La mitosi è fondamentale per ogni organismo vivente e i difetti spesso portano al cancro e ai disturbi dello sviluppo. Utilizzando questo protocollo di imaging e il pesce zebra come sistema modello, i ricercatori possono visualizzare la mitosi in un organismo vertebrato vivo e la moltitudine di difetti che si verificano quando i processi mitotici sono difettosi.
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Articolo metodologico
Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
La mitosi è fondamentale per la crescita e la differenziazione organismal. Il processo è altamente dinamico e richiede ordinato eventi per realizzare una corretta condensazione della cromatina, l'attaccamento ai microtubuli cinetocoro, segregazione dei cromosomi, e citocinesi in un piccolo lasso di tempo. Errori nel delicato processo può portare a malattie umane, tra cui difetti di nascita e il cancro. Gli approcci tradizionali che indagano stati di malattia mitotico umani spesso si basano su sistemi di coltura cellulare, che non hanno la naturale fisiologia e contesto di sviluppo / tessuto-specifica vantaggiosa quando si studia la malattia umana. Questo protocollo supera molti ostacoli, fornendo un modo per visualizzare, ad alta risoluzione, la dinamica dei cromosomi in un sistema di vertebrati, il pesce zebra. Questo protocollo saranno i dettagli di un approccio che può essere usato per ottenere immagini dinamiche di cellule in divisione, che comprendono: la trascrizione in vitro, allevamento zebrafish / raccolta, embrione embedding, e time-lapse imaging. Ottimizzazione e modifications di questo protocollo sono anche esplorati. Utilizzando H2A.F / Z-EGFP (etichette cromatina) e mCherry-CAAX (etichette cella a membrana) embrioni mRNA-iniettato, mitosi in AB wild-type, auroraB hi1045, e hi2865 ESCO2 zebrafish mutante viene visualizzato. Ad alta risoluzione delle immagini dal vivo in zebrafish permette di osservare più mitosi per quantificare statisticamente difetti mitotici e tempi di progressione mitotico. Inoltre, si osservano osservazione di aspetti qualitativi che definiscono i processi impropri mitosi (ad esempio, difetti congressione, missegregation di cromosomi, ecc) e gli esiti cromosomiche improprio (ad esempio, aneuploidia, poliploidia, micronuclei, etc.). Questo test può essere applicato alla osservazione di tessuti differenziazione / sviluppo ed è suscettibile all'uso di zebrafish mutante e agenti farmacologici. Visualizzazione di come difetti di mitosi portare a disturbi del cancro e di sviluppo sarà notevolmentemigliorare la comprensione della patogenesi della malattia.
Introduzione
La mitosi è un essenziale processo cellulare fondamentale per la crescita, la differenziazione e la rigenerazione in un organismo vivente. Dopo accurata preparazione e la replicazione del DNA in interfase, la cella è innescato per dividere. La prima fase della mitosi, profase, viene avviata dall'attivazione della ciclina B / Cdk1. Prophase è caratterizzata dalla condensazione del materiale cromatina in cromosomi. Nucleare ripartizione busta avviene al passaggio tra profase e prometafase. In prometafase, centrosomi, il centro di nucleazione per la formazione del fuso, cominciano a migrare verso poli opposti, estendendo microtubuli in cerca di attaccamento cinetoco....
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Protocollo
1. in vitro Trascrizione
- Linearizzare pCS2-H2A.F / Z-EGFP e / o vettori pCS2-mCherry-CAAX per restrizione NotI enzima digerire 31. L'utilizzo di un RNA nel kit di trascrizione in vitro, generare 5 'prodotti mRNA ricoperti da ogni modello, secondo il protocollo del produttore.
- Purificare i mRNA innevate con un kit di purificazione. Seguire le istruzioni del produttore. Eluire con RNasi-free H 2 O.
- Determinare la concentrazione di RNA mediante assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro. (OD 260 x diluizione x 40 mcg / ml).
- Diluire l'RNA a 100 ng / ....
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Risultati
La figura 2 mostra la capacità di osservare molte divisioni cellulari che utilizzano un ampio panorama di un campo di tipo selvaggio coda zebrafish AB. Oltre sette cellule mitotiche vengono esposte in un arco di tempo 14 min (Film 1). Entro il corso di due ore, più di 40 eventi mitotico sono stati catturati. In media, 50 cellule in divisione sono stati osservati nel 30 AB e divisione delle cellule in AUR B m / m embrioni
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Discussione
L'uso di questo metodo permette di dedurre ripartizione nucleare envelope, formazione di una piastra di metafase da allegati microtubuli cinetocoro, e la segregazione dei cromatidi fratelli per formare due nuove cellule in vivo e in un modo dipendente dal tempo. La capacità di osservare mitosi in zebrafish è vantaggioso su campioni fissati e sistemi di coltura cellulare perché le cellule vengono ripreso nella fisiologia naturale, il tessuto è trasparente che permette proteine fluorescenti da utilizzare, s.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Kristen Kwan per i vettori pCS2-H2A.F/Z-EGFP e pCS2-mCherry-CAAX. Ringraziamo Chris Rodesch per averci insegnato l'imaging dal vivo nel pesce zebra. Ringraziamo Shawn Williams, Erik Malarkey e Brad Yoder per l'assistenza nell'imaging confocale presso UAB e l'High Resolution Imaging Facility presso UAB. La struttura di imaging ad alta risoluzione è supportata dall'UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) e dal Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. è supportato dal National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105) e da sovvenzioni pilota dell'American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) e dell'UAB C....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vettori pCS2 | Regalo di K. Kwan | Per il plasmide di interesse | |
| Enzima di restrizione NotI-HF | New England BioLabs | R3189S | Per la restrizione digest del plasmide |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | Per la trascrizione in vitro |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | Per la purificazione dell'mRNA |
| 100 x 15 mm piastre di Petri | Fisher | Scientific FB0875712 | Per l'alloggiamento di embrioni stampo |
| per microiniezione | fatto in casa | Per contenere embrioni durante la microiniezione | |
| Agarosio II | Amresco | 0815-25G | Per l'inclusione di embrioni |
| Tricaina | Sigma-Aldrich | E10521-10G | Per l'anestetizzazione di embrioni |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S9888 | Per l'acqua dell'embrione (E3 Blue), disciolto in UltraPure H2O |
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich | P3911 | Per l'acqua dell'embrione (E3 Blue), disciolto in UltraPure H2O |
| Cloruro di calcio diidrato | Sigma-Aldrich | C8106 | Per l'acqua dell'embrione (E3 Blue), disciolto in UltraPure H2O |
| Solfato di magnesio | Fisher Scientific | M7506 | Per l'acqua dell'embrione (E3 Blue), disciolta in UltraPure H2O |
| Metilene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | Per l'acqua dell'embrione (E3 Blue), disciolta in UltraPure H2O |
| 100 mm provetta di coltura | Fisher Scientific | 50-819-812 | Per agar fuso |
| 35 mm di vetro vetrino coprioggetto fondo piatto di coltura | MatTek Corp | P35G-0-20-C | N. 0, vetro da 20 mm, per l'inclusione di embrioni |
| #5 pinzette | Dumont | 72701-D | Per la dechorionizzazione di embrioni |
| 21 G 1 1/2 gauge | ago Becton Dickinson | 305167 | Per il posizionamento di embrioni in agar |
| Microscopio da dissezione | Nikon AZ100 | Per lo screening e l'inclusione di embrioni, qualsiasi cannocchiale da dissezione andrà bene | |
| Microscopio confocale | Nikon A1+ | Per l'imaging time-lapse | |
| Software confocale | NIS Elements AR 4.13.00 | Per l'acquisizione e l'elaborazione delle immagini |
Riferimenti
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder....
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Ristampe e permessi
