Articolo metodologico

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

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DOI:

10.3791/54244

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30 giugno 2016

 , 
1Experimental Atherosclerosis Section, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

Viene presentato un protocollo per la coltura cellulare di macrofagi derivati da monociti umani differenziati da fattori stimolanti le colonie di macrofagi (M-CSF). Il protocollo utilizza la crioconservazione dei monociti accoppiata alla loro differenziazione di massa in macrofagi. Quindi i macrofagi raccolti possono essere seminati in pozzetti di coltura alle densità cellulari richieste per l'esecuzione degli esperimenti.

Abstract

Viene presentato un protocollo per la coltura cellulare di macrofagi derivati da monociti umani differenziati da fattori stimolanti le colonie di macrofagi (M-CSF). Per l'inizio degli esperimenti, i monociti freschi o congelati vengono coltivati in fiasche per 1 settimana con M-CSF per indurre la loro differenziazione in macrofagi. Quindi, i macrofagi possono essere raccolti e seminati in pozzetti di coltura alle densità cellulari richieste per l'esecuzione degli esperimenti. L'uso di un numero definito di macrofagi piuttosto che di un numero definito di monociti per avviare colture di macrofagi per esperimenti produce colture di macrofagi in cui la densità cellulare desiderata può essere raggiunta in modo più coerente. L'uso di monociti crioconservati riduce la dipendenza dalla disponibilità del donatore e produce colture di macrofagi più omogenee.

Introduzione

Lo studio dei macrofagi in coltura è un modello utile per comprendere la funzione di queste cellule nell'infiammazione come avviene nelle placche aterosclerotiche. Quando la ricerca si concentra sulle malattie umane che coinvolgono i macrofagi, è utile studiare i macrofagi umani primari piuttosto che i macrofagi non umani per evitare differenze di specie. Inoltre, gli effetti della trasformazione cellulare possono essere evitati utilizzando macrofagi primari piuttosto che linee cellulari di macrofagi. A questo scopo, i macrofagi differenziati dai monociti isolati dal sangue umano servono come mezzo per ottenere macrofagi umani primari.

I macrofagi tissutali possono essere residenti all'interno dei tessuti o possono essere derivati da monociti che migrano nel tessuto e si differenziano in macrofagi 1. Sono stati definiti due tipi di macrofagi umani derivati dai monociti che differiscono non solo per la morfologia ma anche per l'espressione genica e la funzione cellulare 2. Questi due tipi sono ottenuti da monociti che si differenziano in macrofagi in presenza di M-CSF + siero fetale bovino (FBS) e monociti che si differenziano in macrofagi in presenza di fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) + FBS 2-6. Nella nostra esperienza (osservazione non pubblicata), l'uso di siero umano piuttosto che FBS genera il tipo GM-CSF indipendentemente dal fatto che M-CSF o GM-CSF siano inclusi nel mezzo di differenziazione. I macrofagi di tipo M-CSF tendono ad essere più allungati dei macrofagi di tipo GM-CSF, che assomigliano alle uova fritte nella loro morfologia. Gli investigatori dovrebbero riconoscere che i macrofagi derivati dai monociti M-CSF e GM-CSF umani non sono gli stessi dei cosiddetti macrofagi derivati dal midollo osseo di topo M1 e M2 6.

Durante la ricerca utilizzando macrofagi differenziati M-CSF derivati da monociti umani, abbiamo riscontrato difficoltà legate alla disponibilità di monociti per avviare esperimenti e variazioni nelle densità cellulari ottenute dei macrofagi durante la differenziazione dei monociti in macrofagi. Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato il seguente protocollo in cui i monociti vengono congelati fino a quando non sono necessari per l'uso e i monociti vengono differenziati in massa in macrofagi che possono quindi essere rimossi dai flaconi di coltura e piastrati alle densità cellulari desiderate per ottenere colture più uniformi da un esperimento all'altro.

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Protocollo

Leucaferesi è stata effettuata sotto protocollo di ricerca di un soggetto umano approvato da un National Institutes of Health revisione istituzionale bordo.

1. Isolamento e Crioconservazione dei monociti

  1. Ottenere cellule mononucleate da leucaferesi di donatori umani, e arricchire monociti dal continuo controcorrente centrifugazione dilavamento delle cellule mononucleari come descritto nei riferimenti 7,8. Ottenere circa 100 x 10 6 cellule elutriated (circa 80 - 90% monociti) in tampone elutriation specificato dal costruttore. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
  2. monociti centrifuga in un tubo da 15 ml in polipropilene a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente.
  3. Rimuovere il surnatante e delicatamente risospendere le cellule in FBS seguite da dimetilsolfossido per ottenere una concentrazione finale di 90% FBS / 10% dimetilsolfossido e 50 x 10 6 cellule / ml.
  4. Aggiungere ogni ml di sospensione cellulare to un individuo esageratamente.
  5. Mettere i cryovials in un contenitore di congelamento delle cellule e trasferire ad un -80 ° C freezer per 24 ore prima del trasferimento a un serbatoio di stoccaggio esageratamente azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

2. La differenziazione dei monociti in macrofagi

  1. Scongelare un esageratamente di cellule trasferendo rapidamente a bagnomaria C 37 ° e poi subito la rimozione quando la sospensione cellulare è stato scongelato circa il 70%.
  2. Subito dopo completa scongelamento a temperatura ambiente, trasferire i 1 ml contenuti esageratamente in 50 ml di 37 ° C riscaldata Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 2 mM L-glutammina, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml interleuchina-10 (IL-10), e del 10% FBS (mezzo completo).
  3. Trasferimento 25 ml di sospensione dei monociti in ciascuno dei due 75 cm 2 palloni di plastica di coltura cellulare.
  4. Incubare culture in un 37 ° cultura incubatore di cellule C con 5% di CO 2/95% di aria per 48 ore.
  5. Sciacquare il cultures 3 volte con 10 ml di RPMI 1640 medium (pre-riscaldato a 37 ° C), rimuovere delicatamente il terreno di coltura per evitare di spostare tutte le cellule debolmente collegate.
  6. Dopo il risciacquo, aggiungere mezzo fresco completa, cambiando media ogni 2 giorni fino monociti differenziano e proliferare in misura sufficiente a diventare confluenti. Ciò richiede circa una settimana di coltura.

3. Raccolta macrofagi di avviare esperimenti

  1. Risciacquare macrofagi differenziati in boccetta 3 volte con 10 ml di pre-riscaldato soluzione salina tamponata con fosfato di 37 ° C Dulbecco senza Ca 2 + e Mg 2+ prima di aggiungere 10 ml preriscaldata acido etilendiamminotetraacetico tripsina-soluzione 37 ° C 0,25% (EDTA).
  2. Posto pallone in coltura incubatore cellulare per 10 - 15 minuti momento in cui circa il 90% dei macrofagi dovuto arrotondati e distaccato. Verificare questo esame microscopico del pallone.
  3. Aggiungere 10 ml di RMPI 1640 medium contenente il 10% FBS per stripsinizzazione superiore.
  4. Trasferire la sospensione cellulare macrofagi dal pallone in un tubo da 50 ml polipropilene, centrifugare 300 xg per 5 min, e scartare il surnatante.
  5. Risospendere delicatamente i macrofagi in 1 ml di terreno completo.
  6. Mescolare 10 ml di sospensione cellulare macrofagi con 10 microlitri soluzione Trypan Blue e determinare il numero di cellule macrofagi e vitalità (tipicamente> 95%) con un emocitometro.
  7. Sulla base del numero di celle (di solito circa 15 - 18 x 10 5 macrofagi), aggiungere ulteriore mezzo completo per ottenere la densità cellulare di semina desiderata. Nota: 1 x 10 5 macrofagi in 1,5 ml di mezzo per pozzetto di una piastra 12 pozzetti produrrà una cultura quasi confluenti.
  8. Dopo la semina, incubare macrofagi durante la notte in un 37 ° C incubatore di coltura cellulare con il 5% di CO 2/95% di aria per permettere l'adesione cellulare. Poi, iniziare gli esperimenti desiderati.

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Risultati

La vitalità dei monociti freschi o crioconservati era superiore al 95%, come determinato con Trypan Blue colorazione 9. Figura 1 e Figura 2 confronta ad ingrandimenti inferiori e superiori, rispettivamente, l'andamento di fresco e crioconservato (cioè, congelato) differenziazione dei monociti in macrofagi. Si noti che il fresco confrontato con monociti crioconservati mostrano una sottopopolazione di differenziare ...

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Discussione

Generazione di tipi definiti macrofagi può chiarire alcuni dei risultati contrastanti ottenuti dai ricercatori nello studio della biologia dei macrofagi. L'uso di varie condizioni di coltura e fattori di differenziazione per generare macrofagi umani primari possono portare a tipi molto diversi macrofagi, un fatto che non può essere apprezzata dal ricercatore. Ad esempio, i macrofagi a volte sono generate da monociti umani non usando il siero, siero umano da solo, siero umano integrato con M-CSF, FBS da solo, o FBS c...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Il Dipartimento di Medicina Trasfusionale, Centro Clinico, National Institutes of Health, ha fornito monociti elutriati. Questo lavoro è stato supportato dal Programma di ricerca intramurale, dal National Heart, Lung, and Blood Institute, dal National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra di coltura a 12 pozzetti CellbindCorning3336
CELLSTAR, matraccio T-75, coltura tissutale trattataGreiner Bio-One North America658157
terreno di coltura RPMI 1640Cellgro Mediatech15-040-CMriscaldato a 37 ° C
L-GlutamminaCellgro Mediatech25-005-CI
Siero fetale bovinoGibco16000-036
M-CSFPeproTech300-25
GM-CSFPeproTech300-03
IL-10 PeproTech200-10
DMSOSigmaD2650
Cryovial Thermo Scientific 
DPBS senza Ca2+ e Mg2+ Corning cellgro21-031-CV
0,25% tripsina-EDTA Gibco25200-056
Provetta conica in polipropilene da 50 mlFalcon352070
Trypan BlueLonza17-942E
Emocitometro a luce intensa migliorato NeubauerPaul Marienfeld GmbH & Co. KG610031http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
Congelamento cellulare CoolCell LX contenitoreBioCisionBCS-405anche altri contenitori di congelamento dovrebbero essere adeguati per questa fase
Sistema di stoccaggio dell'azoto liquido, CryoPlus 1Thermo Scientific 7400qualsiasi serbatoio di azoto liquido dovrebbe essere adeguato
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Riferimenti

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