Formazione automatizzato doppio strato lipidico della membrana Utilizzando un Polidimetilsilossano Thin Film

Sommario

Abbiamo dimostrato un, trasportabile sistema di formazione doppio strato lipidico memorizzabili. Una membrana a doppio strato lipidico possono essere formate entro 1 ora con tasso di successo superiore all'80% quando un precursore membrana congelato è portato a temperatura ambiente. Questo sistema consentirà di ridurre i processi laboriosi e competenze associate a canali ionici.

Abstract

Un doppio strato lipidico artificiale, o nero dei lipidi di membrana (BLM), è un potente strumento per lo studio dei canali ionici e le interazioni delle proteine, così come per le applicazioni di biosensori. Tuttavia, le tecniche convenzionali di formazione BLM hanno diversi svantaggi e che spesso richiedono competenze specifiche e processi laboriosi. In particolare, BLM convenzionali soffrono di bassi tassi di successo di formazione e tempo di formazione della membrana incoerente. Qui, dimostriamo un sistema di formazione BLM immagazzinabile e trasportabile con il tempo diradamento controllato e una maggiore velocità di formazione BLM sostituendo film convenzionalmente utilizzati (politetrafluoroetilene, poliossimetilene, polistirolo) di polidimetilsilossano (PDMS). In questo esperimento, viene utilizzato un polimero poroso strutturato come PDMS film sottile. Inoltre, al contrario di solventi convenzionalmente impiegati con bassa viscosità, l'uso di squalene consentito un tempo diradamento controllato tramite assorbimento lento solvente PDMS, prolungando la vita della membrana. in annunciocondizione, usando una miscela di squalene e esadecano, il punto di congelamento della soluzione lipidica è aumentata (~ 16 ° C), in aggiunta, precursori di membrana sono stati prodotti che possono essere indefinitamente immagazzinato e trasportato facilmente. Questi precursori di membrana hanno ridotto BLM tempo formazione di <1 ora e ha raggiunto un tasso di formazione BLM del ~ 80%. Inoltre, gli esperimenti dei canali ionici con gramicidina A hanno dimostrato la fattibilità del sistema a membrana.

Introduzione

Artificial doppio strato lipidico della membrana, o nero membrana lipidica (BLM), è un importante strumento per chiarire i meccanismi di membrane cellulari e canali ionici, nonché per comprendere le interazioni tra canali ionici e ioni / molecole. ^1-7 Sebbene il metodo patch-clamp è spesso considerato il gold standard per gli studi di membrana cellulare, è laborioso e richiede agli operatori altamente qualificati per le misure di canali ionici. ⁸ Mentre ricostituite artificialmente membrane doppio strato lipidico sono emersi come strumenti alternativi per gli studi dei canali ionici, ^9,10 essi sono anche associati con laboriosa processi e competenze specifiche. Inoltre, le membrane sono sensibili alle perturbazioni meccaniche. Applicazioni pratiche Quindi, tecnologie doppio strato lipidico introdotte fino ad oggi hanno limitato. ¹¹

Al fine di migliorare la robustezza e la longevità delle membrane doppio strato lipidico, Costello et al. ^12, e Ide e Yanagida ^{13 ha ideato un doppio strato lipidico free-standing supportato da idrogel. Nonostante una maggiore longevità tuttavia (<24 ore), doppio strato robustezza non è stata migliorata. Jeon et al. 14 ha ideato una membrana incapsulata idrogel (HEM) con contatto intimo doppio strato idrogel-lipidico, con conseguente maggiore longevità (fino a diversi giorni). Per aumentare ulteriormente la durata della HEM, Malmstadt e Jeon et al. Creato una membrana idrogel-incapsulato con legante idrogel-lipidico tramite in-situ covalente coniugazione (cgHEM). 15 In entrambi i sistemi, vite membrana aumentato notevolmente (> 10 giorni) . Tuttavia, i sistemi di formazione membrana non erano sufficientemente robusto, e non possono essere memorizzati o consegnati ove necessario liberare competenze per l'utilizzo dei doppi strati lipidici.}

Lo sviluppo di una piattaforma di doppio strato lipidico ha ruotato principalmente attorno aumentare la robustezza e la longevità di BLM. Anche se la longevità di BLM è stata substantially migliorata di recente, le loro applicazioni sono state limitate a causa della mancanza di trasportabilità e conservabilità. Per superare questi problemi, Jeon et al. Ha creato un sistema a membrana immagazzinabile e ha introdotto un precursore di membrana (MP). ¹⁶ Per costruire un deputato, hanno preparato una miscela di decano n- e esadecano contenente 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidilcolina) per controllare il punto di congelamento della soluzione lipidica tale che sarebbe congelare a ~ 14 ° C (sotto della temperatura ambiente, sopra la temperatura tipica frigorifero). In questo esperimento, la MP è stato suddiviso in una piccola apertura su una pellicola di politetrafluoroetilene (PTFE) e successivamente congelati in frigorifero a 4 ° C. Quando la MP è stato portato a temperatura ambiente, la MP scongelato e un doppio strato lipidico automaticamente formato, eliminando le competenze tipicamente associati con formazione della membrana. Tuttavia, il tasso di successo di BLM a base di MP era partire da ~ 27%, e formatio membranan tempo era praticamente inesistente (30 min a 24 ore), limitando le sue applicazioni pratiche.

In questo studio, un polidimetilsilossano (PDMS) a film sottile è usato al posto di un convenzionale film sottili idrofobiche (PTFE, poliossimetilene, polistirolo) a (a) tempo il controllo di produzione e (b) aumentare il tasso di successo della formazione BLM come precedentemente riportato da Ryu et al. ¹⁷ Qui, formazione della membrana è stata facilitata mediante estrazione di solventi a causa della natura porosa del PDMS, e il tempo necessario per la formazione della membrana è stata controllata con successo in questo studio. In questo sistema, come la soluzione lipidica è stata assorbita nella pellicola sottile PDMS, è stato raggiunto un tempo di formazione della membrana coerente. Inoltre, durata della membrana è stata prolungata dovuta ad un lento assorbimento dei solventi nei PDMS film sottile, un risultato dell'aggiunta di squalene alla soluzione lipidica. Abbiamo condotto misure ottiche ed elettriche per verificare che le membrane formate utilizzando questa tecnica sono adatti per isu studi canali.

Protocollo

1. Soluzione Preparazione

1. Preparazione della soluzione tampone:
   1. Per formulare soluzione tampone, sciogliere 1 M KCl (cloruro di potassio), 10 mM Tris-HCl (Tris-cloridrato), e 1 mM EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) in acqua distillata e regolare il pH a 8,0.
   2. Filtrare la soluzione con un filtro di 0.20 micron. Per sterilizzare in autoclave la soluzione a 121 ° C per 15 min.
2. Preparazione della soluzione lipidica per la pre-quadro:
   1. Per formulare la soluzione lipidica per preverniciatura, sciogliere 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidilcolina) lipidi (w: v) in una miscela di 2: 8 n decano ed esadecano (v: v). Mescolare durante la notte utilizzando un rotatore.
3. Preparazione della soluzione lipidica per la formazione della membrana:
   1. Per formulare la soluzione lipidica per la formazione della membrana, sciogliere 0,1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidilcolina) lipidi (w: v) in una miscela di 2: 8 squalene ed esadecano (v: v). Mescolare durante la notte utilizzando un rotatore.

2. Formazione di un PDMS a film sottile

1. Mescolare PDMS e il catalizzatore in un rapporto di 9: 1 (w / w) in una tazza di miscelazione per formare il prepolimero PDMS. Aggiungere 5 g di PDMS prepolimero ad una piastra di Petri per formare i PDMS pellicola sottile (spessore 200 - 250 micron). Distribuire PDMS pre-polimero usando una spalmatrice centrifuga a 800 rpm per 10 secondi per formare una pellicola sottile.
2. Porre la capsula di Petri in un essiccatore sotto vuoto ad una pressione di 100 mTorr per 2 ore per rimuovere le bolle d'aria. Per polimerizzare il film sottile prepolimero, cuocere in forno per 5 ore a 70 ° C.
3. Al fine di rendere un PDMS quadrati a film sottile, tagliare il film sottile PDMS polimerizzati in 2 x 2 cm ² piazze. Utilizzare un 500 micron micro punzone per fare un'apertura nel centro di PDMS film sottile. Aperture pre-vernice con 3% soluzione DPhPC lipidi mescolati in 2: 8 decano n- e esadecano.

3. Fabrication Camera e Assembly

1. Per realizzare la camera di BLM, disegno due blocchi simmetrici della camera utilizzando il software di disegno 3D con dimensioni esterne di 4 cm x 1,5 cm x 1 cm e dimensioni interne pozzetti di 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm ^17.
2. Craft la camera utilizzando un blocco di PTFE con una macchina CNC e seguire le istruzioni del produttore.

4. Montaggio Camera

1. Per assemblare la camera, posizionare il film sottile preverniciato-PDMS tra i due blocchi PTFE tale che l'apertura sulla PDMS film sottile è allineato con il foro nella camera.
2. Sigillare i bordi esterni della camera con un vetro di copertura con grasso (facilitando l'osservazione ottica). Immobilizzare la camera di assemblata utilizzando dadi e bulloni.
   NOTA: Assicurarsi che la camera è ben sigillato, in modo che non vi siano perdite di liquido.

5. La formazione di membrana precursore con formazione accellerata di auto-assemblaggio (MPES)

1. Usando una pipetta, depositare 0.5ml di 0,1% DPhPC lipidi mescolato 2: 8 n decano: esadecano sulla apertura della PDMS film sottile assemblato con la camera.
2. Prima dell'uso, conservare la camera in un congelatore o frigorifero di sotto 10 ° C.

6. formazione della membrana e di verifica

1. Per formare una BLM con MPES, prelevare la camera dal frigorifero e sospendere 2 ml di soluzione tampone in ciascun lato della camera. Impostare la camera da parte per <10 minuti fino a quando il precursore di membrana congelato si scioglie.
2. Posizionare la camera su un micromanipolatore per controllare con precisione l'elevazione rispetto alla sorgente luminosa e il microscopio. Illuminare un lato della camera di come fonte di luce con un alogeno a fibre ottiche illuminatore per illuminare l'apertura dei PDMS a film sottile per l'osservazione ottica del processo di formazione BLM.
3. D'altro lato, collocare un microscopio digitale verticalmente rispetto alla sorgente di luce per osservare la formazione BLM (ingrandimento da 200X).
4. Per confermare la formazione BLM, osservare il centro dell'apertura dove il colore diventa più luminoso del annulus.

7. registrazione elettrica

1. Per la misurazione elettrica, preparare elettrodi Ag / Cl con un filo d'argento 208 micron di spessore e candeggina in ipoclorito di sodio per> 1 min. Posizionare gli elettrodi Ag / Cl in ogni lato della camera abbastanza profonda da essere immersa nella soluzione tampone.
2. Collegare gli elettrodi all'amplificatore microelettrodo. Utilizzando il software elettrofisiologia, applicare una forma d'onda triangolare mV ± 10 attraverso la membrana di acquisire un'onda quadra. Impostare l'applicazione di tensione facendo clic sulle frecce indicate su V_clamp (mV).
3. Registrare le proprietà elettriche della membrana facendo clic sul pulsante di registrazione (icona rossa dot). Procedere con la registrazione fino a quando si osserva un'onda quadra uniforme. Uscire la registrazione facendo clic sull'icona quadrato nero.

8. Ion Canale incorporazione

NONE: Gramicidin A (GA) l'incorporazione avviene spontaneamente sulla formazione di BLM, come si aggiunge GA direttamente alla soluzione dei lipidi.

1. Per osservare le attività di canale ga, applicare 100 mV attraverso la membrana ad una frequenza di campionamento di 5 kHz per misurare il potenziale della membrana tenuta. Impostare l'applicazione di tensione facendo clic sulle frecce indicate su V_clamp (mV).
2. Registrare le proprietà elettriche del costituzione gA facendo clic sul pulsante di registrazione (icona rossa dot). Proseguire la registrazione fino a quando si osserva salti di corrente. Uscire la registrazione facendo clic sull'icona quadrato nero.
3. Dopo l'acquisizione dei dati elettrici, filtrare i dati con un filtro passa-basso Bessel a 100 Hz utilizzando un software di elettrofisiologia.
4. Osservare i salti di corrente nella tenuta dei dati potenziali filtrata (ogni salto corrente, ~ 0,15 ns, rappresenta dimerizzazione di un canale ionico GA) per verificare gA incorporazione.

Risultati

Ottimizzazione di MPES Soluzione Composizione
Diverse composizioni di lipidi e solventi sono stati testati con successo per ricostituire le membrane doppio strato lipidico da MPES. Il sistema MP con una miscela di decano n- ed esadecano contenente 3% DPhPC ¹⁴ mostrato un basso tasso di successo di formazione della membrana (~ 27%). Inoltre, il film PDMS estratta continuamente soluzione lipidica, era necessario ottimizzare composizione del solvent...

Discussione

La nostra tecnica di formazione BLM fornisce un potente strumento per lo studio della membrana cellulare e dei canali ionici, in contrasto con le tecniche convenzionali che hanno un potenziale limitato per l'uso industriale. Abbiamo sviluppato un precursore di membrana utilizzando un film sottile PDMS e abbiamo ideato un precursore di membrana congelato con autoassemblaggio accelerato.

A differenza dei metodi convenzionali di formazione della membrana con film idrofobici, in cui la formazione ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P9333	Per soluzione tampone
Tris-cloridrato	Sigma-Aldrich	1185-53-1	Per soluzione tampone
Acido etilendiamminotetraacetico	Sigma-Aldrich	60-00-4	Per soluzione tampone
n-decano	Sigma-Aldrich	44074-U	Per soluzione
lipidicaEsadecano	Sigma-Aldrich	544-76-3	Per soluzione lipidica
Squalene	Sigma-Aldrich	S3626	Per soluzione lipidica
Gramicidina A	Sigma-Aldrich	11029-61-1	Proteina di membrana
1,2-difitanol-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti Polar Lipids, Inc.	850356	Per la formazione di membrae
Kit elastromero Sylgard 184a e 184b	Dow Corning Asia		Per produrre PDMS film sottile
0,2 μ m filtro	Satorius stedim	16534----------K	Per filtrare la soluzione tampone
Rotator	FinePCR	AG	Per sciogliere i lipidi in modo omogeneo
Autoclave	Biofree	BF-60AC	Per sterilizzare la soluzione tampone
Spin coater	Shinu Mst	SP-60P	Per diffondere il prepolimero PDMS
Disidratatore sottovuoto	Welch	2042-22	Per rimuovere le bolle d'aria in PDMS prepolimero
500 μ m  punzone	Harris Uni-Core	0.5	Per creare un'apertura sulla macchina CNC a film sottile
	PDMS SME trading SME	2518	Per fabbricare la camera di formazione della membrana
Illuminatore alogeno a fibre ottiche	Motic	MLC-150C	Per illuminare l'apertura del film sottile PDMS per l'osservazione ottica
Microscopio digitale	blu digitale	QX-5	Per osservare otticamente la membrana a doppio strato lipidico formazione
Elettrodo	A-M Systems		Per osservare elettricamente la formazione della membrana
Amplificatore di microelettrodi (amplificatore Axopatch)	Axon Instruments	Amplificatore Axopatch 200B	Per misurare la capacità della membrana (descritto come amplificatore di microelettrodi nel manoscritto)