È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Umana Trophoblast primaria coltura cellulare modello per studiare gli effetti protettivi della melatonina contro ipossia / riossigenazione Disruption-indotta

15.3K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/54228

⸱

30 luglio 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INRS-Institut Armand-Frappier

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto presenta un modello unico in vitro di cellule di citotrofoblasto villoso umano immunopurificate coltivate in ipossia/riossigenazione. Questo modello è adatto per studiare gli effetti protettivi di trattamenti promettenti, come la melatonina, sulle complicanze della gravidanza associate all'aumento dello stress ossidativo e all'alterazione della funzione placentare.

Abstract

Questo protocollo descrive come le cellule villose del citotrofoblasto vengono isolate dalla placenta a termine mediante successive digestioni enzimatiche, seguite da centrifugazione per densità, isolamento del gradiente di terreno e purificazione immunomagnetica. Come osservato in vivo, le cellule villose mononucleate di citotrofoblasto in coltura primaria si differenziano in cellule multinucleate di sinciziotrofoblasto dopo 72 ore. Rispetto alla normossia (8% O2), le cellule villose del citotrofoblasto che subiscono ipossia/riossigenazione (0,5% / 8% O2) subiscono un aumento dello stress ossidativo e dell'apoptosi intrinseca, simile a quello osservato in vivo nelle complicanze della gravidanza come la preeclampsia, il parto pretermine e la restrizione della crescita intrauterina. In questo contesto, i trofoblasti villosi primari coltivati in condizioni di ipossia/riossigenazione rappresentano un sistema sperimentale unico per comprendere meglio i meccanismi e le vie di segnalazione che sono alterati nella placenta umana e facilitare la ricerca di farmaci efficaci che proteggano da alcuni disturbi della gravidanza. I trofoblasti villosi umani producono melatonina ed esprimono i suoi enzimi e recettori sintetizzanti. La melatonina è stata suggerita come trattamento per la preeclampsia e la restrizione della crescita intrauterina a causa dei suoi effetti antiossidanti protettivi. Nel modello di cellule primarie di citotrofoblasto villoso descritto in questo articolo, la melatonina non ha alcun effetto sulle cellule del trofoblasto allo stato normossico, ma ripristina l'equilibrio redox delle cellule di sinciziotrofoblasto interrotte da ipossia/riossigenazione. Pertanto, le cellule del trofoblasto villoso umano in coltura primaria sono un approccio eccellente per studiare i meccanismi alla base degli effetti protettivi della melatonina sulla funzione placentare durante l'ipossia/riossigenazione.

Introduzione

Nel corso della gravidanza umana, le cellule placentari citotrofoblasto, che sono le cellule staminali mononucleate, rapidamente proliferano e si differenziano in cellule sia citotrofoblasto villi o extravilloso. citotrofoblasti extravilloso invadono e rimodellano le arterie a spirale della parete uterina. Cytotrophoblasts villi, invece, continuano a proliferare, differenziare e fusibile per formare syncytiotrophoblast multinucleate (il sincizio) 1. Il mantenimento della omeostasi dei villi trofoblasto è essenziale per il benessere fetale e gravidanza sana. In realtà, trophoblasts villi consentono lo scambio materno-fetale di ossigeno e nutrienti, e producono ormoni essenziali per la gravidanza. Inoltre, il syncytiotrophoblast è l'unico tipo cellulare in diretto contatto con la circolazione del sangue materno e fornisce una barriera fisica e immunologica essenziale. Pertanto, il sinciziotrofoblasto deve subire apoptosi e la sostituzione per la manutenzione omeostatico e di AVOid placentare patologie 2-5.

La tecnica sviluppata da Kliman et al. 6 nel 1986 per isolare citotrofoblasti villi primari da placenta umana ha causato una rivoluzione nel campo della ricerca placentare, consentendo lo studio dei meccanismi molecolari coinvolti nella differenziazione dei villi trofoblasto. Questa tecnica classica, sulla base di digestioni enzimatiche sequenziali con tripsina e DNasi, seguita da isolamento nei media densità centrifugazione (particelle di silice colloidale rivestito da polivinilpirrolidone, o Percoll) è ormai riconosciuto come il gold standard per isolare le cellule citotrofoblasto villi. La tecnica può essere ottimizzata immunopurificazione magnetica, una procedura che separa cytotrophoblasts villi da cellule non trofoblastiche basati sull'espressione differenziale di antigeni specifici sulla superficie di queste cellule. Abbiamo scelto l'antigene leucocitario umano ABC (HLA-ABC) per l'assenza della sua espressione sulla membran cellulare trofoblasticae 7,8.

La placenta è un organo che subisce drammatiche variazioni nei livelli di ossigeno durante la gravidanza. Nel primo trimestre, il rapporto di ossigenazione è fisiologicamente molto bassa (2% O 2), ma aumenta a livelli lievi di ossigenazione (8% O 2) nel secondo e terzo trimestre. Tuuli et al. 9 descritto che la riproduzione in vitro dell'ambiente trofoblasto all'interno del villi della placenta è una sfida e le variazioni dei livelli di ossigenazione può anche portare a cambiamenti fenotipici. È pertanto suggerito di adottare dell'8% ossigeno come normossia per imitare la tensione di ossigeno trovato in villi placentari durante il terzo trimestre di gestazione 8,9. Chen et al. 10 ampiamente studiato diverse variabili legate alla tensione di ossigeno nelle cellule in coltura trofoblasto e dimostrato l'importanza di determinare i livelli di ossigeno in un ambiente pericellulare. I livelli di ossigeno nei villi tendono ad aumentarea causa di vasculogenesi. Il flusso di sangue placentare villi aumenta costantemente e il livello di perossido di idrogeno (un'abbondante specie reattive) è un segnale importante che controlla vasculogenesi 11,12. In complicazioni della gravidanza, la mancanza di vasculogenesi genera ipossia, e ancora più importante, le variazioni intermittenti di ossigenazione (chiamato ipossia / riossigenazione). Queste condizioni portano ad un aumento anomalo stress ossidativo, che compromette placentare e fetale 13,14 vitalità. Le alterazioni che le cellule del trofoblasto subiscono in vivo durante gli episodi di ipossia / riossigenazione possono essere imitate in vitro come segue: citotrofoblasti villi sono mantenute in condizioni di normossia (8% O 2) fino a quando non si differenziano in sinciziotrofoblasto. Essi vengono quindi sottoposti a condizioni di ipossia (0,5% O 2) per 4 ore, seguito da un ulteriore 18 ore di normossia (riossigenazione). Usando questo approccio ipossia / riossigenazione, trofoblasto exvietare liberalizzato stato redox e aumento dei livelli di apoptosi intrinseca 8, come è stato osservato in alcune complicazioni durante la gravidanza. Quindi, questo è un utile modello in vitro per valutare nuovi approcci preventivi e terapeutici per combattere le complicazioni della gravidanza associate a ipossia placentare / riossigenazione.

Cellule placentari producono melatonina, che ha diverse funzioni importanti, come la capacità di ovviare stress ossidativo e disfunzione placentare 15. Qui, presentiamo i modelli di approccio e cellulari sperimentali utilizzate per dimostrare gli effetti protettivi della melatonina in cellule del trofoblasto placentare a livello molecolare, cellulare e funzionale 8.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Placente sono stati ottenuti immediatamente dopo parto vaginale spontaneo da gravidanze complicate al CHUM-St-Luc Hospital, Montreal, QC, Canada, con consenso informato del paziente e l'approvazione dei comitati etici (CHUM-St-Luc Hospital e INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Canada).

1. isolamento e la purificazione delle cellule dei villi citotrofoblasto

  1. Soluzioni e supporti
    1. Preparare mezzi di trasporto, completandolo Dulbecco Modified Eagle Medio Alto-glucosio (DMEM-HG) con 1% vol / vol antibiotico (10.000 unità / ml di penicillina G, 100 mg / ml di streptomicina solfato) e conservare a 4 ° C.
    2. Preparare terreni di coltura primaria, completandolo DMEM-HG con il 10% vol / vol siero fetale bovino (FBS), 25 mM 4- (2-idrossietil) Acido -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1% vol / vol antibiotici (10.000 unità / ml di penicillina G, 100 mg / ml di streptomicina solfato) e conservare a 4 ° C. mezzi Riscaldare a 37 ° C primauso.
    3. Preparare 4 L di soluzione salina (0,9% di cloruro di sodio in peso / vol).
    4. Preparare modificato soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con l'aggiunta di 25 mM HEPES a 1x HBSS (pH 7,4).
    5. Preparare freschi, quattro bottiglie di soluzione di digestione con HBSS modificato (preparato in 1.1.4), solfato di magnesio (MgSO 4), cloruro di calcio (CaCl 2), tripsina, deossiribonucleasi IV (DNasi IV), e 1% vol / vol antibiotico ( 10.000 unità / ml di penicillina G, 100 mg / ml di streptomicina solfato) come mostrato in Tabella 1.
    6. Preparare la densità dei media centrifugazione in gradiente
      1. Preparare la densità centrifugazione soluzione multimediale completandola mezzi centrifugazione densità con 10% vol / vol HBSS 10x.
      2. Preparare 14 provette con soluzione supporti densità centrifugazione e modificato HBSS, come descritto nella Tabella 2.
      3. Mescolare ogni soluzione densità (passo 1.1.6.2) vigorosamente prima di aggiungere il suo contenuto al gradiente. Delicatamenteaggiungere le soluzioni densità a 50 ml tubo di vetro con una pompa peristaltica (1 ml / min), che inizia con la più alta concentrazione (70%). Evitare goccioline drenando le soluzioni contro la parete del tubo per mantenere la corretta separazione di ogni strato del gradiente.
        1. In assenza di una pompa peristaltica, applicare gli strati molto delicatamente con pipette Pasteur.
    7. Preparare tampone di corsa finale completando il tampone di corsa (vedi Tabella dei Materiali) con il 2% vol / vol antibiotico / antimicotico (10.000 unità / ml di penicillina G, 100 mg / ml di streptomicina solfato). Conservare a 4 ° C.
  2. Villi isolamento citotrofoblasto
    Nota: utilizzare sterile chirurgica attrezzature, vetreria, pipette, flaconi, ecc
    1. Il giorno di isolamento citotrofoblasto villi, a bagnomaria C 37 °, riscaldare le soluzioni digestioni (dal punto 1.1.5) e 70 ml di FBS. Nota: Usare 50 ml di FBS per interrompere la digestione e larestante 20 ml per la fase di congelamento (1.2.22), che possono essere immessi sul ghiaccio, una volta scongelati.
    2. Dopo la consegna, portare la placenta al laboratorio in terreno di trasporto ghiacciata (dal punto 1.1.1) il più rapidamente possibile (meno di 1 ora).
    3. mezzo di trasporto degli scarti e del sangue placentare in pattumiera liquido. Pesare la placenta ed immergerlo in soluzione salina fredda.
    4. Misurare e analizzare le seguenti caratteristiche: lunghezza del cordone ombelicale; localizzazione cordone ombelicale; lunghezza placentare, la larghezza, la forma (ovale, discoide); colore membrana; patologie struttura cotyledon. Nota: I dati sono presentati nella sezione risultati.
    5. Tagliare il cordone ombelicale al fianco il suo inserimento placentare (vale a dire, alla sua base, con un ulteriore 1 cm di raggio cerchio intorno al cavo). Immergere in 300 ml di soluzione di tessuto fissativo istologico (formalina al 10%) per l'analisi istologica successiva.
    6. Tagliare l'intera placenta a cubetti di 5 x 5 x 5 cm. Lavare accuratamente (4 volte x ~ 1 min) in sol salinaution (0,9%) per rimuovere le cellule del sangue fino soluzione salina è chiara. Eliminare il risciacquo liquido.
    7. In un vetro da orologio, rimuovere membrane placentari e tessuti trito per rimuovere i vasi sanguigni e calcificazioni. Tenere i vasi sanguigni saldamente con una pinza e rimuovere i tessuti utilizzando la parte posteriore di forbici Metzenbaum.
      1. Mettere placenta tritato in un imbuto Büchner. Risciacquare con circa 100 ml di soluzione salina tampone. Continuare a tritare fino 30 - 35 g di tessuto tritato si ottiene (l'uso di plastica barca e bilancia). Se necessario, tritare il resto della placenta avere fino a tre ulteriori 30 - preparazioni 35 g. Durante questo tempo, mettere dei tessuti macinata in una barca pesata su ghiaccio.
        Nota: Questo passo ci vorranno circa 45 minuti a 1 ora.
    8. Aggiungere il 30 - 35 g di tessuto placentare macinata in un pallone trypsinizing. Transfer 150 ml del preparato di digestione soluzione 1 (tabella 1) al pallone trypsinizing e mescolare bene.
    9. Porre il pallone in trypsinizingun bagno d'acqua agitando per 30 minuti ad una velocità di non più di 50 cicli / min e miscelare manualmente la beuta trypsinizing ogni 5 minuti per la digestione omogenea.
    10. Alla fine del primo digestione, rimuovere il matraccio trypsinizing dal bagno e inclinarlo (45 °) per 1 min per sedimentare il tessuto placentare. Con un 10 ml pipetta sterile, rimuovere ed eliminare circa 80 ml di surnatante. Evitare di aspirare il tessuto.
    11. Trasferire 100 ml di soluzione di digestione 2 (Tabella 1) al pallone trypsinizing; mescolare bene e ripetere il punto 1.2.9.
    12. Alla fine della seconda digestione, rimuovere il matraccio trypsinizing dal bagno e inclinarlo 45 ° per 1 min. Con un 10 ml pipetta sterile, rimuovere 80 ml surnatante e trasferire delicatamente per un tubo da centrifuga con un colino cella (100 mesh micron). Trasferire il surnatante filtrato in un becher contenente 2 ml di FBS ogni volta la provetta è pieno.
    13. Eseguire il terzo digestione come descritto per ilsecondo la digestione (1.2.11 e 1.2.12) con 75 ml di soluzione di digestione 3. In parallelo, eseguire i passaggi 1.2.15 a 1.2.16.1 per la digestione 2.
    14. Eseguire il quarto digestione identico al terzo digestione con la soluzione di digestione 4 (75 ml), ma raccogliere una quantità massima di surnatante. Eseguire le operazioni da 1.2.15 a 1.2.16.1 in parallelo per la digestione 3, e, infine, per la digestione 4.
    15. Aliquotare il surnatante (da digestioni 2, 3 e 4) in 13,5 ml parti, ciascuna parte in una provetta da centrifuga da 15 ml. Con una lunga 22,8 cm pipetta Pasteur di vetro, molto delicatamente e lentamente posizionare 1,5 ml di FBS al fondo di ogni tubo in modo da creare uno strato separato. Non mescolare FBS e surnatante. Centrifugare i tubi senza freno per 20 min a 1250 xga temperatura ambiente.
      Nota: Dopo centrifugazione, 4 strati sono visibili nel tubo, come mostrato nella Figura 1 La separazione delle cellule tripsina e trofoblasto evita eccessivo digestione cellulare..
    16. Con una pompa a vuoto, aspirmangiato e scartare il surnatante (soluzione digestione) e strati FBS, tra cui la pellicola biancastra tra i due strati. Risospendere il pellet (i trophoblasts e strati di globuli rossi) con 1 ml di mezzo di coltura cellulare calda (fase 1.1.2, senza FBS e senza HEPES).
      1. Raccogliere cellule risospese da tutte le provette e combinarli in 1 tubo. Lasciare riposare a temperatura ambiente fino alla fine di tutte digestioni. Nota: Dopo tutte le digestioni, il rendimento abituale è di 3 tubi di cellule risospese (uno per la digestione).
    17. Portare al volume di 15 ml con mezzo di coltura cellulare caldo. Centrifugare a 1250 xg per 10 min a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante con una pompa a vuoto. Evitare di aspirare il pellet.
    18. Risospendere delicatamente il pellet ottenuto dalle 3 tubi con 1 ml di Abbastanza caldo coltura cellulare. In comune il loro contenuto in 1 tubo. Per ottenere 8 ml, completare il volume con il mezzo di coltura cellulare caldo.
    19. Molto strato delicatamente la sospensione cellulare su un grad di separazioneiente con una pipetta Pasteur. Centrifugare senza freno per 30 min a 507 xg a temperatura ambiente.
    20. Dopo centrifugazione, identificare i diversi strati di cellule in gradiente con retroilluminazione. Individuare gli strati che contengono trofoblasto e contaminanti cellule tra il 40 - 50% di media densità centrifugazione. Con una pompa a vuoto, rimuovere gli strati superiori (> 50%).
    21. Raccogliere le cellule situate negli strati di interesse con una pipetta Pasteur e trasferirli in una provetta da centrifuga da 50 ml. Portare al volume di 50 ml con terreno di coltura cellulare. Centrifugare per 10 minuti a 1250 xg a temperatura ambiente.
    22. In condizioni sterili, scartare il surnatante, risospendere il pellet con 20 ml di FBS e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Sul ghiaccio, aggiungere 2,22 ml di dimetilsolfossido sterile (DMSO) e mescolare delicatamente spostando. Aliquotare 1,5 ml di sospensione cellulare in fiale criogeniche, congelare una notte a -80 ° C e trasferire ad un serbatoio di azoto liquido.
  3. purificazione Trofoblasto
    1. Installare il risciacquo e buffer in esecuzione e una nuova colonna di filtro sullo strumento di purificazione magnetica in base alle istruzioni del produttore. Eseguire il programma "pulito" per pulire negativi porte 1, positivo 1 e positivo 2, e quindi introdurre i tubi da 50 ml sotto ogni porta secondo le istruzioni del produttore.
    2. Scongelare le cellule che sono stati congelati in passaggio 1.2.22 rapidamente in un bagno di acqua C 37 °. Trasferire le cellule in una provetta da 50 ml e risospendere le cellule delicatamente con 20 ml di soluzione tampone fredda corrente. Centrifugare la provetta per 5 minuti a 450 xg e 4 ° C.
    3. Eliminare il surnatante. Ripetere la fase di lavaggio con tampone fredda corrente. Contare le cellule utilizzando un emocitometro per determinare la vitalità. Ripetere la centrifugazione (per 5 min, 450 xga 4 ° C). rimuovere con attenzione il surnatante. Aggiungere 1 ml di tampone fredda contenente 1% vol / vol di topo anticorpi anti-HLA-ABC. Incubare a 4 ° C per 30 min, mixing delicatamente ogni 5 minuti.
    4. Aggiungere 6 ml di tampone fredda corrente. Centrifugare per 5 min a 450 xg e 4 ° C. Eliminare il surnatante e ripetere questo passaggio. Risospendere le cellule in 1 ml di tampone fredda contenente 10% vol / vol di anti-topo sfere magnetiche anticorpi accoppiati secondarie. Incubare a 4 ° C per 15 minuti, mescolando delicatamente ogni 5 min.
    5. Aggiungere 6 ml di tampone fredda corrente. Centrifugare per 5 min a 450 xg e 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere in 5 ml di tampone fredda corrente.
    6. Separare le cellule del trofoblasto utilizzando lo strumento di purificazione magnetica. Raccogliere cellule al porto negativo e aggiungere 20 ml di tampone fredda.
      Nota: cellule del trofoblasto non contengono il complesso HLA-ABC, e sono quindi separati da altri tipi di cellule e diretti verso il porto 1 negativo.
    7. Centrifugare per 5 min a 450 xg e 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere delicatamente le cellule in 20 ml di caldo terreno di coltura primaria. Contare le cellule usinga emocitometro per determinare la vitalità.
    8. Piastra le cellule ai seguenti densità: 0.15 x 10 6 cellule / pozzetto in piastre a 96 pozzetti, 1,6 x 10 6 cellule / pozzetto in piastre da 24 pozzetti e 4,5 x 10 6 cellule / pozzetto in 6 pozzetti. Incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2.
    9. Confermare la purezza delle cellule del trofoblasto mediante citometria di flusso 16,17 e / o immunocitochimica 18.
      Nota: La purezza delle cellule immunopurified è stato determinato utilizzando anticorpi monoclonali coniugati FITC-contro-citocheratina 7 e vimentina 17-19. Questo protocollo è ben dettagliata in Lanoix et al., 2008 7.
    10. Dopo almeno 4 ore, lavare le cellule due volte con mezzo di coltura calda per rimuovere le cellule senza legami e poi trasferire le piastre alla camera normoxia, che è composta da 8% O 2 (vedi figura 2 e la sezione 2).

2. In Vitro installn di normossia e ipossia / riossigenazione

  1. Il funzionamento della camera Incubator (vedi Figura 2A per il set-up).
    1. In una cappa a flusso laminare, collocare un piatto Petri contenente acqua sterile sul fondo della camera di incubazione per evitare secchezza; quindi posizionare le piastre o fiaschi (step 1.3.10) di coltura cellulare precedentemente preparati sugli scaffali superiori della camera.
    2. All'esterno della cappa, collegare la camera (porta di ingresso) al tubo di gas (Figura 2A: 5a, b, c) per raggiungere il tubo di gas (8% O 2 o 0,5% O 2) (Figura 2A: 7). Aprire entrambe le porte di entrata e di uscita della camera. In questo momento, il regolatore del gas (Figura 2A: 4) dovrebbe rimanere chiuso.
    3. Aprire con cautela la valvola di regolazione del gas (Figura 2A: 4). Flush per 4 minuti con un flusso di aria di 25 L / min per sostituire completamente l'aria all'interno della camera.
    4. Dopo il lavaggio della camera, chiudere il regolatore del gas poi l'ingresso e l'UOporti tlet della Camera.
    5. Scollegare il tubo di scarico flussometro (Figura 2A: 5c) dalla porta di ingresso della camera e posizionare la camera in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C.
    6. Sostituire l'aria attualmente presenti nelle piastre, flaconi e disciolto nel mezzo di coltura riempiendo la camera a gas 1 ora dopo passo 2.1.3.
    7. Ripetere i punti da 2.1.1 a 2.1.6 per le altre composizioni del gas (ad esempio, 2% O 2 per il primo trimestre cultura trofoblasto 9).
  2. Confermare la percentuale di ossigeno (Figura 2B-C)
    1. Per confermare la concentrazione di ossigeno nel terreno di coltura cellulare (senza cellule) all'interno della camera, utilizzare un elettrodo di ossigeno collegato ad un adattatore di ossigeno. Collegare l'elettrodo ossigeno ad un voltmetro.
    2. Creare una curva di calibrazione nella stessa soluzione (cioè, coltura cellulare medium) esponendo la soluzione ai gas con un contenuto di ossigeno noto (ad esempio, 0% e21% di ossigeno). Dopo le letture sono stabilizzare per ciascuna concentrazione, introdurre l'elettrodo nel mezzo della camera.
      Nota: prendere tutti misura alla stessa profondità in modo da evitare qualsiasi distorsione della concentrazione di ossigeno 10.
  3. Induzione di normossia e ipossia / riossigenazione in trophoblasts.
    1. Dopo l'aggiunta di cellule del trofoblasto primarie alle appropriate fiasche di coltura cellulare, piatti o piastre Petri, effettuare trattamenti come necessarie.
    2. Parallelamente, all'interno della camera, esporre le cellule per la miscela di gas desiderata per riprodurre una condizione specifica ogni 24 ore (Figura 3).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Isolamento e immunopurificazione di cellule citotrofoblasto villi da una normale placenta termine ottenuti da parto vaginale ha prodotto 1 x 10 8 cellule vitali. La placenta pesava 350 g, era di 19 cm di diametro, 4 cm di altezza con forma discoidale e le membrane trasparenti. è stata rilevata alcuna cotyledon malformazione. Il cordone ombelicale aveva localizzazione paracentrale e una lunghezza di 56 cm. La purezza è stata valutata mediante citometria a flusso utilizzando vim...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Nei mammiferi, lo sviluppo fetale è direttamente dipendente adeguata funzione placentare. Le origini dello sviluppo di disturbi di salute sono basate sull'ipotesi che la causa delle malattie che si manifestano più tardi nella vita può essere fatta risalire al primo sviluppo e che la placenta ha un ruolo meccanicistico nella programmazione fetale 30-32. La placenta è il mediatore chiave della crescita e lo sviluppo fetale: regola il trasferimento dei nutrienti, protegge contro le esposizioni dannose, e ha ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Sostenuto da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (n. 262011-2009) a CV e dalla sovvenzione March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research (#12-FY12-179) a CV e JTS; da borse di studio a LSF dal Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) e dalla Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, a HC dal Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, ad AAHT dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e FRQ-Santé, e a JBP da NSERC; da una borsa di studio a EMAS del Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) e del Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Forbici Metzenbaum curveAttrezzatura chirurgica Shandon9212(isolamento cellulare) (2 unità)
Pinze per schegge Fine 41/2 inFisherbrand13-812-42attrezzatura chirurgica (isolamento cellulare) (2 unità)
Forbici 4,5 Str DissezioneFisherbrand08-940attrezzatura chirurgica (isolamento cellulare) (2 unità)
Spugna di garza 10 cm x 10 cmCardinal Health
Teglia in vetro oblungoPyrex1105397vetreria (2,8 L)
Imbuto BuchnerCoorstek Inc10-356EVetreria (diametro 114 mm)
Orologio in vetro pyrex9985100EMDVetreria
Soluzione di formalina, tamponata neutra, 10%Sigma-AldrichHT501128-4Lsoluzione fissativa istologica tissutale
Palloni di tripsinizzazioneWheaton355395vetreria (1 unità)
Provette di coltura monousoKimble73750-13100Vetreria
Vetro borosilicato Pasteur Pipet (22,8 cm)FisherbrandK63B1367820Cvetreria
Bicchieri di vetro da 250 mlFisherbrandKFS14005250Glassware
Flaconi di vetro con tappoFisherbrandKFS14395250vetreria (8 unità)
Tubo Corex da 50 ml Corning8422-A(1 unità)
Provetta da centrifuga in polistirene da 15 mlCorning430791
Provetta da centrifuga in polistirene da 50 mlCorning430829
Pipetta sierologicaCorning11415038
Cell Strainer 100 μ m NylonCorning431752
Fodera assorbenteScienceware1199918
500  Bottiglie da ml Filtro superioreCorningPore: 0,22 µ m / medium e preparazione HBSS
Fiale criogeniche da 2 mlCorning430488
Contenitore di congelamento, Nalgene Mr. FrostySigma-AldrichC1562-1EA
Pompa peristalticaPharmacia Fine Chemicalsmodello
Agitazione Bagno d'acquaFishermodello 127
Pompa a vuotoABM4EKFS6CX-4
Cloruro di sodioFisherbrandEC231-598-3Soluzione salina 0,9%
Hank' s Soluzione salina tamponata (Hbss)Sigma-AldrichH2387Quantità: 9,25 (una fiala) per 1 L di soluzione di digestione
Acido idrossipiperazineetansulfonico (Hepes)Life Technologies15630-08025 ml (1 M) per 1 L di soluzione digestiva
Tripsina Tipo ISigma-AldrichT80039.888 U
Deossiribonucleasi Tipo IVRoche10-104-159-001402.000 U
Cloruro di calcioSigma-AldrichC4901100 mM
Solfato di magnesioBaker2500-01800 mM
Dulbecco' s Eagle modificato Glucosio medio alto (Dmem)Life Technologies10564-045
Penicillina/streptomicina solfatoHycloneSV30010
Siero fetale bovino Corning35-010-CV
PercollSigma-AldrichP1644Gradiente di terreni di centrifugazione a densità. Volume: 36 ml
di isopropanoloAcros42383-001050 ml
di dimetilsolfossidoSigma-Aldrich472301
separatore magnetico Automacs.Miltenyi BiotecModello 003
Automacs Colonne Miltenyi Biotec130-021-101
Automacs Running Buffer Miltenyi Biotec130-091-221http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1
Soluzione di risciacquo Automacs Miltenyi Biotec130-091-222http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx
Clone purificato Hla Abc anti-umano W6/32Affymetrix eBioscience14-9983-82anticorpo anti-topo
Microsfere Igg anti topoMiltenyi Biotec130048401
a pozzetti multipli -  6 pozzetti con CoperchioCorning3335Superficie di rilegatura delle celle
Piastra a pozzetti multipli -  24 pozzetti con coperchioCorning3337Superficie di rilegatura delle celle
Piastra a pozzetti multipli -  96 pozzetti con coperchioCorning3300Superficie di rilegatura delle celle
Camera dell'incubatore modulare Billups-RothenbergMIC-101Un set di due è necessario per generare simultaneamente condizioni di normossia e ipossia/riossigenazione
Misuratore di portata singoloBillups-RothenbergSFM3001
50 mm Filtro in lineaWhatman6721-5010PTFE, pore: 1,0 &; m
Regolatore di gasPro StarPRS301233È necessario un set di due per generare simultaneamente condizioni di normossia e ipossia/riossigenazione
Tubo del gas Classe Vi Trasparente 5/16 Parker100-050701023 pezzi con ~ 0,5 m
17 mm Regolabile Tubo del gasFascetta TiewrapsTHCSS-16
Bombola di gas Normoxia PraxairNI CDOXR1U-KTaglia K (3rd: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2)
Bombola di gas Normoxia PraxairNI CDOXR1U-KTaglia K (3rd: 5% CO2, 0,5% O2, Bal. N2)
Microelettrodo di ossigeno Microelettrodi Mi-730Microelettrodi Adattatore di ossigeno INC84477
Reagente3572
: CM-H2DCFDA InvitrogenC-400
β-hCG DRG internazionaleEIA-4115
Anticorpo purificato anti-vimentinaeBioscience14-9897Ospite:
anticorpo anti-citocheratina 7 (FITC) di topo Abcamab119697Ospite: mouse
Alexa Fluor 488 Capra Anti-mousse IgG H& Anticorpo LLife TechnologiesA-11029
361020733P3 piastra Composizione del trimestre Composizione del trimestre di rilevamento ROS INC Kit ELISA

Riferimenti

  1. Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
  2. Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
  3. Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
  4. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
  5. Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
  6. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  7. Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
  8. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
  9. Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
  10. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
  11. Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
  12. Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
  13. Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
  14. Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
  15. Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
  16. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
  17. Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
  18. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
  19. Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
  20. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
  21. Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
  22. Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
  23. Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
  24. Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
  25. Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
  26. Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
  27. Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
  28. Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
  29. Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
  30. Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
  31. Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
  32. Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
  33. Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
  34. Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
  35. Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
  36. Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
  37. Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71(2015).
  38. Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
  39. Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
  40. Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
  41. Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
  42. Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
  43. McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
  44. Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
  45. Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
  46. Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
  47. Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
  48. Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
  49. Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
  50. Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
  51. Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
  52. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
  53. Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
  54. Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
  55. Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141(2013).
  56. Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788(2013).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Isolamento del citotrofoblasto villosocultura primaria di trofoblastimodello di ipossia riossigenazioneeffetti protettivi della melatoninapurificazione immunomagneticacentrifugazione per gradiente di densitanalisi tramite citometria a flussodifferenziamento del sinciziotrofoblastovalutazione dello stress ossidativosecrezione di beta hCG
Umana Trophoblast primaria coltura cellulare modello per studiare gli effetti protettivi della melatonina contro ipossia / riossigenazione Disruption-indotta
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.