma non limitatamente a, Rab5, Rab7, CD63 e ^LAMP-gennaio 13-15. La replica di Coxiella all'interno di cellule ospiti è interamente dipendente da un Dot / Icm Tipo IVB secrezione sistema completamente funzionante (T4SS) ^8,16,17. Questo sistema di secrezione è una struttura multi-proteina ancestrally relative ai sistemi di coniugazione e si estende su entrambi membrane batteriche e vacuolari per fornire proteine ​​batteriche, definito effettori, nel citoplasma ospitante ^18. Il Coxiella T4SS è funzionalmente molto simile al ben caratterizzato tipo IVB Dot / Icm secrezione Sistema di Legionella pneumophila ^19,20. È interessante notare che l'attivazione del T4SS e successiva effettore traslocazione avviene solo Coxiella raggiunge l'acido lisosoma derivatoorganello, circa 8 ore dopo l'infezione ^17,21. Ad oggi, più di 130 effettori Dot / ICM sono stati identificati ^9,17,22-24. Molti di questi effettori probabilmente svolgono un ruolo importante durante la replica di Coxiella all'interno di cellule ospiti; tuttavia, solo pochi effettori sono stati funzionalmente caratterizzata ^25-29.

In questo studio utilizziamo un saggio di traslocazione di fluorescenza base che si basa sulla scissione del substrato CCF2-AM FRET (di seguito denominato il substrato blam) attraverso attività di β-lattamasi all'interno del citoplasma della cellula ospite (Figura 1). Il gene di interesse è fuso TEM-1 β-lattamasi (blam) su un plasmide giornalista che fornisce espressione costitutiva. Il substrato BLAM è composto da due fluorofori (cumarina e fluoresceina) che formano una coppia FRET. Eccitazione dei risultati cumarinici in FRET della fluoresceina e l'emissione di fluorescenza verde in assenza di effettore traslocazione; Tuttavia, se il BlaM-effector proteina di fusione viene traslocato nel citoplasma ospite, la risultante β-lattamasi attività fende l'anello β-lattamici del substrato Blam, che separa la coppia FRET produrre blu emissione di fluorescenza a seguito di eccitazione. Questo test traslocazione è stato ben dimostrato come un approccio per identificare le proteine ​​effettrici da una gamma di diversi batteri intracellulari ed extracellulari, tra cui C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogena E. coli, Salmonella e Brucella ^17,30-35.

Per determinare il ruolo dei fattori di accoglienza specifici su Coxiella effettrici traslocazione utilizziamo un metodo consolidato per silenziamento gene noto come interferenza dell'RNA, in particolare piccoli RNA interferenti (siRNA). Originariamente identificato nel Caenorhabditis elegans, interferenza dell'RNA è un processo cellulare endogena conservato utilizzato per defe innataNSE contro i virus così come gene regolamentazione ^36,37. Dopo il legame di specifiche sequenze siRNA, degradazione del mRNA avviene attraverso RISC (RNA-indotta complesso tacere) con conseguente specifico silenziamento genico o atterramento ^38. In questo studio, siRNA è stato utilizzato per indirizzare due proteine ​​ospitanti, Rab5A e Rab7A, che sono importanti regolatori della via endocitico. L'impatto di tacere Rab5A e Rab7A su effettori traslocazione è stata determinata mediante C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 è stato scelto in quanto è stato precedentemente dimostrato di essere traslocata dal sistema di secrezione Dot / Icm di Coxiella ^17.

Utilizzando sia siRNA silenziamento genico e il saggio di traslocazione fluorescencebased descritto qui, stiamo cominciando a definire un ruolo per fattori di accoglienza nella traslocazione di proteine ​​effettrici da Coxiella. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di entrambi batteri intracellulari ed extracellulari che possiedono secretio similesistemi n responsabili della traslocazione di proteine ​​effettrici.

Nota: Tutte le procedure che coinvolgono la crescita o la manipolazione di Coxiella burnetii RSA439 NMII devono essere eseguite in un livello di contenimento fisico 2 Laboratorio e all'interno di una cappa di sicurezza biologica in conformità con le linee guida locali. Un diagramma schematico del flusso di lavoro trasfezione e dosaggio traslocazione inversa descritto di seguito è mostrata in figura 2.

1. Preparazione di C. burnetii cultura Esprimendo CBU0077 fusa al beta-lattamasi (pBlaM-CBU0077) (giorno 1)

1. Preparare 1X ACCM-2 ^6:
   1. Combinare i componenti elencati nella tabella 1. Regolare il pH a 4,75 con 6 M NaOH e sterilizzare il filtro (non autoclave). ACCM-2 è stabile per circa tre settimane se conservato a 4 ° C.
2. Genera C. scorte burnetii pBlaM-CBU0077.
   1. Infettare HeLa 229 cellule con il C. ceppo burnetii portando pBlaM-CBU0077 e il passaggio fino grande vacuoles si osservano nella maggior parte delle cellule.
      1. Far crescere la C. ceppo burnetii portando pBlaM-CBU0077 in 20 ml ACCM-2 contenente 3 mg / ml cloramfenicolo in 75 cm ² tessuti pallone di coltura con tappo ventilato per 7 giorni a 37 ° C in 5% CO _2, 2,5% O _2.
      2. Centrifugare la C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 a 15.000 g per 15 minuti a temperatura ambiente.
      3. Risospendere il pellet in 20 ml di DMEM + 10% di siero fetale bovino (FCS) + 3 mg / ml cloramfenicolo (mezzi di manutenzione). Rimuovere i supporti da un 50% confluenti 75 centimetri ² fiasco di HeLa 229 cellule. Aggiungere ri-sospeso C. burnetii a HeLa 229 celle. Incubare per 2 giorni a 37 ° C in 5% CO ₂ per consentire infezione di HeLa 229 cellule per stabilire.
      4. Suddiviso in cellule 175 centimetri ² pallone di coltura tissutale.
         1. Rimuovere i supporti dal pallone 75 centimetri ² e lavare il monostrato due volte con 10 ml di pre-riscaldato PBS.
         2. Aggiungere 1 ml of soluzione e posizionare le cellule 0,05% tripsina-EDTA a CO ₂ 37 ° C + 5% per 3 - 5 minuti per staccare le cellule.
         3. Risospendere le cellule in 10 ml di terreno di mantenimento. Aggiungere 2 ml di cellule risospese in un 175 centimetri ² pallone contenente 38 ml di mezzi di manutenzione.
         4. Incubare a 37 ° C in 5% CO ₂ per altri 3 - 5 giorni fino a raggiungere il 100% di confluenza e si osservano grandi vacuoli.
   2. Raccogliere il surnatante dal cm ² fiasco 175, aggiungere 10 ml di dH ₂ O per coprire i infettate HeLa 229 cellule e incubare per 15 minuti per lisare le cellule infette.
   3. Combinare surnatante e cellule lisate e pellet a 15.000 xg per 15 minuti a RT.
   4. Risospendere pellet in 10 ml di dH ₂ O. cellule Lisare ulteriormente volte passando dalla risospensione attraverso un ago 23G attaccato ad una siringa da 10 ml almeno 20 volte. Pellet a 500 g per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari.
   <li> Rimuovere e surnatante pellet a 15.000 g per 15 minuti a temperatura ambiente per raccogliere C. burnetii.
3. Risospendere C. burnetii in DMEM + 10% FCS e quantificare il numero di batteri come da 4. Diluire a 1 × 10 ⁹ genomi / ml utilizzando DMEM + 10% FCS + 10% dimetilsolfossido (DMSO), le scorte microlitri aliquota 50 in tubi microcentrifuga e conservare a -80 ° C.

2. inversione trasfezione di siRNA e semina dei HeLa 229 cellule (Giorno 4)

1. Quando si utilizza il siRNA sperimentale per la prima volta preparareil siRNA come segue:
   1. centrifugare brevemente il siRNA liofilizzato per garantire che il pellet siRNA viene raccolto sul fondo della provetta.
   2. Risospendere il pellet siRNA ad una concentrazione finale magazzino di 20 micron pipettando il volume appropriato di 1x siRNA tampone (Tabella 2).
   3. Pipettare la soluzione su e giù 3 - 5 volte per mescolare e posto su un mixer orbitale per 30 minuti a RT, invertendo il tubo ogni 5 - 10 min.
   4. Centrifugare brevemente il tubo per garantire la siRNA viene raccolto sul fondo della provetta.
   5. Aliquota del siRNA in 50 aliquote microlitri in tubi microcentrifuga e conservare a -20 ° C fino al momento.
   6. Per generare 1 micron concentrazione di siRNA di lavoro, pipetta 950 ml di 1X siRNA tampone in un magazzino aliquota 50 microlitri (20 micron) quando necessario. Nota: Questa concentrazione di lavoro 1 micron può essere freeze-scongelati più volte per trasfezioni ripetuti.
2. Posizionare DMEM + 10% FCS,0,05% tripsina-EDTA e PBS in un bagno 37 ° C di acqua (o equivalente) per 30 minuti per riscaldare prima dell'uso.
3. Preparazione di componenti di trasfezione:
   Nota: Il seguente protocollo è stato ottimizzato per HeLa 229 celle di una 96 pozzetti micropiastra con pareti nere e TV, fondo trasparente. Ottimizzazione della quantità di reagente di trasfezione, concentrazione di siRNA e semina densità delle cellule può essere necessario per differenti linee cellulari.
   1. Per ogni bene, usare 0,1 ml di reagente di trasfezione, 15,9 ml di medio ridotto di siero (supporti essenziali minimi utilizzati per trasfezioni, fare riferimento alla tabella dei materiali) e 4 ml di 1 micron siRNA (con una conseguente concentrazione di siRNA finale di 40 Nm). Utilizzare tubi microcentrifuga separate per OTP, Plk1, Rab5A e Rab7A. Misurare ogni condizione di test in triplice copia. Un esempio di un layout di piastra a 96 pozzetti è mostrato in figura 3.
      Nota: Questo protocollo incorpora l'uso di due comandi: OTP e Plk1. OTP ècomposto da quattro siRNA pool che sono stati ottimizzati per ridurre gli effetti off-target e quindi OTP viene utilizzato come controllo non-targeting negativo. Rimescolate siRNA potrebbe anche essere usato come controllo negativo. Perdita di risultati di espressione Plk1 in vasta morte cellulare in un certo numero di linee cellulari inducendo percorsi pro-apoptotici e quindi Plk1 siRNA viene utilizzato come controllo positivo per trasfezione in cui la morte delle cellule è correlato alla efficienza di trasfezione.
      1. Per ogni trasfezione di siRNA sperimentale, si combinano 0,4 ml di trasfezione reagente e 63,6 ml di medio ridotto di siero in una provetta per microcentrifuga individuale. Vortex tutti i tubi microcentrifuga e permettono componenti complesse per 5 minuti a temperatura ambiente.
      2. Aggiungere 16μl di ogni siRNA sperimentale per i tubi microcentrifuga corrispondenti contenenti il ​​complesso trasfezione. Vortex e incubare per 20 minuti a RT. Nota: è importante non superare 30 min, l'efficienza di trasfezione diminuirà.
4. Durante la 20 min incubation (2.3.1.2) aggiungere 20 ml di reagente di trasfezione + medio ridotto di siero + siRNA mescolare nei pozzetti appropriati di un sterili nero, piatto chiaro vassoio a 96 pozzetti fondo.
5. Non appena il periodo di incubazione di 20 min è completa, seme HeLa 229 cellule ad una densità di 3,92 × 10 ³ cellule / pozzetto.
   1. Harvest HeLa 229 cellule da un confluenti o sub-confluenti 75 centimetri pallone di coltura tissutale ² in DMEM pre-riscaldato + 10% FCS e risospendere le cellule ad una densità finale di 4,9 × 10 ⁴ cellule / ml secondo metodi standard. Per garantire trasfezione l'efficienza non è compromessa, preparare cellule durante il periodo di incubazione 20 min (2.3.1.2).
      1. Lavare il monostrato di HeLa 229 cellule due volte con 10 ml di PBS preriscaldata.
      2. Aggiungere 1 ml di 0,05% soluzione di tripsina-EDTA e posto HeLa 229 cellule a 37 ° C + 5% CO ₂ da 3 - 5 minuti per staccare le cellule.
      3. Raccogliere cellule in 9 ml di pre-riscaldato DMEM + 10% FCS. conte cellule utilizzando un emocitometro e preparare cellule ad una densità finale di 4,9 × 10 ⁴ cellule / ml utilizzando DMEM + 10% FCS.
   2. Pipettare 80 ml ​​di HeLa 229 cellule a densità di 4,9 × 10 ⁴ cellule / ml in ciascun pozzetto che contiene il reagente di trasfezione + ridotto di siero media + siRNA mix. Ciò corrisponde ad una densità cellulare di 3,92 × 10 ³ cellule / pozzetto.
      Nota: è necessario sottrazione del fondo per il substrato Blam.
      1. Non aggiungere celle o siRNA per pozzi "in bianco" (Figura 3). Invece, aggiungere 80 ml di DMEM + 10% FCS a questi pozzetti allestiti in triplice copia.
   3. Incubare per 24 ore a 37 ° C + 5% CO _2.

3. Variazione media (giorno 5)

1. Dopo 24 ore, rimuovere il supporto utilizzando un adattatore multicanale collegato a una sorgente di depressione o manualmente con una pipetta multicanale, e sostituirlo con 100 ml di Preriscaldare frescoed DMEM + 10% FCS.
2. Incubare per altri 48 ore a 37 ° C + 5% CO _2.
3. A questo punto, verificare la vitalità delle cellule visivamente utilizzando un microscopio ottico standard. Se la trasfezione inverso ha avuto successo, la morte cellulare significativo sarà osservato nei pozzetti contenenti Plk1 siRNA rispetto al OTP siRNA.

4. Quantificazione di Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 Strain utilizzando qPCR (Giorno 7)

1. Dopo 7 giorni di crescita in ACCM-2 a 37 ° C in 5% CO _2, 2,5% O ₂ (1.3), centrifugare il 10 ml C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 a 15.000 g per 15 minuti a temperatura ambiente.
2. Risospendere il pellet batterico in 10 ml di pre-riscaldato DMEM + 10% FCS. Preparare 1:10 e 1: 100 diluizioni della cultura (campione) con dH ₂ O.
3. Impostare i componenti necessari per la qPCR.
   Nota: Estrazione gDNA può essere eseguita in anticipo e conservato a -20 ° C untIl necessario.
   1. Preparazione di norme:
      1. Estratto gDNA da Coxiella burnetii RSA439 NMII wild type ceppo coltivato in ACCM-2 a 37 ° C in 5% di CO _2, 2,5% O ₂ per 7 giorni utilizzando un kit di estrazione gDNA, secondo le istruzioni del produttore.
      2. Misurare la concentrazione gDNA (g / ml) usando un NanoDrop (o equivalente) in assorbanza a 260 nm.
      3. Calcolare il numero di copie del genoma per microlitri utilizzando la seguente formula seguente, e convertire in numero di genomi / ml.
         
      4. Regolare il numero di genomi / ml a 10 ⁹ / ml (in un volume finale di 100 microlitri) in una nuova provetta per microcentrifuga utilizzando dH ₂ O. Questo può essere bollita per 10 minuti e conservato a -20 ° C fino all'utilizzo.
      5. Il giorno dell'infezione, generare 10 diluizioni seriali di 10 ⁸ genomi / ml a 10 ⁵ genomi / ml del genoma 10 ⁹s / magazzino ml.
         1. Pipettare 10 ml di 10 ⁹ genomi / ml in 90 ml di dH ₂ O per generare 10 ⁸ genomi / ml. Vortex per miscelare. Pipettare 10 ml di 10 ⁸ genomi / ml in 90 ml di dH ₂ O per generare 10 ⁷ genomi / ml. Vortex e ripetere fino a 10 ⁵ genomi / ml.
   2. Impostare reazione qPCR. Creare un master mix per 25 pozzi per tenere conto di eventuali errori di pipettamento. Per ogni bene, utilizzare 10 ml qPCR Master Mix; 2 ml di ompA miscela di primer (4.3.2.2) e 3 ml di dH ₂ O.
      Nota: OmpA è una proteina membrana esterna di C. burnetii ^'39 ed una sezione 82-base-pair in una regione altamente conservata è stato selezionato per essere utilizzato come sonda come descritto in precedenza ^40.
      1. Impostare ogni standard (dH ₂ O, 10 ^5, 10 ^6, 10 ^7, 10 ^8, 10 ⁹ genomi / ml) e del campione (1:10 e diluizione 1: 100) in un 96 pozzetti PCR strappare piastra (non-gonna) in due o tre esemplari, rispettivamente. Aggiungere 5 ml di campione o standard nei rispettivi pozzetti.
      2. Utilizzando dH ₂ O, diluire sia il primer forward ompA (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') e ompA primer reverse (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') ad una concentrazione finale di 4 mM e combinare nella stessa provetta per microcentrifuga.
         Nota: La miscela di primer ompA può essere preparata in anticipo e conservato a -20 ° C fino all'utilizzo.
      3. Unire 250 ml qPCR Master Mix, 50 microlitri ompA Primer Mix, 75 ml dH ₂ O e vortex per miscelare. Aggiungere 15 ml di questo master mix di pozzetti contenenti sia standard o campioni.
      4. Mettere 8-coperchio tappi striscia PCR sui pozzetti e centrifugare impulso le provette PCR per garantire che tutto è raccolto nel fondo delle provette.
      5. Impostare il seguente programma su un ma PCR quantitativachine: 50 ° C per 2 min, 95 ° C per 10 minuti, seguita da 45 cicli di 95 ° C per 1 sec e 60 ° C per 20 sec (Figura 4A).
   3. Analizzare il Ct (soglia di ciclo) valori dal qPCR:
      1. Trasferire i valori Ct di un foglio di calcolo utilizzando la funzione di esportazione del programma.
      2. Creare un grafico a dispersione dei principi 10 ⁵ genomi / ml fino al 10 ⁹ genomi / ml (espressi come valori di registro). Eliminare eventuali valori anomali evidenti tra i campioni in triplicato. Genera una linea di tendenza logaritmica e determinare l'equazione del grafico.
      3. Calcolare il numero totale dei genomi / ml del campione utilizzando l'equazione generato in 4.3.3.2. Non dimenticare di spiegare la diluizione iniziale (1:10 e 1: 100) dei campioni.

5. infezione di inversione trasfettate cellule (Giorno 7)

1. Dopo aver calcolato il totale genomi / ml in C. burcultura netii pBlaM-CBU0077 da utilizzare per l'infezione, regolare coltura batterica risospeso per infettare cellule ad una MOI di 300 in un volume finale di 50 ul / pozzetto utilizzando preriscaldata DMEM + 10% FCS.
   Nota: La densità atteso delle teste di serie HeLa 229 cellule con un tempo di raddoppio normale dopo 72 ore è 3.136 × 10 ⁴ cellule / pozzetto. La quantità di batteri necessari per infettare ad una MOI di 300 è 9,408 × 10 ⁶ a 50 microlitri, che equivale a 1,88 × 10 ⁸ batteri / ml.
   1. Utilizzando il valore calcolato dai qPCR (genomi / ml) (4.3.3.3), diluire i batteri risospese mediante pre-riscaldato DMEM + 10% FCS in un volume finale di 2 ml di infettare le cellule transfettate inversa.
2. Rimuovere il supporto esistente dal vuoto e invertire cellule trasfettate.
3. Aggiungere 50 ml di batteri diluito (1,88 × 10 ⁸ batteri / ml) nei rispettivi pozzetti. Aggiungere 50 ml di DMEM + 10% FCS sia al vuoto e upozzi ninfected.
4. Incubare per 24 ore a 37 ° C + 5% CO _2.

6. L'aggiunta di Blam substrato per determinare il livello di traslocazione (Giorno 8)

1. Preparare le soluzioni per la soluzione 6x carico di substrato Blam.
   Nota: Soluzione A, B e C sono forniti nel kit substrato Blam (fare riferimento alla tabella dei materiali). Soluzione B può formare un precipitato a RT. Scaldare questa soluzione a 37 ° C prima dell'uso e il precipitato dovrebbe sciogliere.
   1. Quando si utilizza il kit per la prima volta, aggiungere 185 ml di DMSO (fornite con il kit substrato Blam) per la soluzione essiccata A. Successivamente, memorizzare la ri-sospensione Soluzione A a -20 ° C.
   2. Preparare 0,1 soluzione M probenicid in anticipo e conservare in 1 ml aliquote a -20 ° C fino al momento.
      1. Preparare 0,4 M NaOH (1,6 g in 100 ml dH ₂ O).
      2. Preparare 100 mM Na tampone fosfato pH 8 (1,56 g di NaH ₂ PO ₄ .2H ₂ HPO ₄ in 100 ml dH ₂ O).
      3. Sciogliere 1,25 g di probenicid in 22 ml di 0,4 M di NaOH di agitazione vigorosa.
      4. Aggiungere 22 ml di 100 tampone fosfato a pH 8 mm Na (soluzione diventerà torbida) e mescolare per sciogliere il precipitato che si forma.
      5. Portare il pH a 8 (se necessario) con 1 M NaOH / HCl.
      6. Mescolare vigorosamente e riscaldare leggermente (<50 ° C) fino a quando la soluzione è prevalentemente sereno.
      7. Filtro (0,2 micron dimensione dei pori) e aliquota in 1 ml di volume. aliquote conservare a -20 ° C.
2. Per ogni bene, usare 0,06 ml Soluzione A, 0,54 ml Soluzione B, 7,9 ml Soluzione C e 1,5 ml 0,1 M probenicid. Creare un master mix per i 30 pozzi per primo combinando 1,8 ml di soluzione A e 16.2 ml di soluzione B insieme in una provetta per microcentrifuga. Mescolare bene con un vortice. Aggiungere 237 ml di soluzione di C e 45 ml di 0,1 M probenicid. Vortex di combinare tutti i components.
   Nota: La soluzione 6x carico è stabile fino a 4 ore (al buio) ma deve essere preparato come vicino possibile prima dell'uso.
3. Aggiungere 10 ml di soluzione di 6x carico direttamente in tutti i pozzetti vuoti e retromarcia trasfettate senza rimuovere il supporto esistente.
4. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore al buio.
5. Per determinare il livello di traslocazione, quantificare la quantità di fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre.
   Nota: la seguente procedura è specifica per il lettore ClarioSTAR micropiastre. lettori di micropiastre equivalenti possono anche essere utilizzati.
   1. Creare un nuovo protocollo di intensità di fluorescenza utilizzando endpoint come la modalità di lettura.
   2. Regolare i parametri di base come segue:
      1. Selezionare 96 pozzetti micropiastra.
      2. In Impostazioni ottiche, selezionare 2 multichromatics con le seguenti impostazioni definite dall'utente: (1) Ingresso 410-10 nm di eccitazione e di emissione 520-10 nm. (2) l'eccitazione di ingresso 410-10 nm e 450-10 nm di emissione. Assicurare bene multviene selezionato ichromatics.
      3. Selezionare media orbitale con un diametro di 3 mm.
      4. In ottica, selezionare ottica fondo.
      5. Sotto velocità e precisione, seleziona precisa. Ciò corrisponde a otto regioni per pozzetto.
   3. Regolare il layout della piastra selezionando pozzetti appropriati come campioni.
   4. Seleziona la misura di inizio.
   5. Togliere il coperchio e inserire il vassoio nella lettore di piastre. Per evitare di raggiungere valori massimi di fluorescenza, garantire il valore del guadagno viene regolato. Per fare ciò, eseguire una regolazione del guadagno su uno dei pozzi infetti che è stato inverso trasfettate con siRNA OTP. Ciò corrisponde alla massima traslocazione previsto.
   6. Seleziona la misura di inizio di misurare tutti i pozzetti utilizzando la fluorescenza di fondo ad una eccitazione di 410 nm ed emissione sia di 450 nm e 520 nm per la fluorescenza blu e verde, rispettivamente.

7. Analisi dei risultati:

1. Calcolare il rapportodi 450 nm a 520 nm (blu al verde) per tutti i campioni a seguito della riduzione in bianco ed esprimere rispetto al campione non infetto OTP.
   Nota: le seguenti fasi di analisi sono forniti per un semplice foglio di calcolo.
   1. Utilizzando la funzione di esportazione sul lettore di micropiastre, trasferire i valori di fluorescenza grezzi ottenuti sia per 520 nm e 450 nm lunghezza d'onda di emissione (6,5) in un foglio di calcolo.
   2. Calcolare la media dei valori "vuote" (supporto solo, senza cellule) per la lunghezza d'onda 520 nm aggiungendo i valori 520 nm fluorescenza prime e dividendo per il numero di pozzetti (3). Ripetere utilizzando i vuoti 450 valori nm. Questi valori rappresentano la fluorescenza di fondo a causa della piastra a 96 pozzetti e dei media.
   3. Sottrarre la fluorescenza di fondo. Utilizzando i valori ottenuti al punto 7.1.2 sottrarre la media del fustellato lunghezza d'onda di 520 nm da tutti campione 520 nm valori di fluorescenza. Ripetere l'operazione per i valori di 450 nm di lunghezza d'onda.
   4. Per ottenere il 450: rapporto di 520 nm utilizzare i valori corretti vuoti (7.1.3). Dividere ogni campione di 450 nm valore di fluorescenza per il corrispondente valore di 520 nm.
   5. Calcolare la media dei valori non infetti rapporto OTP aggiungendo i 450: valori del rapporto nm 520 (da 7.1.4) e dividendo per il numero di pozzetti (3).
   6. Calcolare il rapporto dei campioni relativi a non infetto OTP dividendo il 450: rapporto nm 520 calcolato 7.1.4 per la media del valore del rapporto OTP non infetta calcolato 7.1.5.

8. L'aggiunta di Nuclei Stain per determinare il numero delle cellule dopo traslocazione Assay (Giorno 8)

1. Dopo quantificazione della fluorescenza, rimuovere i supporti contenenti soluzione loading 6x da tutti i pozzetti utilizzando un adattatore multicanale collegato a una sorgente di vuoto o manualmente con una pipetta multicanale.
2. Aggiungere 50 ml di soluzione al 4% PFA (paraformaldeide)in PBS a tutti i pozzetti opportuno fissare le cellule. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
3. Rimuovere 4% soluzione PFA PBS (come da 8.1) e lavare le cellule due volte con 75 ml di PBS.
4. Aggiungere 50 ml di una colorazione nucleare permeabile cellula, per esempio DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo), in ciascun pozzetto. Acquisire le immagini con un microscopio a fluorescenza e quantificare il numero di nuclei presenti in ogni pozzetto dopo il trattamento con siRNA utilizzando opportuni software di analisi delle immagini, come ad esempio ImageJ ^41.

Per questo studio, la C. burnetii pBlaM-CBU0077 ceppo è stato selezionato come CBU0077 è stato precedentemente dimostrato di essere un effettore traslocato del sistema di secrezione coxiella Dot / Icm 17. Prima di infezione, il numero totale dei genomi / ml in i sette giorni d'C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 è stato enumerato utilizzando qPCR. La figura 4 dimostra un esempio della soglia di ciclo valori (Ct) attesi da entrambi gli standard e campioni seguenti qPCR. I valori Ct (rappresentati graficamente nella Amplification Plot (Figura 4B) e numericamente (Figura 4C)) sono stati esportati e analizzati come descritto in 4.3.3. Sulla base dei dati rappresentativi riportati, c'erano 2,31 × 10 8 genomi / ml a 10 ml coltura batterica risospeso (Figura 4D). Per generare la diluizione appropriata batterica (1,88 × 10 8 genomi / ml in 2 ml), 1.63 ml di batteri risospeso è stato aggiunto a 370 ml di fresco, pre-riscaldato DMEM + 10% FCS. Le cellule retromarcia trasfettate con siRNA sono stati successivamente infettati con C. burnetii pBlaM-CBU0077 ad una MOI di 300 per 24 ore.

Dopo l'incubazione del rovescio cellule infettate trasfettate con Blam substrato quantificazione dei effettori traslocazione può essere determinato utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza. A seguito di analisi come descritto in 7, tutti i valori del rapporto che sono stati normalizzati per non infetto OTP possono essere normalizzati a infetto OTP. Il livello di effettori traslocazione dopo silenziamento dei geni ospitanti possono essere raggruppati in tre risultati dopo il confronto a infetto controllo OTP: (1) Nessun cambiamento; (2) è aumentato effettori traslocazione; (3) Diminuzione effettori traslocazione. Analisi statistica successivo, per esempio, un test t di Student, può essere utilizzato per determinare la significatività della differenza t osservatao infettato il controllo OTP. Il risultato di silenziamento sia Rab5A o Rab7A su effettore traslocazione da tre esperimenti indipendenti è mostrato in Figura 5A. Una diminuzione significativa del livello di Blam-CBU0077 traslocazione si sono verificati durante il silenziamento di entrambi Rab5A e Rab7A rispetto al controllo OTP (valore p = 0,0088 (Rab5A) e il valore p = 0.0059 (Rab7A), in coppia, test t di Student). è stato anche stabilito l'impatto del trattamento siRNA sulla vitalità cellulare. Dopo il test traslocazione, le cellule sono state fissate, colorate con una macchia nuclei e successivamente quantificati. Come mostrato in Figura 5C, anche se il trattamento sia con Rab5A o Rab7A determina una riduzione della vitalità cellulare rispetto al controllo OTP (12% e 31%, rispettivamente), tale riduzione non è così grave come Plk1 (97%), un gene noto a causare la morte delle cellule (p-value = 0,0102 (Rab5A); p-value = 0,0081 (Rab7A); p-value <0,0001 (Plk1), in coppia, Student t-test). Questi risultati dimostrano come tacere di serie genes utilizzando siRNA possono alterare negativamente i livelli di batteri traslocazione effettrici.

Figura 1. Il meccanismo d'azione del Blam substrato durante l'infezione. C. burnetii è interiorizzato da cellule ospiti e forma un vacuolo lisosoma-derivato chiamato vacuolo -aventi tenore Coxiella. Dopo l'infezione 24 ore, le cellule vengono caricati con la membrana permeabile substrato Blam che possiede due fluorofori che formano una coppia FRET (A). In assenza di β-lattamasi cioè non traslocazione del effettore BLAM-CBU0077, eccitazione della cumarina a 410 risultati nm in FRET a fluoresceina, osservati come segnale di fluorescenza verde (520 nm) (B). Nel caso di un sistema di secrezione Dot / Icm funzionali, la proteina di fusione blam-CBU0077 saranno traslocato nella cellula ospite e sarà clgronda substrato BLAM, tramite l'attività β-lattamasi, provocando la separazione dei due coloranti e conseguente FRET interruzione ed un segnale di fluorescenza blu (450 nm) dopo eccitazione a 410 nm (C). Entrambi i segnali di fluorescenza verde e blu possono essere rilevato utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

. Figura 2. Schema Panoramica del Reverse Transfection e la traslocazione del test del flusso di lavoro Giorno 1: Preparare il C. burnetii pBlaM-CBU0077 cultura Giorno 4:. transfect inversione usando 40 nm siRNA e di semi di HeLa 229 cellule ad una densità finale di 3,92 × 10 3 cellule / pozzetto in un vassoio a 96 pozzetti Giorno 5: Ch.mezzi ange Giorno 7:. quantificare il totale dei genomi / ml di C. burnetii pBlaM-CBU0077 cultura utilizzando qPCR e successivamente infettare le cellule inverso trasfettate con una MOI di 300. 8 ° giorno:. Aggiungere tintura carico 6x, misurare la fluorescenza e quantificare il numero di cellule prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Il layout delle piastre a 96 pozzetti utilizzato per impostare l'inversione Transfection e semina di HeLa 229 cellule. I pozzi "in bianco" (in rosso) contiene solo i media e non è necessario l'aggiunta di una siRNA o HeLa 229 cellule. Il OTP siRNA (mostrato in azzurro per pozzi non infetti e blu scuro per pozzi infettati) viene usato come controllo non-targeting, dal momento che è stato ottimizzato peravere meno effetti la porta. Il marrone e pozzi verdi rappresentano la Rab5A e Rab7A siRNA, rispettivamente. Plk1 siRNA (mostrato in giallo) è usato come una misura di efficienza trasfezione come la perdita di espressione Plk1 può indurre percorsi pro-apoptotici e ampie morte cellulare in una vasta maggioranza delle linee cellulari. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Valori rappresentante qPCR Ct Usato per quantificare il numero totale dei genomi / ml in C. burnetii Cultura pBlaM-CBU0077. (a) le condizioni di ciclo utilizzato nella qPCR per enumerare il numero dei genomi / ml nelle culture Coxiella. I valori Ct per entrambi gli standard ei campioni sono rappresentati in grafico (B) e numerico (C)formati. (D) I valori standard Ct sono stati mediati, rappresentati graficamente e una linea di tendenza logaritmica è stato calcolato. Utilizzando l'equazione e le medie del campione Ct valori del numero totale dei genomi / ml nel C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 è stata determinata da 2.31 ​​× 10 8. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. La traslocazione del Dot / Icm Effector Blam-CBU0077 durante siRNA silenziamento di Rab5A e Rab7A. HeLa 229 cellule sono state inverso trasfettate con siRNA specifico per Rab5A (bar marrone), Rab7A (barre verdi), OTP (blu bar) o Plk1 (barre gialle) e incubate per 72 ore prima dell'infezione con il C. burnetii pBlaM-CBU0077 ceppo ad una MOI di 300 per 24 ore. Dopo tegli aggiunta del substrato Blam, la fluorescenza è stata misurata usando un lettore per micropiastre (A) La tabella mostra i valori di fluorescenza grezzi ottenuti da un singolo esperimento a fianco del 450:. 520 nm rapporto relativo al controllo non infetto OTP dopo la sottrazione dei valori del bianco (i media solo, senza cellule). Il livello di traslocazione (B) e vitalità cellulare (C) sono rappresentati come percentuale media ± deviazione standard relativa alle cellule infettate transfettate OTP inversa da tre esperimenti indipendenti. * P-value <0.05; ** Valore p <0,01; **** P-value <0,0001 (appaiati, Student t-test). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. I componenti necessari per fare 1x ACCM-2.

Tabella 2. Volume di 1x siRNA Buffer Richiesto per idratante liofilizzato siRNA alla concentrazione adeguata.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.