Articolo metodologico

Isolare le cellule progenitrici Mesangiogenic (PPM) da midollo osseo umano

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DOI:

10.3791/54225

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15 luglio 2016

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1Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo un protocollo ottimizzato e altamente riproducibile per isolare le cellule progenitrici mesodermiche (MPC) dal midollo osseo umano (hBM). Le MPC sono state caratterizzate mediante citometria a flusso ed espressione di nestina. Hanno dimostrato la capacità di dare origine a colture cellulari simili alle MSC in crescita esponenziale, pur mantenendo il loro potenziale angiogenico.

Abstract

In uno studio di ricerca volto a isolare le cellule stromali mesenchimali (MSC) derivate dal midollo osseo umano (hBM) per applicazioni cliniche, abbiamo identificato una nuova popolazione cellulare specificamente selezionata per la crescita in un terreno integrato con siero umano. Queste cellule sono caratterizzate da caratteristiche morfologiche, fenotipiche e molecolari distinte dalle MSC e le abbiamo chiamate Cellule Progenitrici Mesodermiche (MPC). Le MPC sono rotonde, con una regione centrale spessa e altamente rifrangente; Mostrano una forte aderenza alla plastica resistente alla tripsina. La mancata espansione degli MPC ha rivelato direttamente che sono lenti nel ciclo. Questo è suggerito anche dalla negatività del Ki-67. D'altra parte, la coltura di MPC in un terreno standard progettato per l'espansione delle MSC, ha dato origine a una popolazione di cellule simili alle MSC in crescita esponenziale. Oltre a mostrare capacità di differenziamento mesenchimale, le MPC hanno mantenuto il potenziale angiogenico, confermando la loro natura progenitrice di linee multiple. Qui descriviamo un protocollo ottimizzato altamente riproducibile per isolare e caratterizzare le hBM-MPC mediante citometria a flusso (CD73, CD90, CD31 e CD45), espressione di nestina e organizzazione di F-actina. Vengono inoltre forniti protocolli per il differenziamento mesengenico e angiogenico delle MPC. Qui suggeriamo anche una nomenclatura più appropriata per queste cellule, che è stata rinominata "Cellule Progenitrici Mesangiogeniche".

Introduzione

Cellule stromali mesenchimali (MSC) sono di valore clinico rilevante per la loro capacità di differenziazione multi-lignaggio e la loro capacità di sostenere emopoiesi, di secernere fattori di crescita / citochine, nonché a svolgere un ruolo nella immunoregolazione 1. Nella definizione di produzione di celle terapie MSC-based e l'applicazione sono stati oggetto di numerose ricerche cliniche e pre-clinica 2, con particolare attenzione alle specifiche normative internazionali per la sicurezza e l'efficacia di cellula medicinale (CBMP) trattamenti 3 based. MSC umane sono ampiamente coltivate in terreni contenenti integratori e reagenti di origine animale, come il siero fetale bovino (FBS) e tripsina bovina. Pertanto, insieme con i rischi infettive legate alla manipolazione cellulare, i pazienti devono affrontare anche prione esposizione così come i rischi immunologici legati alle proteine, peptidi o altre biomolecole di origine animale che potrebbero persistere dopo la raccolta delle cellule e Transplanzione 4.

Per aggirare il problema, abbiamo colto midollo osseo umano (HBM) MSC -derived in terreno privo di animali, sostituendo FBS con pool umana di tipo AB di siero (PhABS). In queste condizioni, insieme a MSC crescenti abbiamo identificato una popolazione di cellule romanzo. Queste cellule erano morfologicamente e fenotipicamente diverso da cellule staminali mesenchimali e hanno mostrato un profilo di espressione genica distintivo e caratteristico proprietà crescita / adesione. Hanno mantenuto entrambe le celle mesengenic e potenziale angiogenici e, pertanto, sono stati nominati mesodermiche progenitrici (PPM) 5. Successivamente, siamo stati in grado di definire le condizioni di coltura selettive e riproducibili per generare PPM ad alto grado di purezza 6.

Abbiamo studiato ulteriormente le proprietà morfologiche e biologiche di PPM. I PPM hanno dimostrato di essere nestina-positivi, lento nel ciclismo, Ki-67-negativi, e con i cromosomi caratterizzate da lunghi telomeri 5. Hanno espresso plurI fattori di trascrizione ipotency-associata MSC Master regolatori Runx2 e SOX9 7 ottobre-4 e Nanog, piuttosto che. Fenotipicamente, PPM espresso endoglina (CD105) a livello inferiore rispetto MSC mentre manca marcatori mesenchimali CD73, CD90, CD166. MPC ha anche mostrato un modello distintivo di molecole di adesione caratterizzate da espressione coerente di PECAM (CD31), integrine αL (CD11a), αM (CD11b), αX (CD11c), così come integrina β2 (CD18) che sostiene in particolare le strutture podosome simile 8 . In mezzi espansione MSC standard PPM prontamente differenziate in cellule staminali mesenchimali attraverso uno stadio intermedio con l'attivazione di cellule Wnt5 / Calmodulina segnalazione 9. PPM anche mantenuto angiogeniche, come dimostrato dalla loro capacità di germogliare da sferoidi a murini matrice extracellulare (ECM) culture proteine ​​3D. Il potenziale angiogenico è stato rapidamente perso dopo la differenziazione MPC lungo il lignaggio mesengenic.

Qui vi presentiamo proprotocolli ottimizzati per isolare e caratterizzare PPM altamente purificati da campioni di sangue HBM. protocolli riproducibili per MPC mesengenic e differenziazione angiogenici sono anche descritti.

Protocollo

NOTA: dopo il consenso scritto, campioni HBM sono stati ottenuti durante l'intervento chirurgico ortopedico per protesi d'anca. Subito dopo femorale osteotomia collo e prima femorale alesatura una siringa da 20 ml contenente 500 UI di eparina, è stato utilizzato per aspirare BM fresco. Il protocollo è da considerarsi ampiamente applicabile a qualsiasi fonte BM.

1. Isolamento dell'osso umano cellule del midollo mononucleate (HBM-MNC)

  1. Diluire 5 - 10 ml di BM fresco a 50 ml, l'applicazione di una soluzione salina tamponata con fosfato Dulbecco (D-PBS) e mescolare per inversione. Altrettanto distribuire 25 ml in due nuove provette da 50 ml coniche, aggiungere 25 ml di D-PBS in ogni provetta e miscelare per inversione.
  2. Lasciare le provette riposare per 10 min a temperatura ambiente, per la separazione di frammenti ossei minerali e grasso dalla soluzione.
  3. Rimuovere con attenzione il grasso galleggiante con una pipetta e filtro sospensione cellulare Pasteur sterile attraverso 70 micron filtri senza disturbare il frammento pellet minerale ossea.
  4. Imposta quattro 50 ml provette con 15 ml di terreno per discontinua centrifugazione in gradiente di densità (1.077 g / ml). Assicurarsi che questo mezzo è a temperatura ambiente.
  5. Delicatamente lay 20 - 25 ml di diluito BM sulla parte superiore del gradiente di densità media. Eseguire questa operazione con attenzione, lasciando gocciolare sospensione cellulare sulle pareti dei tubi per evitare strati di miscelazione.
  6. Effettuare gradiente di densità centrifugazione a 400 xg per 30 min a temperatura ambiente con freno disattivato.
  7. Raccogliere l'anello biancastro di cellule situate tra le due fasi usando una pipetta Pasteur sterile e trasferirlo in una nuova provetta 50 ml.
  8. Lavare le cellule con mezzo di coltura fresco: rosso fenolo-libero, basso livello di glucosio (1.000 mg / l) Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) pool di tipo AB siero umano (PhABS), 2 mM L-glutammina e antibiotici (/ 10% PhABS DMEM). Centrifugare a 400 xg per 5 min.
  9. Aspirare il surnatante e risospendere pellet in 5 - 10 ml di DMEM fresco / 10% PhABS.
  10. Procedere alla conta delle cellule.Determinare il numero di globuli bianchi da 1: 1 diluizione trypan. Applicare questo al emocitometro, e osservare al microscopio a contrasto di fase. Escludere le piccole e perfettamente arrotondati eritrociti e cellule morte blu macchiato dalla conta delle cellule.
    NOTA: Si raccomanda di PhABS schermo lotti per le loro prestazioni nel recupero MPC. PhABS da fonti USA hanno dato i migliori risultati, mentre la maggior parte sieri di diversa origine ha provocato culture MPC con percentuali più elevate di cellule MSC-like.

2. Isolamento di PPM da HBM-multinazionali

  1. Impostare idrofobiche T-75 beute da 15 ml di DMEM fresco / 10% PhABS e lasciate pH e la temperatura si equilibrano pre-incubazione a 37 ° C in 5% CO 2 per 30 min.
  2. Seed 4-6 x 10 7 HBM-multinazionali per pallone e incubare a 37 ° C in 5% di CO 2 per 48 ore.
  3. Aspirare ed eliminare le cellule medie e non aderenti da fiaschi. Aggiungere 15 ml di fresca DMEM / 10% PhABS e incubare a 37 ° Cnel 5% di CO 2. Mantenere le culture per 6 - 8 giorni, il cambio medio ogni 48 ore.
    Facoltativo: per aumentare la resa MPC, le cellule non aderenti da 2.3 potrebbero essere ri-placcato in un nuovo pallone di coltura e mantenute come descritto per le colture primarie.
  4. Aspirare e scartare media da fiaschi, lavare con DMEM fresco e aggiungere 2 ml di animale proteasi distacco soluzione. Incubare a 37 ° C per 5 - 15 minuti (evitare di incubazione prolungata).
  5. Aggiungere 10 ml di fresca DMEM / 10% PhABS, aspirare la sospensione cellulare e centrifugare a 400 xg per 5 min
  6. Aspirare e scartare il surnatante e risospendere pellet in 1 - 2 ml di DMEM fresco / 10% PhABS. Procedere alla conta delle cellule come descritto al punto 1.10.
    NOTA: non utilizzare tripsina / EDTA come distacco reagente. PPM sono tripsina resistente. proiezione morfologica delle culture, prima raccolta di cellule, è consigliabile per valutare la presenza di cellule MSC-like fusiformi. In caso notevole quantità di cellule MSC-simili sono detected, aumentare la purezza del prodotto cellulare rimuovendo selettivamente le cellule contaminati. Per fare ciò, tripsina digestione può essere effettuata prima MPC raccolta, aggiungendo 2 ml di tripsina / EDTA 0,05% per 2 min. culture lavare due volte con 5 ml di DMEM / 10% PhABS, quindi procedere alla proteasi trattamento come sopra.

3. Caratterizzazione delle cellule

  1. Citometria a flusso
    1. Impostare campioni duplicati di 10 5 cellule appena staccati in soluzione di lavaggio: D-PBS integrato con 0,5% (v / v) di siero albumina bovina (BSA) e 0,02% (w / v) di sodio azide. Centrifugare a 400 xg per 5 min.
      ATTENZIONE: sodio azide è tossica.
    2. Risospendere pellet in 200 ml di soluzione di lavaggio e aggiungere anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 e gli anticorpi anti-CD31 coniugati con coloranti fluorescenti ( "test"); in parallelo istituito controlli isotipo ( "CTRL").
      NOTA: Le quantità di colorazione anticorpi dovrebbero essere determinati per titolazione o According le istruzioni del produttore.
    3. Incubare i campioni a 4 ° C per 30 min.
    4. Centrifugare a 400 xg per 5 min. Risospendere le cellule in 500 ml di soluzione di lavaggio e di acquisire almeno 5 x 10 4 eventi in flusso multicolore citometro 7 9 10.
    5. Analizzare i risultati di dot-trame e usare "CTRL" eventi registrati per impostare quadranti.
      NOTA: Al fine di definire la cultura come la cultura MPC la percentuale di CD73 neg CD90 neg CD45 + cellule CD31 + dovrebbe essere oltre il 95%. Per alcune applicazioni specifiche, cioè, analisi di espressione genica, il recupero cut-off deve essere aumentata a 97 - 98%.
  2. il rilevamento e l'analisi Nestin organizzazione F-actina
    1. Piastra PPM di fresco isolato su slitte camera di cultura (20.000 / cm 2). Consentono alle cellule di aderire mediante incubazione overnight a 37 ° C in 5% CO 2.
    2. Lavare le cellule in soluzione di lavaggio e fix a 4% (w / v) para-formaldeide a temperatura ambiente per 15 min. Per rimuovere fissativo aggiungere soluzione di lavaggio, incubare per 2 minuti e versare.
    3. Ripetere l'operazione di lavaggio due volte.
    4. Permeabilize cellule in D-PBS integrato con 0,05% (v / v) Triton X-100 per 15 minuti a RT.
    5. Arrestare reazione da proteine ​​enhancer connessione di segnale (30 min a RT) o soluzione di saturazione standard (D-PBS integrato con 3% (w / v) BSA).
    6. Rimuovere potenziatore di segnale / soluzione bloccante.
    7. Aggiungere 7 pg / ml (w / v) di anticorpo primario nestin anti-umana e incubare a 4 ° C per una notte in una camera umidificata. In parallelo, usare gli anticorpi controllo isotipico per valutare segnali di fluorescenza non specifici.
    8. Lavare i vetrini con l'aggiunta di D-PBS, lasciare per 2 minuti e versare. Ripetere due volte.
    9. Aggiungere 2 ug / ml (w / v) di colorante fluorescente anticorpo secondario coniugato e incubare a 4 ° C per 1 ora al buio.
    10. Lavare i vetrini come sopra.
    11. Aggiungi falloidina fluorescente (5 UI / ml), lasciare a temperatura ambiente per 30 min al buio e lavare 3 volte in D-PBS.
    12. Rimuovere le pareti della camera e montare le diapositive in mezzo di montaggio acquoso integrato con antifade reagente e 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per il rilevamento di nuclei. Procedere al di imaging 7 9 10.

4. Mesengenic Differenziazione di PPM

  1. Piastra 2 x 10 4 / cm 2 PPM appena isolate in fiasche di coltura T75 TC-trattati e lasciare che le cellule aderiscono durante la notte in DMEM / 10% PhABS a 37 ° C in 5% di CO 2.
  2. Sostituire DMEM / 10% PhABS con medie standard ridotta siero, circa 200 ml / cm 2, progettato per l'espansione delle cellule mesenchimali stromali (media MSC-RS). Crescere le cellule a confluenza (P1-MSC), tipicamente da 7 a 10 giorni dalla induzione. Refresh media ogni 2 giorni.
  3. Aspirare e scartare media da fiaschi, lavare con media MSC-RS fresca e aggiungere 2 ml di animale proteasi distacco soluzione. Incubare a 3776; C per 5 - 15 minuti (evitare di incubazione prolungata).
  4. Aggiungere 10 ml di terreno MSC-RS fresco, aspirare la sospensione cellulare e centrifugare a 400 xg per 5 min
  5. Aspirare il surnatante e risospendere pellet in 1 - 2 ml di mezzo MSC-RS fresco. Procedere alla conta delle cellule come descritto al punto 1.10
  6. Procedere alla sub-cultura loro da semina 3-5 x 10 3 cellule / cm 2. Crescere le cellule a confluenza (P2-MSC).
  7. Celle di raccolta di proteasi digestione come descritto dal punto 4.3 al punto 4.5 e procedere alla caratterizzazione come descritto nel paragrafo 3.
    NOTA: Una percentuale di cellule CD31 neg neg CD73 + CD90 + CD45 inferiore al 95% indicherebbe solo parziale differenziazione e richiedono un ulteriore passaggio cultura.
  8. Piastra P2-MSC a 2 x 10 4 / cm 2 in sei piatti ben TC-trattati e crescere fino a confluenza in media MSC-RS.
  9. Mark due pozzi come "No Diff" e rinfrescare medio MSC-RS.
  10. Mark due bens come "Osteo" e sostituire media con 200 pl / cm 2 di media osteogenico norma, specificamente progettato per la differenziazione MSC.
  11. Mark due pozzi come "Adipo" e sostituire media con 200 pl / cm 2 di media adipogenico norma, specificamente progettato per la differenziazione MSC.
  12. Mantenere le culture a 37 ° C in 5% di CO 2 modificando tutto il supporto ogni 48 ore.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare supporti di differenziazione disponibili in commercio standard, per la prova di riproducibilità. Dopo 2/3 settimane in condizioni di differenziazione, depositi di calcio appaiono in osteogeniche indotta culture, mentre intracellulari gocce lipidiche accumulo è evidente nelle cellule adipogenici indotta.
  13. Aspirare e scartare terreni di coltura poi lavare con D-PBS.
  14. Fissare le culture aggiungendo 1 ml di 4% (w / v) para-formaldeide per 15 min a temperatura ambiente.
  15. Per rimuovere fissativo aggiungere D-PBS, incubare per 2 minuti e versare. Ripetere il lavaggiodue volte.
  16. Macchia un "No Diff" insieme con i due "Osteo" segnato pozzi in soluzione fluorescente specifica idrossiapatite e uno "No Diff" insieme con i due "Adipo" segnato pozzi a 200 nM soluzione Nile Red. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente 11,12.
  17. Rimuovere la colorazione soluzioni e lavare in D-PBS due volte.
  18. Rimuovere D-PBS, aggiungere D-PBS integrato con il 50% (v / v) glicerina e procedere all'imaging 7 9 10.

5. MPC Spheroid Cavolo Assay

  1. Per produrre sferoidi 3D, lay 20 gocce microlitri di sospensione MPC fresco isolato (1,5 x 10 4 cellule / drop) sulla superficie interna di un coperchio piatto Petri.
    NOTA: Come gocce di gestione potrebbe portare alla loro rottura, è altamente raccomandabile per disporle in eccesso.
  2. usare con cautela il coperchio per ricapitolare una capsula di Petri contenente D-PBS per evitare appeso gocce evaporazione. Incubare a 37 ° C in 5% di CO 2durante la notte per consentire alle cellule di aggregare in sferoidi 3D.
  3. Impostare una spessa gel di proteine ​​murine matrice extracellulare (ECM) aggiungendo 300 microlitri aliquote di proteine ​​ECM standard, in una piastra pre-refrigerato coltura da 24 pozzetti e incubare a 37 ° C per 30 min.
  4. facendo attenzione sopra il coperchio piastra di Petri e delicatamente raccogliere i sferoidi utilizzando una pipetta Pasteur sterile.
  5. Posare sferoidi sul gel di proteine ​​ECM, aggiungere 700 microlitri aliquote del mezzo di crescita delle cellule endoteliali ricchi di VEGF standard ed incubare a 37 ° C in 5% di CO 2.
  6. Dopo 24 ore e a 7 giorni di coltura, scattare foto delle culture 3D 4x potere di ingrandimento. Valutare spuntano da sferoidi applicano immagine software di analisi misurando la distanza radiale tra ultima cella che invade e il bordo sferoide. misure ripetute lungo almeno 20 diverse direzioni. Distanza media è considerato come positivo quando il 50 micron o sopra.

Risultati

Le condizioni di coltura selettivi qui descritte hanno permesso l'isolamento di un romanzo popolazione di cellule aderenti e quasi monomorfe come 1.0% del HBM-multinazionali (0,5 - 2,0 x 10 6 HBM-MNC da 5 - 10 ml di campioni di BM freschi) 5,6 . Abbiamo identificato questi grandi (40 - 60 micron di diametro), arrotondato, le cellule, Ki-67-negativi quiescenti come PPM 5. Morfologicamente, sono caratterizzati da un uovo fritto forma distintiva con una regione di nucleo denso circondato da una periferia sottile piatta mostrando un sacco di filopodia a più alto potere di ingrandimento (frecce bianche in figura 1 A.1). L'allungamento polare del confine cellulare esterna è spesso osservato (frecce nere in figura 1 A.1). Tale morfologia è chiaramente diverso dal tipico aspetto mesenchimali cellule stromali a forma di fuso riportato nelle culture MSC standard. Citometria a flusso ha mostrato oltre il 95% di PPM appena isolate per esprimere CD31 e CD45, mentre mesenchymal marcatori associati CD90 e CD73 13 erano non rilevabili (Figura 1 A.2). Consideriamo questo ristretto insieme di quattro antigeni come indicativo per PPM. Ulteriori caratteristiche distintive di PPM sono la distribuzione tratteggiata F-actina rivelando un certo numero di strutture podosome-like (rosso nella figura 1 A.3) e intensa espressione di nestina (verde nella figura 1 A.3), che non viene rilevata nelle cellule macchiato con l'anticorpo controllo isotipico (dati non riportati).

PPM coltura in RS standard di media progettati per MSC risultati espansione nella differenziazione rapida in cellule MSC-like in crescita esponenziale (figura 1 B.1). Dopo due passaggi cellule finalmente passare il loro fenotipo da CD73 neg CD90 neg CD45 + CD31 + CD73 + CD90 a + CD45 neg CD31 neg (Figura 1 B.2). Nel processo, PPM ri-orgascere F-actina in fibre di stress mentre l'espressione nestina viene confinato in poche cellule rare (Figura 1 B.3). MPC differenziazione mesengenic in un fenotipo MSC-come definito avviene attraverso due fasi distinte rivelate da diverse morfologie di cellule. Dopo una settimana in media MSC RS una popolazione residua di cellule MPC-like è ancora rilevabile all'interno di uno strato confluente di appartamento, celle multi-ramificati poligonali (P1-MSC in Figura 2 A). Un ulteriore passaggio è necessaria per ottenere una cultura quasi monomorfa di fusiformi cellule MSC-like (P2-MSC nella Figura 2). Queste cellule in crescita esponenziale possono facilmente differenziarsi in osteoblasti o adipociti quando vengono trasferiti in terreni selettivi per almeno 2 settimane, confermando in tal modo la loro natura MSC. In osteogeniche indotta culture, depositi di calcio possono essere rilevate da una macchia colorimetrico Alizarina-S o coloranti fluorescenti specifici (verde nella figura 2 B). Dopo che le cellule induzione adipogenicimostrare l'accumulo di goccioline di lipidi, come rivelato da uno colorimetrica Oil Red o fluorescente Nile Red macchia (rosso nella figura 2 B).

MPC battitura è stato confermato da germinazione dosaggio angiogenesi. PPM hanno dimostrato la loro capacità di invadere (oltre 50 micron) gel proteina murina ECM da sferoidi 3D dopo 24 ore VEGF-stimolo (Figura 2 C). Dopo che le cellule che invadono una settimana sono stati rilevati a 300-600 micron di distanza. Al contrario, la capacità di invasione è stato perso in P2-MSC dopo la differenziazione mesengenic (Figura 2 D).

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Figura 1. PPM appena isolate hanno caratteristiche distintive. Coltura HBM-multinazionali in DMEM / 10% PhABS per sette giorni dà luogo ad una popolazione di PPM quiescenti (A) facilmente distinguibili da MSC (B) in termini di morfologia (A.1, B.1, barre di scala = 100 micron), fenotipo (A.2, B.2), F-actina di distribuzione (rosso in A.3, B.3), e espressione nestina (verde in A.3, B.3, barre di scala = 20 micron). clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. PPM differenziarsi in cellule staminali mesenchimali Standard e Visualizza Cavolo angiogenesi in vitro. La sostituzione di DMEM / PhABS con RS disponibili in commercio medio progettati per l'espansione MSC innesca l'induzione mesengenic di PPM. Dopo una settimana di cultura pochi PPM residui sono ancora rilevabili (P1-MSC), mentre un ulteriore passaggio in mezzo MSC-RS porta ad una popolazione di cellule confluenti MSC-simili (P2-MSC, A barre di scala = 100 micron). P2-MSC terminali differenziarsi in adipociti osteociti o sotto gli stimoli adeguati come rivelato da deposizione di calcio (verde in B) e accumulo di lipidi goccioline (rosso in B, barre di scala = 200 micron), rispettivamente. PPM mostrano germinazione coerente da sferoidi in gel di proteine ​​ECM murina (C) ad una differenza con P2-MSC (D, barre di scala = 1,0 mm). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Negli ultimi decenni, le MSC sono state ampiamente studiate e valutate preclinicamente per una possibile applicazione nel trattamento di vari disturbi ossei/articolari, immunologici, neurologici, cardiovascolari, gastrointestinali ed ematologici14,15. L'isolamento facile ed economico di MSC multipotenti, da molti tessuti diversi, insieme alla loro mancanza di immunogenicità significativa16, contribuiscono a rendere queste cellule una delle popolazioni cellulari più interessanti da applicare nelle terapie cellulari. Tuttavia, la frequenza molto bassa nel tessuto di origine rappresenta un grande limite all'applicazione delle MSC in clinica, costringendo l'espansione di queste cellule, in vitro, prima dell'infusione o del trapianto.

Le colture di MSC hanno rivelato alti gradi di eterogeneità e variabilità17-19 , rendendo difficile raggiungere un consenso sui protocolli di produzione e caratterizzazione delle MSC. Inoltre, recenti indagini hanno suggerito la presenza di più antenati delle MSC in vivo in un'ampia gamma di tessuti, che contribuiscono all'eterogeneità della coltura10,20. Infatti, è stato proposto che particolari condizioni colturali possano selezionare o semplicemente promuovere specifiche sottopopolazioni di progenitori delle MSC presenti, in varie percentuali, in campioni "grezzi" e non processati come il midollo osseo (hBM-MNCs) o i tessuti adiposi (frazione vascolare stromale)2. Pertanto, la variabilità nelle popolazioni cellulari che iniziano le MSC, insieme al gran numero di diversi protocolli di arricchimento/isolamento e coltura applicati, rappresentano un grande ostacolo alla definizione di possibili terapie basate sulle MSC.

Un fattore cruciale che influenza l'eterogeneità delle colture di MSC è l'integrazione sierica21. Nelle nostre mani, la sostituzione di FBS con PhABS in colture primarie di hBM-MNCs, combinata con la semina ad alta densità su plastiche idrofobiche, ha portato all'isolamento di una nuova popolazione cellulare altamente aderente con caratteristiche biologiche distinte denominate MPCs5,6. Abbiamo osservato che l'aggiunta di piccole percentuali di PhABS alle colture primarie di FBS ha anche permesso l'isolamento delle MPC, suggerendo la presenza di agenti induttori di MPC nel siero umano6. Al momento, il protocollo di isolamento/caratterizzazione MPC è un metodo unico disponibile per ottenere MPC quasi pure. Il protocollo è stato accuratamente regolato ed è altamente riproducibile per lo screening di qualità dei preparati di MPC prima di ulteriori applicazioni.

Le MPC potrebbero essere utilizzate come fonte per la produzione di MSC, limitando così la variabilità introdotta dall'uso di materiale di partenza non frazionato. La definizione precisa dei molteplici passaggi che caratterizzano il differenziamento mesengenico di MPC riportati9 consentirebbe l'espansione sincronizzata delle cellule mesenchimali. Ciononostante, quest'ultima condizione potrebbe essere realizzata esclusivamente applicando popolazioni di MPC altamente purificate, di conseguenza la caratterizzazione dei prodotti cellulari ottenuti dal protocollo qui descritto, risultati di cruciale importanza. Questo metodo di isolamento è stato riportato che consente il recupero dell'MPC con una purezza generalmente intorno al 95%. Tuttavia, la variabilità donatore/paziente, insieme alla variabilità relativa ai diversi lotti di siero umano aggregato applicato, potrebbe portare a una percentuale significativa di cellule MSC-like co-isolate insieme a MPC, in condizioni selettive.

Non è chiaro se queste cellule "contaminanti" simili alle MSC possano derivare dagli altri diversi progenitori in vivo descritti nel midollo osseo22 o da una differenziazione incontrollata e spontanea di MPC. In ogni caso, una percentuale consistente di cellule MSC-like nei prodotti MPC annulla la possibilità di applicare queste cellule come materiale di partenza omogeneo per l'espansione delle MSC. Così, qui è stato suggerito un metodo semplice ed economico, basato sulla resistenza dell'MPC alla digestione della tripsina, aumentando la purezza dei prodotti MPC. Risultati simili o addirittura migliori nella purificazione delle colture di MPC potrebbero essere ottenuti mediante la selezione cellulare fluorescente o magnetica che esegue la deplezione di CD73 e/o CD90, ma prolungando significativamente il tempo di processo e aumentando i costi.

Inoltre, le MPC hanno mostrato l'espressione di marcatori associati alla pluripotenza e di nestina, tutti rapidamente persi durante il differenziamento mesengenico7. Il test di germinazione ha rivelato la capacità dell'MPC di invadere il gel proteico della ECM murina. Nel loro insieme, questi risultati indicano che le MPC devono essere considerate un progenitore più immaturo, che conserva il potenziale angiogenico. Ciononostante, l'entusiasmo iniziale riguardo al potenziale di differenziazione mesodermica delle MPC sta effettivamente diminuendo. Infatti, dopo più di 7 anni di studi sulle MPC, il potenziale mesengenico e angiogenico è stato ampiamente descritto5-9, ma manca ancora la differenziazione verso qualsiasi altra cellula di origine mesodermica. Quindi, qui proponiamo una nuova e più rigorosa definizione di queste cellule come "Cellule Progenitrici Mesangiogeniche", mantenendo l'acronimo MPCs.

Riteniamo inoltre che la maggior parte delle controversie sul potenziale angiogenico delle MSC possa essere correlata alla composizione eterogenea di colture espanse costituite da sottopopolazioni di MPC e MSC in percentuali variabili23.

Infine, le MPC potrebbero anche svolgere un ruolo cruciale per l'implementazione di CBMP applicabili per la ricostruzione tissutale, in quanto queste cellule potrebbero anche supportare la neo-vascolarizzazione. Infatti, gli studi futuri sulla rigenerazione dovrebbero prendere in considerazione che la crescita tissutale di nuova formazione dovrebbe essere supportata da una concomitante neo-angiogenesi. La coesistenza di potenziale mesengenico e angiogenico nelle MPC potrebbe migliorare significativamente il potenziale di rigenerazione di nuovi approcci terapeutici che coinvolgono queste interessanti cellule.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare in particolare il Dr. Paolo Parchi, Dipartimento di Chirurgia, Medicina e Patologia Molecolare e Critical Care Medicine, Università di Pisa, per la fornitura di campioni di midollo osseo e la sua esperienza in osteo-progenitori umani

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Matrice della membrana basale MatrigelBD Bioscience (San Jose, CA-USA)354230Proteine della MEC murina
Concentrazione di riserva: 100% (9 - 12 mg/ml)
Concentrazione finale: 100%
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS)Sigma (St. Louis, MO, USA)D8537
70 μ m FiltriMiltenyi Biotec (BergischGladbach, Germania)130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM GE Healthcare (Uppsala, Svezia)17-5442-03terreno per centrifugazione discontinua in gradiente
di densità Siero umano aggregato di tipo AB (PhABS)LONZA (Walkersville MD-USA)14-490EConcentrazione finale: 10%
Glutamax-IThermoFisher (Waltham,  MA USA)35050-038L-glutammina
stabilizzata Concentrazione stock: 100x
Concentrazione finale: 2 mM
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma (St. Louis, MO, USA)A8412Concentrazione stock: 7,5%
Concentrazione finale: 0,5%
Azide di sodioSigma (St. Louis, MO, USA)S8032Concentrazione finale: 0,02%
Penicillina/Streptomicina (Pen Strep)Gibco ( Grand Island, NY, USA)15070-063Antibiotici
Concentrazione di riserva: 5.000 UI/ml penicillina, 5.000 μ g/ml di streptomicina
Concentrazione finale: 50 UI/ml di penicillina, 50 μ g/ml Pallone di coltura di streptomicina
T-75 per colture in sospensioneGreiner Bio-one  (Frickenhausen, Germania)658 190
Pallone di coltura T-75 trattato TCGreiner Bio-one  (Frickenhausen, Germania)658170
TrypLE SelectThermoFisher (Waltham,  MA USA)12563-011Soluzione di distacco di proteasi senza animali
Concentrazione di riserva: 1x
Concentrazione finale: 1x
Tripsina/EDTAThermoFisher (Waltham,  MA USA)15400-054Senza rosso fenolo
Concentrazione di riserva: 0,5%
Concentrazione finale: 0,25%
anticorpo anti-CD90 APC  (CD90)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germania)130-095-402Concentrazione finale: 1:40
anticorpo anti-CD45 APC-Vio770 (CD45)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germania)130-096-609Concentrazione finale: 1:40
anticorpo anti-CD73 PE (CD73)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germania)130-095-182Concentrazione finale: 1:40
anticorpo anti-CD31 PE Vio-770 (CD31)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germania)130-105-260Concentrazione finale: 1:40
Anticorpo IgG1 APC di topoMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germania)130-098-846Concentrazione finale: 1:40
Anticorpo IgG2a APC Vio770 di topoMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germania)130-096-637Concentrazione finale: 1:40
Anticorpo IgG1 PE di topoMiltenyiBiotec ( BergischGladbach, Germania)130-098-845Concentrazione finale: 1:40
IgG1 PE di topo Vio-770 anticorpoMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germania)130-098-563Concentrazione finale: 1:40
Dulbecco a basso contenuto di glucosio Medium  (DMEM)ThermoFisher (Waltham,  MA USA)13-1331-82Mezzo essenziale minimo privo di rosso fenolo
Concentrazione di riserva: 1.000 mg/L di glucosio
Siero fetale bovino  (FBS)ThermoFisher (Waltham,  MA USA)10500Concentrazione di riserva: 0,2 mg/ml
Concentrazione finale: 2 μ g/ml
Reagente antidissolvenza Prolong Gold con 4',6-diamidino-2-fenilindoloInvitrogen (Waltham, MA,  USA)P-36931Terreno di montaggio acquoso + DAPI
Concentrazione finale: 1x
ParaformaldeideSigma (St. Louis, MO, USA)P6148Fissativo
Concentrazione finale: 4%
LAB-TEK vetrini a camera a due pozzettiSigma (St. Louis, MO, USA)C6682
Anticorpo anti-nestina [clone 10C2]Abcam (Cambridge, UK)ab2035Concentrazione di base: 1 mg/ml
Concentrazione finale: 7 μ g/ml
Alexa Fluor 555 PhalloidinThermoFisher (Waltham,  MA USA)A34055Concentrazione di base: 200 UI/ml
Concentrazione finale: 5 UI/ml
Triton X-100Euroclone (Milano, Italia)EMR237500Concentrazione finale: 0,05%
MesenPRO RS Medium  (MSC-RS medio)ThermoFisher (Waltham,  MA USA)12746-012
Alexa Fluor 488 kit SFX anti-topoThermoFisher (Waltham,  MA USA)A31619Anticorpo secondario anti-topo di capra + potenziatore del segnale
Concentrazione di riserva: 2 mg/ml
Concentrazione finale: 2 μ g/ml
Pipetta Pasteur KartellLabware  (Noviglio (MI), ITALIA )329
SteloMACS AdipoDiff  MediaMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germania)130-091-679
StemMACS OsteoDiff  MediaMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germania)130-091-678
Osteoimage Saggio di mineralizzazione osseaLONZA (Walkersville MD-USA)PA-1503Soluzione di colorazione fluorescente specifica per idrossiapatite
50 ml Tubo conico in polistireneGreiner bio-one (Kremsmü nster
Austria)		227261
Nile RedThermoFisher (Waltham,  MA USA)N1142Soluzione colorante fluorescente per lipidi
Concentrazione stock: 100 mM
Concentrazione finale: 200 nm
GlicerinaSigma (St. Louis, MO, USA)G2289Concentrazione finale: 50%
Piastre di Petri in polistireneSigma (St. Louis, MO, USA)P5606
Piastre a 24 pozzetti trattate con TCGreiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Germania)662160
Terreno di crescita endoteliale, EGM-2 BulletKit  (EGM-2)LONZA (Walkersville, MD-USA)CC-3162Terreno di crescita delle cellule endoteliali ricco di VEGF
Software di analisi delle immagini Leica QwinLeica (Wetzlar, Germania)Software di analisi delle immagini
Eagle modificato di

Riferimenti

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