VacuSIP, un metodo migliorato per Inex<em&gt; In Situ</em&gt; Misura di particolato e sciolto composti elaborati da Alimentatori sospensioni attive

Sommario

Presentiamo il VacuSIP, un metodo semplice, non intrusivo e affidabile per il campionamento puntuale pulito e accurato dell'acqua. Il sistema è stato sviluppato e valutato per la raccolta simultanea dell'acqua inalata ed espirata da alimentatori di sospensioni bentoniche in situ, per misurare in modo pulito la rimozione e l'escrezione del particolato e dei composti disciolti.

Abstract

Gli alimentatori in sospensione bentonici svolgono un ruolo essenziale nel funzionamento degli ecosistemi marini. Filtrando grandi volumi d'acqua, rimuovendo plancton e detriti ed espellendo il particolato e i composti disciolti, fungono da agenti importanti per l'accoppiamento bento-pelagico. Misurare accuratamente i composti rimossi ed escreti dai mangiatori in sospensione (come spugne, ascidie, policheti, bivalvi) è fondamentale per lo studio della loro fisiologia, metabolismo ed ecologia alimentare, ed è fondamentale per determinare la rilevanza ecologica dei flussi di nutrienti mediati da questi organismi. Tuttavia, la valutazione della velocità con cui gli alimentatori in sospensione trattano il particolato e i composti disciolti in natura è limitata dai limiti delle metodologie attualmente disponibili. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo semplice, affidabile e non intrusivo che consentisse il campionamento di acqua pulita e controllata da un punto specifico, come l'apertura di corrente degli alimentatori di sospensioni bentoniche, in situ. Il nostro metodo consente il campionamento simultaneo dell'acqua inalata ed espirata dell'organismo studiato utilizzando minuscoli tubi installati su un dispositivo manipolatore costruito su misura e accuratamente posizionati all'interno dell'orifizio espirante dell'organismo campionato. La perforazione di un setto sul recipiente di raccolta con un ago per siringa attaccato all'estremità distale di ciascun tubo consente alla pressione esterna di forzare lentamente l'acqua campionata nel recipiente attraverso il tubo di campionamento. La velocità di campionamento lenta e controllata consente di integrare la irregolarità intrinseca nell'acqua, garantendo al contempo un campionamento privo di contaminazione. Forniamo raccomandazioni per i dispositivi di filtraggio, il recipiente di raccolta e le procedure di conservazione più adatti per l'analisi di diversi particolati e composti disciolti. Il sistema VacuSIP offre un metodo affidabile per la quantificazione del metabolismo indisturbato degli alimentatori in sospensione in condizioni naturali, economico e facile da imparare e applicare per valutare la fisiologia e il ruolo funzionale degli alimentatori filtranti in diversi ecosistemi.

Introduzione

Alimentatori sospensione bentonici giocano un ruolo essenziale nel funzionamento degli ecosistemi marini ^1. Filtrando grandi volumi di acqua ^2,3, rimuovono e espellono particolato (plancton e detriti) e composti disciolti ¹ (e riferimenti) e sono un importante agente di bentonica-pelagica accoppiamento ^4,5 e il ciclo dei nutrienti ^6,7. Misurare accuratamente la presenza di particelle e composti disciolti rimossi ed escreto dal alimentatori sospensione bentonici (come spugne, ascidie, policheti, e bivalvi) è fondamentale per capire la loro fisiologia, metabolismo, e l'ecologia alimentazione. Insieme con pompaggio misurazione della frequenza, ma consente anche una quantificazione dei flussi di nutrienti mediate da questi organismi e il loro impatto ecologico sulla qualità delle acque, nonché sui processi scala ecosistema.

La scelta del metodo appropriato di misurazione di rimozione e di produzione tassi di particolato e com discioltochili di sospensione filtratori è fondamentale per ottenere dati affidabili relativi alla loro attività di alimentazione ^8. Come sottolineato da Riisgård e altri, non appropriate metodologie di polarizzazione risultati, falsare le condizioni sperimentali, la produzione di stime errate di ingestione ed escrezione di determinate sostanze, e può portare a quantificazione errata dei flussi di nutrienti elaborati da questi organismi.

I due metodi più frequentemente utilizzati per misurare le particelle e flussi di nutrienti disciolti in filtratori coinvolgere sia incubazione (tecniche indirette) o la raccolta simultanea di ambiente e acqua espirata (tecniche dirette). Tecniche di incubazione si basano sulla misura della velocità di variazione della concentrazione di particelle e nutrienti disciolti nell'acqua incubate, e stima dei tassi di produzione o rimozione rispetto ai controlli adeguati ^8. Tuttavia, allegando un organismo in una camera di incubazione può modificare la sua Feeding e pompaggio comportamento a causa di cambiamenti nel regime di flusso naturale, a causa di un calo di ossigeno e / o della concentrazione di cibo, o a causa di accumulo di composti di escrezione del ^7,9 acqua incubazione (e riferimenti). Oltre agli effetti di isolamento e fornitura di acqua modificato, una grande polarizzazione di tecniche di incubazione deriva da effetti ri-filtrazione (vedi ad esempio ^10). Sebbene alcuni di questi problemi metodologici sono stati superati utilizzando il giusto volume e la forma del recipiente di incubazione ¹¹ o con l'introduzione di un sistema di campana ricircolo in situ ^12, questa tecnica spesso sottostima asportazione e di produzione. Quantificare il metabolismo dei composti disciolti quali azoto organico disciolto (DON) e carbonio (DOC) o nutritivi inorganici, ha dimostrato di essere particolarmente inclini a distorsioni causate da tecniche di incubazione ^13.

Alla fine degli anni '60 e primi anni '70, Henry Reiswig^9,14,15 aperto la strada all'applicazione di tecniche dirette per quantificare la rimozione di particelle da giganti spugne caraibiche, campionando separatamente l'acqua inspirato ed espirato dagli organismi in situ. A causa della difficoltà di applicare la tecnica di Reiswig su sospensivori piccole e in condizioni subacquee più impegnative, la maggior parte della ricerca in questo campo è stata limitata al laboratorio (in vitro) impiegando lo più tecniche di incubazione indirette ^16. Yahel e colleghi rimontati Reiswig di diretta in situ tecnica di lavorare in condizioni di minori dimensioni. Il loro metodo, chiamato Inex ^16, si basa sul campionamento simultaneo subacquea dell'acqua per via inalatoria (In) e esalato (Ex) da organismi indisturbati. La diversa concentrazione di una sostanza (ad esempio, batteri) tra una coppia di campioni (INEX) fornisce una misura della ritenzione (o produzione) della sostanza da parte dell'animale. La tecnica Inex impiega tubi aperti esi basa sul jet excurrent prodotte dall'attività di pompaggio dell'organismo studiata per sostituire passivamente all'acqua ambiente nel tubo di raccolta. Mentre Yahel e colleghi hanno applicato con successo questa tecnica per lo studio di oltre 15 sospensione di diversi alimentatori taxa (ad esempio, ^17), il metodo è vincolato per l'elevato livello di pratica e l'esperienza necessarie, dalla dimensione minuscola di alcuni orifizi excurrent, e condizioni del mare.

Per superare questi ostacoli, abbiamo sviluppato una tecnica alternativa basata su aspirazione controllata dell'acqua campionato attraverso tubi minute (diametro esterno <1,6 mm). Il nostro scopo era quello di creare un dispositivo semplice, affidabile ed economico che consenta pulita e controllata in campionamento dell'acqua situ da un punto molto specifico, come l'orifizio excurrent di alimentatori sospensione bentonici. Per essere efficace, il metodo deve essere non-intrusivo in modo da non influenzare il regime di flusso ambiente o modificare il behavior degli organismi studiati. Il dispositivo presentato qui è chiamato VacuSIP. È una semplificazione del sistema SIP sviluppato da Yahel et al. (2007) ¹⁸ per il campionamento punto ROV-based nel mare profondo. Il VacuSIP è notevolmente più conveniente che il SIP originale ed è stato adattato per il lavoro SCUBA-based. Il sistema è stato progettato secondo i principi presentati e testati da Wright e Stephens (1978) ¹⁹ e Møhlenberg e Riisgård (1978) ²⁰ per le impostazioni di laboratorio.

Sebbene il sistema VacuSIP stato progettato per studi situ del metabolismo di alimentatori sospensione bentonici, può essere utilizzato anche per studi di laboratorio e ovunque sia richiesto un campione di acqua da sorgente puntiforme controllata e pulita. Il sistema è particolarmente utile quando è richiesto l'integrazione per periodi prolungati (min-ore) o in filtrazioni situ. Il VacuSIP è stato utilizzato con successo presso il laboratorio Yahel a partire dal 2011, e ha anchestato impiegato in due recenti studi dei flussi di nutrienti mediati da specie di spugne caraibiche e mediterranee ²¹ (Morganti et al. submitted).

L'utilizzo di campionatori specifici, la durata di campionamento prolungato, e le condizioni del campo, in cui si applica VacuSIP, comporta alcune differenze rispetto a protocolli standard di oceanografici per la raccolta, il filtraggio e la conservazione dei campioni per analiti sensibili. Per ridurre il rischio di contaminazione da parte del sistema VacuSIP o il rischio di modificazione dell'acqua campionata dall'attività batterica dopo la raccolta, abbiamo testato varie procedure di filtrazione e stoccaggio situ. Diversi dispositivi di filtraggio, recipienti di raccolta e procedure memorizzazione sono stati esaminati per conseguire la tecnica più adatta per l'analisi dei disciolto inorganico (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ^+, SiO ₄₎ ed organici (DOC + DON) composti, e ultra-plancton (<1081; m) e il particolato organico (POC + campionamento PON). Per ridurre ulteriormente il rischio di contaminazione, in particolare in condizioni di campo, il numero di fasi di manipolazione è stato ridotto al minimo. Il formato visivo in cui è presentato il metodo è orientato per facilitare riproducibilità e per ridurre il tempo necessario per applicare efficacemente la tecnica.

Panoramica del sistema

Per campionare in situ pompata acqua sospensivori con orifizi exhalant piccole 2 mm, l'attività di pompaggio di ciascun campione viene prima visualizzata rilasciando filtrata fluoresceina tinti acqua di mare accanto all'orifizio inalante (s) e osservando il suo flusso dall'apertura excurrent ¹⁶ (vedi anche figura 2B in ^18). L'acqua inalato ed espirato dal campione di studio (incurrent e excurrent) vengono quindi simultaneamente campionati con l'impiego di una coppia di tubi minute installati sul manipolatore fuoriserie o due dei "arms "di un treppiede portatile flessibile capovolta (Figura 1 e complementare Video 1). L'acqua inalata dall'organismo studio viene raccolto posizionando accuratamente l'estremità prossimale di un tubo all'interno o vicino all'apertura inalazione dell'organismo studio. Un identico tubo viene quindi posizionato all'interno dell'orifizio excurrent. Questa operazione richiede cura per evitare il contatto o disturbo dell'animale, per esempio, mediante risospensione dei sedimenti. per iniziare il campionamento, un subacqueo perfora un setto nel recipiente di raccolta con una siringa attaccata alla estremità distale di ciascun tubo, consentendo la pressione dell'acqua esterna di forzare l'acqua campionata nel vaso attraverso il tubo di campionamento. l'aspirazione viene iniziata dal vuoto creato in precedenza nei flaconi e dalla differenza di pressione tra l'acqua esterna e il contenitore del campione evacuato .

Per garantire una raccolta di acqua pulita espirata e per evitare l'aspirazione accidentale di ambiacqua ent ^16, la frequenza di campionamento dell'acqua deve essere mantenuto a un tasso significativamente più basso (<10%) rispetto alla portata excurrent. Il tasso di aspirazione è controllata dalla lunghezza del tubo e il diametro interno (ID). Il piccolo diametro interno garantisce inoltre un volume morto trascurabile (<200 ml per metro di tubo). Campionamento per periodi prolungati (minuti a ore) permette di integrare il patchiness intrinseca della maggior parte delle sostanze di interesse. Per assicurare che i campioni siano adeguatamente conservati in sessioni di campionamento subacqueo prolungati nonché per il trasporto al laboratorio, una in situ filtrazione è raccomandato per analiti sensibili. La selezione di vasi di campionamento, il montaggio di filtraggio, e tubi sono dettate dagli organismi di studio e la domanda di ricerca specifica. Il protocollo descritto di seguito presuppone che un profilo metabolico completo è di interesse (per una panoramica si veda la Figura 2). Tuttavia, la natura modulare del protocollo consente fo facile modifica per accogliere i metodi di campionamento più semplici o anche molto diverse. Per un profilo metabolico completo, il protocollo di campionamento dovrebbe comprendere le seguenti fasi: (1) la visualizzazione di flusso; (2) l'alimentazione di campionamento ultra-plancton (plancton <10 micron); (3) Il campionamento nutrienti inorganici assorbimento e l'escrezione (usando filtri in linea); (4) Campionamento disciolto assorbimento organico e l'escrezione (usando filtri in linea); (5) di alimentazione particolato e l'escrezione (usando filtri in linea); (6) Ripetere il punto 2 (ultra-plancton alimentazione come controllo della qualità); (7) Portata visualizzazione.

Quando logisticamente fattibile, si raccomanda che le misurazioni profilo metabolico sono combinati con pompaggio rate (ad esempio, il metodo a velocità fronte del colorante, in ^16), nonché con le misurazioni respirazione. Queste misure devono essere prese all'inizio e alla fine della sessione di campionamento. Per la misurazione della respirazione, optodes subacquee o micro-elettrodi sono preferibili.

Protocollo

1. Operazioni preliminari e per la bonifica Procedure

1. Soluzione detergente
   1. Indossare indumenti protettivi, un camice da laboratorio e guanti in ogni momento. Effettuare queste fasi preparatorie in uno spazio pulito privo di polvere e fumo.
   2. Preparare una soluzione al 5-10% di acido cloridrico (HCl) con fresco, di alta qualità, acqua bidistillata.
   3. Preparare un 5% altamente solubile mix di base della soluzione di tensioattivi anionici e tensioattivi non ionici (vedi elenco dei materiali) con fresco, di alta qualità, acqua bidistillata.
   4. Conservare tutte le soluzioni in pulita, lavata con acidi contenitori.
2. Operazioni preliminari e le procedure di pulizia (in laboratorio)
   NOTA: Se composti di fosforo non sono di interesse, il lavaggio HCl può essere sostituita da acido fosforico di alta qualità (H ₃ PO ₄₎ di lavaggio (8% H ₃ PO ₄ concentrazione finale).
   1. Indossare indumenti protettivi, un camice da laboratorio e guanti in ogni momento.
   2. lavaggiol'apparato di campionamento (escluso il supporto in acciaio inox filtro in linea Swinney) con ampia quantità di acqua ad elevata purezza. Lasciare l'apparecchiatura in ammollo 5-10% soluzione di HCl durante la notte. Risciacquare di nuovo l'apparato con grande quantità di acqua distillata doppio di alta qualità.
   3. Lavare i acciaio inox portafiltri Swinney in linea con la grande quantità di acqua ad elevata purezza. Lasciare i portafiltri ammollo nel 5% altamente solubile mix di base di tensioattivi anionici e tensioattivi non ionici soluzione durante la notte. Risciacquare di nuovo con acqua ampio doppio di alta qualità distillata.
   4. Asciugare tutto l'apparato di campionamento, avvolgerli in un foglio di alluminio e conservare in una scatola pulita fino al momento dell'uso.
3. Controllo della frequenza di aspirazione
   1. Controllare la frequenza di campionamento regolando la lunghezza e il diametro interno del tubo di aspirazione in funzione della profondità di lavoro programmato e temperatura dell'acqua. Utilizzare la seguente equazione (derivato dalla Legge di Poiseuille usato per completamente develpato tubo di flusso laminare) come guida: dove F = portata (cm ³ min ^-1), Dp = pressione differenziale (bar), r = ingresso tubi raggio interno (cm), K = 2.417 x 10 ^-9 (sec ^-2), L = lunghezza del tubo (cm ), V = viscosità dell'acqua (g ^cm-1 sec ^-1). Vedi Tabella 1 per maggiori dettagli.
   2. Mantenere frequenza di campionamento inferiore all'1% della velocità di pompaggio dell'animale studiata.
      NOTA: l'uso di contenitori evacuati, a volte con sconosciuto vuoto pone ulteriori complicazioni. Pertanto, un test sul campo è altamente raccomandato. A 10 m di profondità e ~ 22 ° C con acqua di mare (40 PSU), un tubo di 50 cm di aspirazione con un diametro interno di 254 micron fornisce un tasso medio di aspirazione del ~ 26 microlitri sec ^-1 (1,56 ml min ^-1).
4. vasi di campionamento
   1. Per piccoli campioni di volume (3-20 ml, ad esempio, ultra-plancton per CYT flussoometry) utilizzare tubi in plastica sterili pre-aspirato.
      NOTA: Pre-aspirato tubi in plastica sterili sono regolarmente impiegati per le analisi del sangue normali in esseri umani; assicurarsi di utilizzare le provette sterili senza aggiunta di additivi. Questi tubi di plastica sterili sottovuoto sono meglio campionati con l'uso di sterili, portatubo monouso con fuori centro Luer. Mentre questo è l'apparato di campionamento più sicuro ed efficace, ha un po 'più grande volume morto rispetto ad un ago semplice.
   2. Per i campioni di acqua più grandi, come i nutrienti e sostanze organiche disciolte, utilizzare 40 o 60 ml fiale di vetro che soddisfano i criteri Environmental Protection Agency (EPA) per le analisi organici volatili. Queste fiale includono tappo in polipropilene con un setto in silicone PTFE affrontato.
   3. Per i volumi ancora più grandi, usare bottiglie di penicillina con tappi di gomma o thermos.
   4. Utilizzare fiale di polietilene ad alta densità (HDPE) fiale per i campioni di silice.
   5. Per aumentare il volume del campione e per ridurre il rischio di sloggiare stopperdurante la risalita, evacuare articoli (vuoto) 1.4.2-1.4.4 prima dell'immersione con una pompa a vuoto. Vacuum manualmente utilizzando una pompa a vuoto mano o anche aspirando l'aria con una siringa. Tuttavia, per ottenere i migliori risultati, si consiglia una pompa a buon vuoto. liofilizzatori standard fornisce alto vuoto.
      NOTA: Prestare particolare attenzione quando si utilizzano grandi palloni aspirato a garantire che il tasso di aspirazione più veloce iniziale non avrebbe contaminato i campioni di acqua espirata.
5. Procedure di pulizia Vessel
   1. Per organici dissolti e NH ₄ ⁺ analisi, utilizzare le nuove fiale pre-puliti EPA.
   2. Risciacquare i flaconi (vetro e HDPE) per l'analisi di altri nutrienti come segue:
      1. Sciacquare i flaconi (vetro e HDPE) e tappi in polipropilene con acqua distillata doppio di alta qualità. Installare un nuovo setto silicio.
      2. Mettere a bagno i flaconi (vetro e HDPE) nel 10% di HCl per almeno 3 giorni e risciacquare con acqua ampio doppio di alta qualità distillata.
      3. Combust i flaconi di vetro a 450 ° C per 4 ore e si lascia raffreddare in forno. Installare il tappo, e avvolgerlo in un foglio di alluminio fino al momento dell'uso.
6. filtri
   1. Utilizzare i filtri in fibra di vetro privo di legante per la filtrazione di tutti i campioni organici disciolti (ad esempio, DOC, DON) e per la raccolta di organici di particolato (ad esempio, POC, PON). Confezione ciascun filtro di vetro in una busta di alluminio separata. Bruciano a 400 ° C per 2 ore a volatilizzare residui organici e conservare in un recipiente pulito e asciutto fino al momento dell'uso.
   2. Utilizzare un filtro in fibra di vetro privo di legante come sopra, o membrane di policarbonato 0,2 micron per il campionamento di nutrienti inorganici (ad esempio, PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ^+). Pulire quest'ultimo una volta installato nel supporto del filtro come spiegato di seguito (1.7.3).
   3. Utilizzare 0,2 micron in policarbonato filtri membrane per il campionamento di silice. pulirle una volta installed nel porta filtro come spiegato di seguito (1.7.3).
7. Preparazione del gruppo filtrante
   1. Filtrare la miscela base altamente solubile di tensioattivi anionici e soluzione di tensioattivo non ionico e l'acqua distillata doppia alta qualità attraverso un filtro da 0,2 micron prima di usarli per pulire il gruppo filtrante.
   2. assemblaggio di filtrazione per i nutrienti e sostanze organiche disciolte diverse da silice:
      1. Mettere un combusti filtri in fibra di vetro privo di legante all'interno del supporto in acciaio inox filtro pulito in linea Swinney.
      2. Utilizzare una siringa acido puliti per eseguire 100 ml di 5% altamente solubile mix base di tensioattivi anionici e soluzione tensioattivo non ionico e poi 100 ml di acqua distillata doppia alta qualità attraverso l'intero assieme.
   3. Assemblaggio di filtrazione per SiO _4:
      1. Posizionare il filtro di policarbonato all'interno del supporto del filtro di policarbonato pulito (portafiltri PC).
      2. Utilizzare una siringa acido-pulito per Run 30 ml di 5% di HCl e 30 ml di acqua distillata doppia alta qualità attraverso l'intero assieme.
8. il montaggio del sistema
   1. Assemblare il sistema per lavori subacquei utilizzando PEEK (polietere etere chetone) tubi con un diametro esterno (OD) di 1,6 mm ed un diametro interno (ID) di 254 micron o 177 micron.
   2. Di un coltello o PEEK taglierina affilato per tagliare i tubi alla lunghezza desiderata.
   3. Alla sua estremità distale (campione laterale del contenitore), misura ogni tubo con un connettore Luer maschio attaccato ad una siringa. Assicuratevi di seguire le istruzioni del produttore e allineare il lato piatto blu senza flangia puntale con l'estremità del tubo prima di serrare il dado verde.
   4. Collegare il tubo PEEK al treppiede "braccia" o manipolatore su misura utilizzando un nastro isolante.
   5. Attaccare un ago siringa monouso al connettore maschio Luer. Tenere l'ago con il suo cappuccio di protezione per prevenire gli infortuni.
   6. Chiaramente etichettare il codice del cambio di campionamento e il colore di tutti i componenti inalati ed esalati (ad esempio, verde = In, rosso = Ex).
   7. Allo stesso codice di colore i vasi di campionamento con set di vasi di campionamento accoppiati in sequenza numerata.

2. subacquea di lavoro

1. Preparazione del sito Work
   1. Indagine preliminare e la selezione dei campioni
      NOTA: A causa della natura complessa del protocollo di campionamento subacquea, dedicando il tempo necessario per la preparazione garantirà un efficiente immersioni di campionamento.
      1. Indagine del cantiere e fare i preparativi necessari prima del tempo.
      2. Selezionare e marcare idonei organismi bersaglio cui si può accedere in modo relativamente facile. Dal momento che non tutti i microrganismi possono essere necessariamente attivo al momento dell'immersione campionamento, preparare più stazioni di lavoro che ci si aspetta di campione.
   2. Installazione di supporti di base
      1. When lavorando su substrato livellato:
         1. Montare la clip originale sgancio rapido del treppiede flessibile su 1 pesi kg di immersione e semplicemente posizionarlo vicino al bersaglio animali.
      2. Quando si lavora su pareti verticali:
         1. piastre di montaggio di supporto di base per il sistema VacuSIP, ganci per attrezzi accessorio, e grucce per il recipiente di raccolta portando vassoio durante la fase di preparazione del sito di lavoro (2.1.1).
         2. Quando si utilizzano treppiedi flessibile portatile, utilizzare viti o resina epossidica bicomponente per fissare lastre 10x10 cm PVC accanto ad ogni animale bersaglio. Ogni piatto ha bisogno di avere un buco per fissare le clip di rilascio rapido del treppiede flessibile portatile.
         3. Quando la resina è indurita e le piastre di base sono solidali alla parete, avvitare le clip sgancio rapido, che serve come punto fermo attaccamento per il treppiede portatile flessibile per il sistema VacuSIP.
2. Installazione del VaCUSIP
   1. Controllare se il campione è di pompaggio rilasciando filtrata fluoresceina accanto all'orifizio inalanti e confermare che il colorante sta emergendo attraverso l'orifizio exhalent come descritto in Yahel et al. (2005) ^16.
   2. Installare il dispositivo VacuSIP e posizionare il tubo di inalazione (IN) campionamento entro l'orifizio inalanti o semplicemente accanto ad esso (entro ~ 5 mm). Assicurarsi che il tubo inalante non è in prossimità di un altro orifizio esalante.
   3. Dirigere con cura il tubo di campionamento esalante (EX) verso il osculum / sifone esalante ed inserire molto delicatamente dentro, fino a quando non si posiziona 1-5 mm all'interno del osculum / sifone esalante (vedi Figura 1 e supplementare Video 1). Fare molta attenzione a non entrare in contatto con o comunque disturbare l'organismo campionato.
   4. Prima e durante il campionamento doppio controllare la posizione di entrambi i tubi.
   5. Dopo il controllo di campionamento se il campione è ancora pompando come described sopra (2.2.1).
      NOTA: A causa del movimento di un braccio del tripode durante la manipolazione l'altro potrebbe accadere, assicuratevi di mettere in primo luogo il tubo di campionamento inalanti e in secondo luogo il tubo esalante, che richiede la manipolazione più precisa. Seguendo questo ordine, anche se la manipolazione del tubo di campionamento exhalant potrebbe provocare il movimento del tubo inalante, non influenzerà il campionamento.
3. Procedura di campionamento subacqueo modulare
   NOTA: In attesa sulla domanda di ricerca, ciascuna delle fasi sperimentali sotto possono essere eseguite come un esperimento stand-alone. Il profilo completo metabolico protocollo di campionamento descritto è un processo lungo, che richiede fino a 8 ore al campione (per una panoramica si veda la Figura 2 e Tabella 2). Poichè le condizioni e regolamenti di immersione differiscono tra i siti di campionamento, regioni e istituzioni, i piani di immersione non sono incluse in questo protocollo. Tuttavia, dedicare estrema cura e metipianificazione minuziose al piano di immersione. Prestare particolare attenzione per evitare la saturazione e yoyo profili di immersione. Quando possibile, si consiglia di condurre questi esperimenti in profondità (<10 m). rebreather a circuito chiuso può essere molto utile per tali sistemi di campionamento prolungati.
   1. Prima dell'inizio di campionamento attuale, assicurarsi che non tracce visibili di residui fluoresceina rimangono e che i sedimenti in sospensione sono state risolte o sono diffondeva via.
      
   2. Ultra-plancton, (nessun filtro è installato in questa fase!)
      1. Utilizzare l'ago per perforare il IN (per via inalatoria) e EX (espirata) aspirato tubi in plastica sterili setti. Verificare che l'acqua gocciola in al tasso programmato e raccogliere campioni di acqua 2-6 ml.
      2. Sul recupero, mantenere i campioni in una scatola di freddo sul ghiaccio. Nel laboratorio, conservare con 1% paraformaldeide + 0,05% EM grado glutaraldeide (concentrazione finale), o 0,2% EM grado glutaraldeide. Congelare cryovials in azoto liquido e conservare a -80 &# 176; C fino al momento dell'analisi.
   3. Campionamento silicato e stoccaggio
      1. Installare il portafiltro PC acciaio pre-puliti in linea contenente una membrana di policarbonato 0,2 micron tra l'ago e il connettore Luer maschio all'estremità distale del tubo.
      2. Pierce il tappo setto delle fiale in polietilene ad alta densità pre-puliti (flaconi HDPE) per iniziare il campionamento. Verificare che entrambi i campionatori grondano e raccogliere 15 ml d'acqua in ogni fiala.
      3. Conservare i campioni refrigerati (4 ° C) fino al momento dell'analisi. Se l'analisi non può iniziare entro due settimane, conservare a -20 ° C. Per l'analisi, assicurarsi che i campioni vengono scongelati a 50 ° C per almeno 50 min a dissolversi gel di silice.
         NOTA: La membrana può essere conservato per la microscopia o l'analisi del DNA, se necessario.
   4. Inorganiche disciolte (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ⁺⁾
      1. Sostituire tegli gruppo filtro PC con un portafiltro pre-pulito in linea acciaio che contiene un filtro di vetro pre-combusto.
      2. Prima campionamento, assicurano che almeno 20 ml di campioni di acqua marina sono stati fatti passare attraverso l'intero sistema di filtrazione utilizzando EPA, flaconi HDPE o altro recipiente vuoto per iniziare l'aspirazione. Misurare il volume dell'acqua raccolta prima di essere eliminati.
      3. Pierce il tappo setto delle appropriate fiale di vetro EPA per iniziare il campionamento, verificare che entrambi i campionatori sono grondanti, e raccogliere 25-30 ml per nitrati e fosfati analisi.
      4. Conversione a nuove fiale di vetro EPA per l'analisi di ammoniaca, verificare che entrambi i campionatori sono grondanti, e raccogliere 20 ml di ciascun flacone.
      5. Mantenere i campioni in una scatola fredda su ghiaccio e conservare a -20 ° C fino all'analisi.
         NOTA: Se solo il filtrato è di interesse, filtri per siringa usa e getta possono essere utilizzati per misure 2.3.3 e 2.3.4.
   5. Organici disciolto (DOC + DON) campionamento e storing
      NOTA: Mantenere i campioni il più possibile verticale per tutta la gestione in modo che l'acqua campione non venga a contatto con setti in silicone.
      1. Continuare utilizzando il gruppo filtro in acciaio inossidabile e raccogliere 20 ml di campioni di acqua marina in nuove fiale di vetro EPA, come descritto sopra.
      2. Dopo il recupero, mantenere i campioni in una scatola fredda su ghiaccio. Nel laboratorio, usare una pipetta di pre-combusto Pasteur di vetro per fissare i campioni con acido fosforico (aggiungere 5-6 gocce di acido grado metalli in tracce il 25% in un campione di 20 ml, concentrazione finale 0,04%) o acido cloridrico (aggiungere 2 gocce di metalli in tracce grado concentrato acido in un campione di 20 ml, concentrazione finale 0,1%) e conservare in frigorifero.
      3. Conservare i campioni refrigerati (4 ° C) fino al momento dell'analisi. Se i campioni non sono analizzati entro una settimana di raccolta, conservare a -20 ° C fino all'analisi.
   6. Particolato materia organica (POC, PON, POP)
      1. Continuare a utilizzare la stainless gruppo filtro in acciaio e filtro almeno 500 ml di acqua di mare in una beuta da vuoto 250 ml evacuato. Sostituire fiaschi, se necessario.
      2. Sul recupero, usare una siringa piena d'aria per evacuare tutti i restanti dell'acqua di mare dalla porta-filtro, avvolgerla in un foglio di alluminio, e conservare in una scatola di freddo sul ghiaccio. In laboratorio, rimuovere i filtri dai portafiltri e conservare a -20 ° C fino al momento dell'analisi.

Figura 1. Un esempio di corrette installazioni del VacuSIP: (a) Campionamento l'ascidia Polycarpa mytiligera (Golfo di Aqaba, Mar Rosso) con un manipolatore custom-built con il codice colore utilizzato verde per via inalatoria e giallo per campioni di acqua espirata (foto da Tom Shelizenger e Yuval Yacobi); (B) il campionamento dei oroides spugna Agelas (NW MediterraneoMare) con una larghezza osculum di 3 mm, utilizzando il dispositivo VacuSIP. Il codice colore utilizzato è giallo per inalazione e rosso per campioni di acqua espirata. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Descrizione generale della tecnica VacuSIP descritto nella sezione del protocollo. Il lavoro di laboratorio è rappresentato in scatole gialle, il lavoro sul campo in scatole blu. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Le frequenze di campionamento medi complessivi (ml min ^-1) ottenuti con diversi contenitoriutilizzati per le raccolte d'acqua e diversi gradi di vuoto: i palloni non erano stati spazzati (nessuno); fiale di vetro EPA e fiale HDPE erano stati spazzati metà del loro volume (½ volume); tubi di plastica sterili sono stati già aspirato dal produttore. Lavorare a 5-8 m di profondità, temperatura dell'acqua di 18-22 ° C, l'uso di tubi in PEEK di lunghezza 79 centimetri e di 25 micron di diametro interno.

Tabella 2. Panoramica della nave campionamento, gruppo filtro fissativo, in linea, lo stoccaggio e metodi analitici descritti nella sezione del protocollo. I composti analizzati sono: ultra-plankton abbondanza (plancton <10 micron), silicati (SiO _4), fosfato (PO ₄ ^3-), nitriti + nitrati (NO ₂ ^- + NO ₃ ^-), sostanza organica disciolta (DOM), ammonio (NH ₄ ⁺⁾ e materiale organico particolato(POM). Tutti i vasi di campionamento devono tappo setto silicio e vengono aspirati prima del campionamento. I fissativi sono: paraformaldeide + glutaraldeide (Glut + Parafor), acido fosforico (H ₃ PO ₄₎ e acido cloridrico (HCl). Le assemblee in linea di filtro usati sono: portafiltri in policarbonato e policarbonato a membrana 0,2 micron filtri (portafiltro PC + membrana PC) e portafiltri in acciaio inox e fibra di vetro senza leganti Filtri GFF.

Risultati

L'ottimizzazione dei metodi di raccolta di acqua di mare

Selezione di fiale da collezione e la procedura di pulizia

recipienti di raccolta compatibili VacuSIP dovrebbero avere un setto che permette di campionamento venga avviata forando con una siringa. Essi dovrebbero resistere alla pressione sottomarina elevata (2-3 b...

Discussione

operazioni preliminari

Fiale Collector per Dom e analisi dei nutrienti

Dal momento che i vasi da collezione possono interagire con micro-costituenti disciolti e le pareti campionatore può essere un substrato per i batteri crescita ^30-34, sono stati testati diversi fiale per DOM e la raccolta dei nutrienti. Borosilicato non è raccomandato per la quantificazione silice ^33,35, dal momento che le bottig...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
GorillaPod,	treppiede portatile flessibile	Joby	GP000001
Ghiera senza flangia	IDEX Salute & Scienza	P-200X	1/16" in dado maschio blu/pk
	IDEX salute & Scienza	P-205X	1/16" in verde/10  pk
Femmina a Femmina Luer	IDEX Salute & Scienza	P-658
Femmina-Maschio Luer	IDEX Salute & Scienza	P-655
Tubo in peek (254  µ m IDEX)	Salute & Scienza	1531	1/16" OD x 0,01  in ID x 5  lunghezza del piede. È possibile utilizzare un ID alternativo.
Resina epossidica bicomponente	IVEGOR	9257	Miscelare bene la resina bicomponente prima dell'uso
(TOC) Fiale EPA	Cole -Parmer	03756-20	Fiale di vetro da 40 ml. Prodotto anche da Thomas Scientific (numero di rif. 9711F09).
Fiale in HDPE	Wheaton	986701 (E78620)	Fiale in polietilene ad alta densità da 20 ml
Vacuette Z senza additivo	Greiner bio-one	455001	pre-vuoto dal produttore
Flaconi campione Septum	Thomas Scientific	1755C01	Flaconi in vetro da 250 ml
Tappo del setto 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 per fiale in HDPE
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 per fiale e flaconi in vetro. Prodotto anche da Thermo Scientific National (rif. 03-377-42).
Portafiltri in linea in acciaio inox Swinney	Pall	516-9067	13 mm di diametro
PTFE Rondella di tenuta	Pall	516-8064	anello per portafiltri in acciaio inox
TCLP Filtri in vetro	Pall	516-9126	Filtri in fibra di vetro senza legante, 13  mm di diametro, dimensione dei pori 0,7  µ m
Portafiltri in policarbonato	Cole -Parmer	17295	da 13 mm di diametro
	Millipore	GTTP01300	13  mm di diametro, dimensione dei pori 0,2  µ m
Contrad 70 Soluzione	Decon Labs	1002	miscela basica altamente solubile di soluzione di tensioattivo anionico e non ionico.
Filtri per siringhe sterili	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25  mm di diametro, dimensione dei pori 0,2  µ m
Fluoresceina	Sigma-Aldrich	(vecchio rif.28802) 46955-100G	100  g
Holdex, monouso, sterile	Greiner bio-one	450263	portaprovette sterile monouso con luer decentrato per aghi sterili Vacuette
	IcoGammaPlus	5160	0.7  mm x 30  mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2  ml
Scatola Cryobox	Rubilabor	M-600	145x145x55  mm p/microtubo 1,5  ml
Acido ortofosforico	Sigma	79617 o in alternativa utilizzare acido cloridrico ultrapuro, concertazione finale 0,1%
Paraformaldeide	Sigma	P6148	500  g
Glutaraldeide	Merck	8.206.031.000	25%,
pompa per vuoto manuale da 1 l	Bü rkle	5620-2181 o in alternativa utilizzare una pompa