Analisi di Brain mitocondri Utilizzando Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Konark Mukherjee; Helen R. Clark; Vrushali Chavan; Emily K. Benson; Grahame J. Kidd; Sarika Srivastava

doi:10.3791/54214

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Articolo metodologico

Analisi di Brain mitocondri Utilizzando Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

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DOI:

10.3791/54214

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9 luglio 2016

Konark Mukherjee¹ , Helen R. Clark¹ , Vrushali Chavan¹ , Emily K. Benson² , Grahame J. Kidd² , Sarika Srivastava¹

¹Virginia Tech Carilion Research Institute, ²Renovo Neural Incorporated

In questo articolo

Sommario

La visualizzazione e l'analisi mitocondriale dal tessuto cerebrale dei mammiferi è un compito impegnativo. Qui, descriviamo come l'analisi di ricostruzione tridimensionale (3D) dalla microscopia elettronica a scansione seriale a blocchi (SBFSEM) possa essere utilizzata per ottenere informazioni sull'analisi morfologica e volumetrica di questo organello critico generatore di energia.

Abstract

Il cervello umano è un alto organo consumare energia che si basa principalmente su glucosio come fonte di combustibile. Il glucosio è catabolizzata dai mitocondri cerebrali tramite percorsi glicolisi, acido tri-carbossilico (TCA) ciclo e fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per produrre energia cellulare sotto forma di adenosina trifosfato (ATP). Perdite di valore di produzione di ATP mitocondriale provoca disturbi mitocondriali, che presentano clinicamente con sintomi neurologici e miopatici prominenti. Difetti mitocondriali sono presenti in disturbi dello sviluppo neurologico (ad esempio disturbo dello spettro autistico) e disturbi neurodegenerativi anche (ad esempio, sclerosi laterale amiotrofica, il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson). Quindi, vi è un crescente interesse nel campo per l'esecuzione di analisi 3D mitocondriale morfologia, struttura e distribuzione sotto entrambi gli stati sani e malattia. La morfologia mitocondriale cervello è estremamente variegato, con alcuni mitocondri specialmente quelliregione sinaptica essendo nell'intervallo <200 nm di diametro, che è inferiore al limite di risoluzione della microscopia ottica tradizionale. Esprimendo una proteina mitocondrialmente mirati verde fluorescente (GFP) nel cervello migliora in modo significativo la rilevazione organelli mediante microscopia confocale. Tuttavia, non supera i vincoli sulla sensibilità di rilevazione dei mitocondri relativamente piccole dimensioni senza sovra- saturazione delle immagini di grandi dimensioni mitocondri. Mentre microscopia elettronica a trasmissione di serie è stato utilizzato con successo per caratterizzare i mitocondri alla sinapsi neuronali, questa tecnica è notevole spreco di tempo soprattutto quando si confrontano campioni multipli. La tecnica di blocco faccia microscopia elettronica a scansione seriale (SBFSEM) comporta un processo automatizzato di sezionamento, blocchi di imaging di acquisizione dei tessuti e dei dati. Qui, forniamo un protocollo per eseguire SBFSEM di una regione definita da roditore cervello per ricostruire rapidamente e visualizzare la morfologia mitocondriale. questa tecnologianique potrebbe anche essere utilizzato per fornire informazioni accurate sul numero mitocondriale, volume, dimensione e distribuzione in una regione del cervello definito. Dal momento che la risoluzione dell'immagine ottenuta è elevata (in genere sotto i 10 nm) possono essere rilevati anche gli eventuali difetti morfologici mitocondriali lordi.

Introduzione

I mitocondri sono organelli dinamici che cambiano la loro forma e la posizione a seconda delle esigenze spunti e cellulari, in stretta interazione con citoscheletro cellulare, e in risposta ad eventi cellulari come correnti di calcio nei neuroni ^1. I mitocondri interagiscono anche con altri organelli cellulari ad esempio reticolo endoplasmatico, che a sua volta regola la loro dinamica e metabolismo ^2. Morfologia mitocondriale mostra eterogeneità in diversi tipi di cellule ad esempio. la forma del organello varia da tubolare costituita dai fogli, sacchi e ovali ^3. E 'stato dimostrato che mitocondriali fusione e fi....