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Articolo metodologico

Repetitive stimolazione magnetica transcranica al unilaterale emisfero del cervello di ratto

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DOI:

10.3791/54217

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22 ottobre 2016

In questo articolo

Sommario

Abbiamo applicato la stimolazione magnetica transcranica ripetitiva (rTMS) all'emisfero unilaterale del cervello di ratto, posizionando una bobina a forma di 8 da 25 mm 1 cm lateralmente al vertice sulla linea biauricolare e angolando la bobina di 45°. Per rTMS è stato utilizzato un sistema di raffreddamento ad acqua interno per più di 20 minuti.

Abstract

I precedenti modelli di stimolazione magnetica transcranica ripetitiva (rTMS) di roditori adottavano la stimolazione dell'intero cervello invece della rTMS emisferica unilaterale, che è diversa dai protocolli utilizzati per i soggetti umani. Riportiamo un'applicazione di successo della rTMS all'emisfero unilaterale del cervello di ratto. La rTMS è stata erogata con un protocollo di stimolazione a bassa frequenza (1 Hz), ad alta frequenza (20 Hz) o fittizio su un lato del cervello utilizzando una piccola bobina a forma di 8 da 25 mm. Abbiamo posizionato il centro della bobina di 1 cm lateralmente al vertice sulla linea biauricolare e abbiamo angolato la bobina di 45° rispetto al suolo per ridurre al minimo un potenziale effetto diretto della rTMS sulla corteccia controlaterale. Abbiamo anche utilizzato un sistema di raffreddamento ad acqua interno per consentire la stimolazione magnetica ripetitiva per più di 20 minuti, anche a una frequenza di stimolazione di 20 Hz. Gli aumenti delle trascrizioni dei geni precoci immediati (Arc, Junb ed Egr2) sono stati maggiori dopo rTMS che dopo stimolazione fittizia. Dopo 5 giorni consecutivi di rTMS a 1 Hz di 20 minuti, l'espressione dell'mRNA di bdnf era significativamente più alta nella corteccia stimolata rispetto al lato controlaterale. Il modello qui presentato chiarirà i meccanismi molecolari della rTMS consentendo l'analisi della differenza interemisferica nel suo effetto.

Introduzione

Repetitive stimolazione magnetica transcranica (TMS), uno strumento per la stimolazione cerebrale non invasiva e neuromodulazione, è stato applicato nel trattamento di varie condizioni come il dolore centrale 1,2, depressione 3, l'emicrania 4, e anche ictus 5-7. Rapido cambiamento di corrente elettrica attraverso le bobine sulla testa induce un campo elettrico sulla corteccia cerebrale e una attivazione neuronale risultante. L'eccitabilità della corteccia cerebrale può essere modulata da TMS, che possono durare per più di 30 minuti dopo la stimolazione è terminata.

Meccanismi suggeriti dei rTMS dopo-effetto includono potenziamento a lungo termine / depressione-come effetto 8, spostamento transitorio in equilibrio ionico 9, e metaboliche cambia 10. Inoltre, Di Lazzaro et al. suggeriscono che la stimolazione intermittente theta-burst colpisce gli ingressi sinaptici eccitatori al piramidale neuroni del tratto, sia nel stimolatae l'emisfero controlaterale 11.

significative limitazioni, tuttavia, hanno ostacolato i ricercatori da tradurre prove su banco a situazioni cliniche. In primo luogo, in studi su animali precedenti, rTMS è stato utilizzato per la stimolazione tutto il cervello 12. Stimolazione tutto il cervello è molto diverso dai protocolli utilizzati negli studi sull'uomo 9. L'altro problema è correlato con la durata stimolazione. Questo è almeno in parte attribuibile al fatto che un efficace sistema di raffreddamento è stato disponibile per piccole bobine in passato.

Negli ultimi anni, articoli seminali sono stati pubblicati suggerendo modi per superare queste difficoltà nell'esperimento rTMS sul cervello piccolo animale. Con questi modelli animali, è stato rivelato che il cervello di ratto mostra anche simili cambiamenti eccitabilità corticale come nella umana in risposta a rTMS a bassa frequenza 13. Ancora più importante, i meccanismi cellulari e molecolari della rTMS sono sempre più being studiata utilizzando modelli animali di rTMS. Un esempio calzante è che un tipo distinto di interneurone inibitorio è noto per essere più sensibili al intermittente theta stimolazione scoppio 14. modelli di roditori di rTMS, in tal modo, offrono nuove opportunità per esplorare questioni molto ricercato sulle basi molecolari di cambiamenti rTMS-indotti. Se i piccoli modelli animali di rTMS possono essere utilizzati in più laboratori, può notevolmente accelerare e rafforzare la ricerca in questo settore.

Descriviamo ora come applicare rTMS per l'emisfero unilaterale di cervello di ratto, un prolungamento del lavoro precedente 15. modifiche stimolazione indotta sono stati valutati utilizzando micro-tomografia ad emissione di positroni (PET) e microarray mRNA per studiare i cambiamenti rTMS-indotti nella corteccia cerebrale stimolata.

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Protocollo

Tutte le procedure che utilizzano gli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali di Seoul National University Hospital.

1. apparato sperimentale

  1. preparazione degli animali
    1. Consentire ratti maschi Sprague-Dawley 1 settimana a adattarsi al loro nuovo ambiente prima di iniziare l'esperimento.
      NOTA: Sebbene 8 settimane ratti sono stati utilizzati nel presente studio, un sviluppo o cervello adulto può essere scelto secondo le ipotesi di ricerca.
  2. l'anestesia per inalazione per l'induzione
    1. Indurre e mantenere l'anestesia con il 5% e il 2% di isoflurano disciolto in 40% / 60% e il 25% / 75% di ossigeno / azoto tramite un cono camera ed il naso, rispettivamente. Regolare la profondità dell'anestesia al livello di abolire il riflesso pedale ritiro a pizzico punta a confermare il corretto anestesia.
      NOTA: L'uso di animali risvegliati può essere una scelta migliore in termini traslazionali, ma ci sono difficoltà per trattenere durante rTMS e they sono inclini a stress eccessivo.
    2. Monitorare la temperatura corporea con una sonda rettale e mantenerla a 37 ° C utilizzando una coperta omeotermi. Monitorare profondità dell'anestesia tramite pedale ritiro reflex, temperatura, frequenza respiratoria e della frequenza cardiaca.
  3. Switch-over per l'anestesia per via endovenosa per la manutenzione
    1. Preparare la coda con un tampone imbevuto di alcool. Cateterizzare una vena della coda laterale con un catetere venoso 24-gauge per il passaggio in IV anestesia (Figura 1A). Carico propofol per via endovenosa (1 mg / kg [· min] oltre 10 min, utilizzando 10 mg / ml di emulsione) agli animali. Interrompere isoflurano 5 minuti dopo l'inizio del propofol carico.
    2. Mantenere propofol sedazione ad una velocità di infusione di 500 - 700 pg / (kg · min) durante l'esperimento, come in un precedente studio 16. Supplemento ossigeno a 0,8 L / min tramite un cono di naso.
      NOTA: anestesia con propofol è quello di ridurre il potenziale soppressione di eccitabilità corticale dal inspagente zione 17-19. Tuttavia, l'anestesia non è obbligatorio in esperimenti rTMS, e gli animali risvegliato può anche essere usato. metodi di anestesia deve essere stabilito in considerazione delle ipotesi di ricerca.
    3. Usare pomata veterinario occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
    4. Applicare la stimolazione magnetica (vedi Sezione 2) 10 min dopo la completa transizione al IV anestesia.
  4. le condizioni di recupero
    1. Monitorare i segni vitali durante la fase di recupero. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Se un animale è stato sottoposto a un intervento chirurgico, non restituirlo alla compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
      NOTA: Se si esegue un intervento chirurgico per un modello di malattia, la gestione del dolore post-chirurgico è necessario. Tuttavia, la gestione del dolore non è necessario per questo esperimento rTMS.

2. ripetitiva Stimolazione Magnetica Transcranica

  1. Stimolatore e la bobina
    1. Applicare la stimolazione utilizzando uno stimolatore ripetitivo che offre stimoli bifasici tramite 25 mm Figura 8-coil. Localizzare il centro della bobina 0,5 cm lateralmente al vertice sulla linea biauricular e angulate la bobina 45 ° a terra.
      NOTA: L'intensità del campo magnetico massimo della bobina è 4,0 T. La bobina magnetica è montato saldamente su un supporto incorporato.
  2. soglia motoria
    1. Determinare la soglia motoria (MT) al punto caldo, con il centro della bobina posizionata 0,5 cm lateralmente al vertice sulla linea biauricular e con la superficie piana sul calvaria. Questa è la stessa metodologia utilizzata in uno studio precedente 20.
      NOTA: Definire MT come l'intensità minima di stimolo evocando 5 o più palpabile contrazioni sulla zampa anteriore controlaterale di 10 stimoli consecutivi. Verificare se la stimolazione è principalmente causando controlaterale contrazione muscolare per garantire la stimolazione unilaterale.
  3. L'applicazione di rTMS
    1. Applicare rTMS 10 minuti dopo la stabilizzazione di anestesia profonda. Posizionare il centro della bobina al sito rTMS bersaglio, scelto tra i cortecce cerebrali seconda domande di ricerca. Quindi, inclinare la bobina per assicurare il contatto diretto tra il centro della bobina e la superficie del cranio nel punto di stimolazione.
      NOTA: Per esempio, angulate la bobina 45 ° a terra per minimizzare un potenziale effetto diretto della rTMS sulla corteccia controlaterale (Figura 1B e 1C).
    2. Sottoporre gli animali ad una sessione di 20 min rTMS dell'emisfero unilaterale. Utilizzando la console software, fornire rTMS con una bassa frequenza (1 Hz), ad alta frequenza (20 Hz), o protocollo di stimolazione simulata, e impostare l'intensità della stimolazione a 100-110% della MT.
    3. Eseguire 1 Hz stimolazione senza riposo. Utilizzando la console di input software "1.200" colpi di "20" min). Per 20 Hz stimolazione, condurre 2 sec di stimolazione seguita da 28sec di riposo. Utilizzando la console di input software "1.600" colpi per minuto "20".
    4. Per la stimolazione sham, inclinare la bobina perpendicolare (rotazione di 90 °) per calvaria e posizionare il bordo della bobina 2 cm di distanza dalla superficie della testa (Figura 1D). Fissare il supporto della bobina saldamente al dispositivo principale; non vi è alcuna necessità di tenere la bobina a mano durante l'esperimento.
      NOTA: Per compensare gli effetti non specifici acustici e altri, protocolli sham distinte devono essere utilizzati per i protocolli di stimolazione distinti. Ad esempio, la stimolazione sham 1-Hz può essere usato per 1 Hz rTMS esperimenti.
  4. Raffreddamento della bobina
    1. Utilizzare un sistema di raffreddamento ad acqua per consentire stimolazione magnetica ripetitiva per più di 20 minuti a 1 e da 20 Hz frequenze di stimolazione (Figura 2). Circolare acqua ghiacciata circonda tutta la lunghezza della bobina durante l'esperimento per evitare il surriscaldamento, anche se la temperatura della batteria o stimolatore non viene monitorato.
      NOTA: disponibili in commercio bobine ratto raffreddate possono anche essere utilizzati.
    2. Se possibile, controllare la temperatura della batteria osservando l'indicatore di riscaldamento della macchina rTMS. NOTA: Non ci sono state conseguenze negative legate alla stimolazione rTMS. Vi è, tuttavia, un potenziale rischio ustione se tag di identificazione metallo orecchie vengono utilizzati in prossimità della bobina stimolante.

3. Micro Positron Emission Tomography

  1. preparazione degli animali
    1. Condurre anestesia per inalazione per l'induzione e IV anestesia per la manutenzione (vedi punto 1.2.1 e 1.3.1). Applicare 1 Hz rTMS ad un animale per 10 minuti ad una intensità di stimolazione del 100-110% della MT.
    2. Cinque minuti dopo aver terminato la stimolazione rTMS, iniettare 1 mCi di 2- [F-18] fluoro-desossiglucosio (18 FDG) sciolti in 0,5 ml di soluzione fisiologica per via endovenosa utilizzando un catetere vena della coda. Lasciare 30 minuti per 18 FDG. NOTA: Posizionare il topo sotto anestesia durante l'intero micro-PEesperimento T.
  2. analisi delle immagini
    1. Utilizzare uno scanner PET per l'imaging del cervello per riaffermare l'unilateralità della stimolazione. Ricostruire le immagini con un 3-D algoritmo iterativo. Per valutare i cambiamenti nel metabolismo indotti da TMS, identificare le regioni di interesse (ROI) nelle immagini delle sezioni di cervello trasversali 21.
  3. Eutanasia
    1. Dopo aver eseguito l'imaging micro-PET, eutanasia i topi in una camera di pre-riempite con anidride carbonica mentre i ratti sono in anestesia profonda.

4. mRNA microarray

  1. Eutanasia
    1. Indurre e mantenere l'anestesia con il 5% e il 2% di isoflurano disciolto in 40% / 60% e il 25% / 75% di ossigeno / azoto tramite un cono camera ed il naso, rispettivamente. Anestetizzare profondamente al livello di abolire il riflesso pedale ritiro a pizzico punta prima di essere decapitato.
    2. Decapitare i ratti di eutanasia 5 minuti dopo 1 seduta di 1-Hz rTMS.
  2. raccolta dei tessuti
    1. Disporre i materiali e gli strumenti chirurgici in ordine di utilizzo, tra cui asciugamani piegati di carta, un rongeur osso, microscissors, forbici chirurgiche più grandi, un microforcep, una lama di bisturi n ° 10 o 11, un coperchio 10 cm piatto di vetro Petri riempite con ghiaccio , e tubi da 1,5 ml. Preparare un sacchetto di plastica per lo smaltimento delle carcasse.
    2. Effettuare una incisione cutanea mediana nel anterioposteriorly cranio. Senza mezzi termini sezionare i tessuti molli e muscoli circostanti con le forbici chirurgiche, e togliere il pezzo di osso del cranio con un rongeur osso. sezionare rapidamente il cervello fresco con cura dal cranio. Poi, si trovava sul ghiaccio utilizzando i microforceps e microscissors. Sciacquare il tessuto cerebrale in ghiacciata soluzione fisiologica.
    3. Trasferire il cervello di ghiaccio secco immediatamente, e successivamente conservarlo a -80 ° C in un tubo fino al procedimento.
    4. Scongelare il tessuto cerebrale prima della raccolta.
    5. Posizionare dorsale del cervello rivolta verso l'alto, e raccogliere il tessuto cerebrale dalla stimulated corteccia cerebrale (intorno al punto caldo nella corteccia motoria primaria) su ghiaccio utilizzando i microforceps e microscissors. Mettere il tessuto raccolto nel tubo da 1,5 ml.
  3. preparazione RNA
    1. Estratto RNA totale da omogenati di tessuti utilizzando la lisi dei reagenti 22. Processo con DNasi digestione e procedure di clean-up. Quantificare i campioni di RNA e le aliquote e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
    2. Per controllo di qualità, valutare RNA purezza e integrità denaturazione elettroforesi su gel, con un rapporto di OD 260: 280, e analizzarli su un analizzatore disponibile in commercio.
  4. Etichettatura e purificazione
    1. Amplificare e purificare RNA totale utilizzando un kit di RNA di amplificazione disponibile in commercio a cedere cRNA biotinilato. Brevemente, reverse-trascrivere 550 ng di RNA totale di cDNA usando un primer T7 oligo (dT). Sintetizzare e in vitro trascrivere il secondo filamento cDNA e poi etichettarlo con biotina-NTP.
    2. dopo purification, quantificare cDNA utilizzando uno spettrofotometro.
  5. Ibridazione e esportazione di dati 23
    1. Utilizzare il beadchip espressione per l'analisi di espressione dell'mRNA. Ibridare le etichettati 750-NG campioni di cDNA per ogni ratto-12 espressione di matrice tallone per 16 - 18 ore a 58 ° C. Effettuare il rilevamento dei segnali gamma utilizzando streptavidina-Cy3.
    2. array di scansione con uno scanner confocale. Eseguire l'elaborazione esportazione dei dati di array e analisi utilizzando un software disponibile in commercio.

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Risultati

Quindici 8 settimane di età ratti maschi Sprague-Dawley sono stati utilizzati per un separato inter-rater analisi di affidabilità della determinazione MT. Utilizzando la palpazione di contrazioni muscolari, le MTS erano ottenibili in tutti i ratti e calcolate in 33,00 ± 4,21% di uscita massima stimolatore (% MSO) e 33.93 ± 0,88% MSO, rispettivamente, da due ricercatori indipendenti. bias di Bland-Altman era -0.93, e limiti al 95% di accordo erano -9,13 a 7,26%.

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Discussione

Lo scopo principale di questo studio è stato quello di introdurre un modello animale di rTMS unilaterali. Sebbene stimolazione unilaterale è una delle caratteristiche fondamentali della ricerca rTMS umani, molti studi non hanno adottata nei piccoli animali. Tuttavia, Rotenberg et al. 15 registrate deputati controlaterali con stimolazione del 100% MT utilizzando una bobina figura-8 con diametro lobo esterno di 20 mm, mentre la stimolazione con 112,5% e 133,3% MT prodotta omolaterale nonché deput...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalla Korea Research Foundation Grant finanziata dal governo coreano (KRF-2008-313-E00458). Gli autori ringraziano Jin-Joo Lee per l'assistenza tecnica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Coperta omeotermica con sonda rettaleApparecchio Harvard507222F
Isoflurano (Forano sol.)Choongwae
Propofol (Provive Inj. 1% 20 ml)Claris Lifesciences
Stimolatore magnetico ripetitivo (Magstim Rapid2)Magstim Company Ltd
25 mm figura di 8 bobinaMagstim Company Ltd1165-00
PET-CTGE Healthcare
QIAreagente per lisi dello zolloQiagen(brevetto USA n. 5,346,994)
Mini kit per tessuti lipidici RNeasyQiagen74804
RNeasy Mini Spin ColumnsQiagen(Mat n. 1011708)
Bioanalizzatore Agilent 2100Agilent Technologies
Kit di amplificazione dell'RNA Ambion IlluminaSpettrofotometro Ambion
Nanodrop NanoDropND-1000
Illumina RatRef-12 Espressione BeadChipIllumina, Inc.
Amersham fluorolink streptavidina-Cy3GE Healthcare Bio-Scienze

Riferimenti

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Ristampe e permessi

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rTMS unilateraleStimolazione cerebrale di rattoBobina a ottoSistema di raffreddamento ad acquaDeterminazione della soglia motoriaGeni precoci immediatiEspressione di BDNFMetabolismo del glucosioDifferenze interemisferiche