Un metodo facile per piante polysome Profiling

Summary

Questo protocollo descrive un metodo semplice per estrarre e frazionare i trascritti dai tessuti vegetali sulla base del numero di ribosomi legati. Permette una stima globale dell'attività traduttiva e la determinazione dello stato traduzionale di specifici mRNA.

Abstract

La traduzione dell'mRNA in proteina è un processo biologico fondamentale e altamente regolamentato. La profilazione dei polisomi è considerata un gold standard per l'analisi della regolazione traslazionale. Il metodo qui descritto è un modo semplice ed economico per frazionare i polisomi da vari tessuti vegetali. Un gradiente di saccarosio viene realizzato senza la necessità di un creatore di gradienti congelando in sequenza ogni strato. Gli estratti citosolici vengono quindi preparati in un tampone contenente cicloesimide e cloramfenicolo per immobilizzare i ribosomi citosolici e cloroplastici a mRNA e vengono caricati sul gradiente di saccarosio. Dopo la centrifugazione, sei frazioni vengono raccolte direttamente dal basso verso l'alto del gradiente, senza forare la provetta di ultracentrifugazione. Durante la raccolta, l'assorbanza a 260 nm viene letta continuamente per generare un profilo polisomico che fornisce un'istantanea dell'attività traduzionale globale. Le frazioni vengono quindi raggruppate per preparare tre diverse popolazioni di mRNA: i polisomi, mRNA legati a diversi ribosomi; i monosomi, mRNA legati a un ribosoma; e mRNA che non sono legati ai ribosomi. Gli mRNA vengono quindi estratti. Questo protocollo è stato convalidato per diverse piante e tessuti, tra cui piantine di Arabidopsis thaliana e piante adulte, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum e foglie di Oryza sativa.

Introduction

La sintesi proteica è un processo essenziale e energeticamente costosa in tutte le cellule ^1. Prima di tutto, le cellule devono investire energie nella produzione delle macchine di traduzione, i ribosomi. Per esempio una cellula di lievito che divide attivamente produce fino a 2.000 ribosomi al minuto. Tale produzione richiede fino al 60% del totale attività trascrizionale e fino al 90% dell'attività splicing totale della cella ^2. Inoltre, l'energia è necessaria per la sintesi di amminoacidi,-tRNA e legami peptidici. Nelle piante, l'aggiunta di un aminoacido ad un costo catena peptidica da 4,5 a 5,9 molecole di ATP ^3. Pertanto, non è sorprendente che la traduzione di mRNA di proteina è un importante sito di regolazione, in particolare quando si tratta di trattare con mutevoli condizioni ambientali.

Il passo inizio della traduzione, che è l'associazione di un mRNA con il ribosoma, è l'obiettivo principale del regolamento ditraduzione ^4. Come conseguenza della regolazione della traduzione nonché altri passaggi normativi post-trascrizionale, solo il 40% delle variazioni della concentrazione di proteine ​​può essere spiegato con mRNA abbondanza ^5,6. Così, lo studio di mRNA totale fornisce informazioni relativamente scarsa su l'abbondanza di proteine. D'altra parte, l'associazione di mRNA con ribosomi dà una migliore comprensione abbondanza di proteine, dando accesso a tali mRNA coinvolti nella traduzione. mRNA attivamente tradotti sono associati a diversi ribosomi in strutture chiamate polisomi. Al contrario, mRNA mal tradotti saranno associati con una sola ribosoma (monosome). Di conseguenza, lo stato traduzionale di mRNA può essere valutata monitorando la sua associazione con ribosomi ^7.

Questo protocollo descrive l'isolamento di polisomi da sei giorni piantine Arabidopsis thaliana, il successivo isolamento di RNA, e l'analisi dei risultati. Polysomes e monosomes sono separati attraverso un gradiente di densità di saccarosio. Le sfumature sono raccolti in sei frazioni. Alcune delle frazioni viene riunito per ottenere tre frazioni ben separati: polisomi, monosomes e la frazione leggera (di seguito denominato surnatante), che contiene le libere 60 e 40S subunità ribosomiale e mRNA che non sono associati con i ribosomi. attività di traduzione globale può essere stimato generando un rapporto segnale / rumore monosome polysome, che è determinata dalla integrazione dell'area sotto la curva, e confrontando i profili polisomi. mRNA e le proteine ​​vengono poi estratte da diverse frazioni e utilizzati per l'analisi mediante RT-PCR, qRT-PCR, Northern blot, microarray, macchia occidentale o la proteomica. Questo protocollo è stato convalidato per altre piante e tessuti.

Il materiale necessario per effettuare questo protocollo si trovano comunemente nella maggior parte dei laboratori: Non vi è alcuna necessità di un creatore di gradiente. Congelamento ogni strato prima di aggiungere il successivo prevenires da qualsiasi miscela o disturbo degli strati. N perforatore tubo è utilizzato per la raccolta di gradiente che può essere raggiunto mediante immersione di un tubo capillare di vetro nel gradiente. Pertanto, i tubi ultracentrifuga costose rimangono integre e possono essere riutilizzati più volte. Collettivamente, questo rende il presente protocollo un metodo semplice ed economico per il profiling polysome.

Protocol

1. Preparazione del 20 al 50% (w / v) di saccarosio gradienti

Nota: I gradienti sono fatti di strati 4 di saccarosio (50%, 35% e 2 strati di 20%) in un tubo ultracentrifuga 13,2 ml. Nella nostra esperienza, versando il saccarosio del 20% in due strati separati migliora notevolmente la qualità delle preparazioni polysome.

1. Preparare le soluzioni madre. Assicurarsi che tutte le soluzioni sono RNAsi e DNAsi gratuito.
   1. Preparare 10X soluzione salina: 400 mm Tris-HCl pH 8.4, 200 mm e 100 mm KCl MgCl _2.
   2. Preparare 2 M saccarosio Soluzione: Per 200 ml, sciogliere 137 g di saccarosio in 1X soluzione salina.
2. Diluire la soluzione di saccarosio in soluzione salina, come descritto nella Tabella 1, per preparare i gradienti. I volumi indicati sono per sei pendenze.

La concentrazione di saccarosio finale	saccarosio 2M (ml)	Sale soluzione 1X (ml)	Vol finale. (ml)
50%	8.8	3.2	12
35%	12.9	12.1	25
20%	7.4	17.6	25
20%	5.8	14.2	20

Tabella 1. Le diluizioni della soluzione di saccarosio per preparare sei gradienti.

3. Versare gli strati come da Tabella 2.

strato di saccarosio	50%	35%	20%	20%
Vol. (Ml)	1.85	3.65	3.65	1.35

Tabella 2. Volume di soluzione di saccarosio per strato.

4. Dopo aver versato ogni strato, tenere i tubi in un -40 ° C o -80 ° C fino a completa freezer congelamento prima di aggiungere il successivo strato di saccarosio. Il congelamento viene solitamente raggiunta dopo 2 ore a -40 ° C, ma si consiglia di attendere circa 6 ore prima di versare lo strato successivo. L'ultimo strato 20% può essere congelato o aggiunta di fresco il giorno dell'esperimento.
   Nota: congelamento ogni strato prima di aggiungere il successivo impedisce qualsiasi mescolanza o disturbo degli strati. Gradienti possono essere conservati in una -40 ° C o -80 ° C freezer per almeno sei mesi.
5. Se non è già stato fatto, aggiungere l'ultimo strato 20% ai gradienti il ​​giorno dell'esperimento. Poi, lasciare che i gradienti scongelare in una stanza fredda o di un frigorifero.

2. Preparazione di citosoliche Estratti

Nota: Raccomfinire utilizzando due gradienti per campione biologico. 300 mg è la quantità ottimale di materiale vegetale per preparare due gradienti quando si lavora con 6 giorni di età piantine Arabidopsis thaliana. Quando si lavora con tessuti meno traduzionale attivi, la quantità di materiale vegetale può essere aumentata fino a 600 mg.

1. Harvest sei giorni vecchie piantine coltivate in ½ Murashige e Skoog ⁸ di media integrato con 1% di saccarosio o mezzi equivalenti dal rapido congelamento in azoto liquido
2. materiale vegetale macinare in un mortaio e pestello pre-raffreddata con azoto liquido.
3. Pesare 300 mg di materiale in polvere in un piatto di pesatura preraffreddato. Eseguire questo passaggio rapidamente per evitare lo scongelamento del campione.
   Nota: Mantenere i campioni congelati per non più di una settimana in un congelatore C -80 °.
4. Aggiungere 2,4 ml di tampone polysome pre-raffreddata (Salt Solution 4X, 5,26 mM EGTA, 0,5% (v / v) Octylphenoxy poli (etilenossi) etanolo, ramificati, 50 μg.ml ^-1 cicloesimide, 50 μg.ml ¹cloramfenicolo) e omogeneizzare mescolando con la punta della pipetta. Trasferire in due provette da 1,5 ml. Lavorare velocemente per evitare che i campioni da riscaldamento.
5. Centrifugare a 16.000 xg per 15 min a 4 ° C in una microcentrifuga a pellet detriti.
   Nota: per evitare la degradazione dell'RNA, tenere sempre i campioni a 4 ° C, usare soluzioni libere RNasi / DNasi e il lavoro in condizioni di libero RNasi / DNasi. Eparina può essere aggiunto al buffer polysome, ad una concentrazione finale di 300 μg.ml ^-1, per migliorare la protezione RNA. Tuttavia, poiché l'eparina può interferire con l'analisi valle, dovrà essere rimosso durante la fase di precipitazione RNA eseguendo litio precipitazione cloruro invece di precipitazione con etanolo (cfr nota 4.7).

3. polysome Profiling

1. pipetta con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. Se i frammenti vegetali sono stati pipettati, ripetere il punto 2.5. Caricare il surnatante sopra del gradiente da pipettin delicatamenteg sulla parete laterale del tubo in un flusso costante. Utilizzare una pendenza per ogni provetta da 1,5 ml.
2. Trasferimento preraffreddato secchi e centrifugare a 175.000 xg per 2 ore 45 min a 4 ° C, in un'ultracentrifuga (es 32.000 rpm utilizzando un rotore SW41).
3. Impostare il sistema di raccolta gradiente come descritto nella figura 1. La cuvetta UV ha un cammino ottico 1 mm.

Figura 1. sistema di raccolta Gradiente. La cuvetta UV è collegato da polivinil cloruro di tubo ad un tubo capillare di vetro che scende verso il fondo del gradiente. Il gradiente procede attraverso il sistema attraverso una pompa peristaltica. OD ₂₆₀ è continuamente letto e 2 ml frazioni vengono raccolte. Clicca qui per vedere una versione più grandequesta figura.

4. Regolare il raccoglitore di frazioni di RT, e impostare il carosello ad una velocità che permetterà la raccolta di 2 ml frazioni. Utilizzare tubi pre-raffreddato di raccolta.
5. Raccogliere le frazioni dal basso verso l'alto utilizzando un tubo capillare di vetro collegato da tubi di cloruro di polivinile per il sistema di raccolta gradiente. Utilizzare una pellicola di paraffina in plastica per assicurare il collegamento tra il tubo di cloruro di polivinile e il tubo capillare di vetro.
6. Leggere l'assorbanza a 260 nm dal basso verso l'alto del gradiente. Quando l'intero gradiente viene raccolto, posizionare i tubi di raccolta sul ghiaccio prima estrazione di RNA.

4. RNA Estrazione

1. Pool frazioni raccolte da due gradienti, in 50 ml con tappo provette da centrifuga, come segue:
   Polisomi: frazioni da 1 a 3 (12 ml)
   Monosomes: frazione 4 (4 ml)
   Surnatante: frazioni 5 e 6 (8 ml)
2. Per ogni frazione, aggiungere 1 vol. 8M guanidina cloridrato,50 mcg vettore acrilico e 1,5 vol. isopropanolo.
   Nota: Acrilico vettore è acrilammide lineare, usato come coprecipitant per migliorare il recupero di acidi nucleici durante la precipitazione alcool.
3. Miscelare invertendo i tubi e precipitare O / N a -20 ° C.
4. Centrifugare a 175.000 xg per 1 ora a 4 ° C, in un'ultracentrifuga (32.000 rpm in un rotore SW32). Se la fase di precipitazione viene eseguita in un tubo che non è compatibile con ultracentrifugazione, trasferire ad un tubo adatto.
5. Gettare il surnatante e sciogliere il precipitato in 200 microlitri di buffer TE RNasi-free (10 mM Tris-HCl pH 7,5-1 mM EDTA). Trasferire in una nuova provetta da 1,5 ml.
6. Estratto di RNA con l'aggiunta di 1 vol. acqua fenolo saturo (pH 6,6) e 1 vol. cloroformio: alcool isoamilico (24: 1). Mescolare energicamente. Centrifugare a 15.000 xg per 20 min a 4 ° C. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta da 1,5 ml.
   Nota: fenolo acido (pH 4.5) può essere utilizzato per ridurre al minimo la contaminazione del DNA.
7. Precipitato RNA con l'aggiunta di 1/10 vol. 3 M acetato di sodio e 3 vol. 100% di etanolo. Consentire precipitazioni a -80 ° C per 20 minuti o O / N a -20 ° C. Centrifugare a 15.000 xg per 15 min a 4 ° C.
   Nota: Se si usa eparina nel buffer polysome (cfr nota 2.5), eseguire un cloruro di litio (LiCl) la precipitazione invece di precipitazione in etanolo per rimuovere correttamente ogni traccia di eparina che possa interferire con l'analisi a valle ^9. Dopo l'estrazione, aggiungere LiCl ad una concentrazione finale di 2,5 M. Lasciar precipitazione per 30 minuti a -20 ° C o O / N a 4 ° C. Centrifugare a 15.000 xg per 15 min a 4 ° C.
8. Lavare il pellet con 500 microlitri 75% di etanolo. Far asciugare il pellet e sciogliere in 30 microlitri di buffer TE. Valutare la qualità di RNA mediante elettroforesi su un RNasi gratis 1,2% gel (100V, 15 min) o con metodi elettroforesi capillare.

Analisi 5. I dati

1. Esportazione dati grezzi ad un software grafico e l'analisi dei dati.
   Nota: Come mostrato in Figura 2A e B, i profili grezzi forniscono informazioni qualitative: il numero di picchi polysome che può essere visto, l'altezza del picco monosome, e la presenza di una spalla corrispondente alle subunità ribosomi liberi.
2. Unire i profili per permettere il confronto dei profili tra i campioni. Utilizzare lo strumento lettore di schermo per determinare il valore X del picco monosome per ogni campione e allineare i picchi monosome rimuovendo punti dati supplementari all'inizio delle curve. Identificare il punto più basso della curva e determinare il valore Y (utilizzando lo strumento di lettore di schermo). Impostare il valore Y punto più basso a 0 utilizzando la funzione "Imposta valore colonne".
3. Determinare il rapporto polisomi / monosomes integrando l'area sotto la curva di profili grezzi (Figura 3C). Utilizzare lo strumento di selezione dati per definire il bordo dell'area da integrare. Quindi utilizzare la funzione di integrare (Analisi-matematica).
4. Normalizzarele curve a picco monosome dividendo tutti i punti dati di una curva per il valore Y del vertice del picco monosome (determinati utilizzando lo strumento di lettura dello schermo). Selezionare la colonna, poi sotto analisi-matematica, selezionare Normalizza e scegliere le "divise da un valore specificato" metodi. Questo passaggio consente il confronto del livello relativo di polisomi (Figura 3D).

Figura 2. Profili polysome rappresentativi. Arabidopsis thaliana wild-type (WT, ecotipo Col-0) e piantine mutanti sono state coltivate per sei giorni in ½ Murashige e medie Skoog sotto fotoperiodi giorno lunghe (luce 16 ore, 8 ore scure). A: profili polysome prime provenienti da piante WT. B: profili polysome prime provenienti da piante mutanti. C: Determinazione della percentuale di polisomi e monosomes dalla integrazione dell'area sotto la curva D: profi polysomeles normalizzata al picco monosome. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Results

In letteratura, profili polysome sono spesso mostrati dalla frazione leggera alla frazione pesante come una conseguenza del modo gradienti vengono raccolti, cioè dalla parte superiore alla parte inferiore. Poiché nel protocollo descritto qui le pendenze sono raccolti dal basso verso l'alto, i profili mostriamo iniziano con la frazione pesante (i polisomi) e andare alla frazione leggera (subunità libera ribosoma e RNA) (Figura 2A). Abbiamo poi raccogliere ogni sfumatura i...

Discussion

Il protocollo che presentiamo qui è un metodo semplice ed economico per generare profili di polisomi e isolare mRNA associati a polisomi, ribosomi singoli o privi di ribosomi. In letteratura è descritta un'ampia gamma di diversi metodi di frazionamento dei polisomi. Il metodo che abbiamo descritto qui è stato ottimizzato per mantenere solo i composti necessari ed è stato adattato per il materiale vegetale. In particolare, abbiamo ridotto la quantità di detergente¹¹ e aggiunto cloramfenicolo al tampone per fiss...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provetta per ultracentrifuga, a parete sottile, in poliallomero - 13,2 ml	Beckman Coulter	331372
Provetta per ultracentrifuga, a parete sottile, in poliallomero - 38,5 ml	Beckman Coulter	326823
Provetta capillare in vetro	Drummond Scientific	1-000-1000
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima serie
Ultracentrifuga Rotore SW41	Beckman Coulter	331362
Ultracentrifuga Rotore SW32	Beckman Coulter	369650
Pompa peristaltica	Qualsiasi
Tygon R3607 polivinilcloruro tubo	Fisher Scientific	070534-22	Tubo in cloruro di polivinile, 2,29 mm
Collettore di frazioni Modello 2110	Bio-Rad	731-8120
Cuvetta UV	Hellma	170.700-QS	Cuvetta a flusso continuo al quarzo
Spettrofotometro UV	Varian	Cary50	Lettura ogni 0,0125 sec
Tutti i prodotti chimici	Qualsiasi		uso Solo per uso Grado di biologia molecolare Miscela
sali basali di Murashige e Skoog (MS)	Sigma-Aldrich	M5524
Acqua senza RNASI	Qualsiasi
piastra di Petri	Fisher Scientific	10083251
Ottilfenossi poli(etileneossi)etanolo, ramificato (Nonidet P40)	Euromedex	UN3500
Acrilammide lineare (vettore acrilico)	ThermoFischer scientific	AM9520	Vettore di precipitazione dell'RNA
OriginPro 8	Software di analisi OriginLab