Abbiamo raccolto, colorato e analizzato cellule dalla congiuntiva del margine interno della palpebra di soggetti umani. Caratterizzando la morfologia cellulare e l'attività metabolica, questo metodo può migliorare la nostra comprensione dell'occhio secco e del ruolo che l'attrito tra le superfici oculari può svolgere nella percezione del disagio oculare.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Citologia ad impressione del coperchio Area Wiper
In questo articolo
Sommario
Abstract
Esistono pochi rapporti sull'anatomia cellulare dell'area del tergicristallo della palpebra interna (LW) e solo un rapporto fa uso di metodi citologici. In questo studio viene descritta l'ottimizzazione di un metodo di raccolta, colorazione e imaging di cellule dalla regione LW utilizzando la citologia da impronta (IC). Le cellule vengono raccolte dalla superficie interna della palpebra superiore di soggetti umani utilizzando membrane idrofile in politetrafluoroetilene (PTFE) e colorate con coloranti citologici per rivelare la presenza di cellule caliciformi, mucine, nuclei cellulari e vari gradi di pre- e para-cheratinizzazione. I coloranti immunocitochimici mostrano l'attività dell'esterasi cellulare e la compromissione delle membrane cellulari mediante l'uso di un microscopio laser a scansione confocale. Per ogni campione vengono acquisite fino a 100 immagini digitali microscopiche e unite in un'immagine ad alta risoluzione su larga scala dell'intero intervallo IC. Dimostriamo una maggiore sensibilità dell'IC rispetto a quanto riportato in precedenza, appropriata per identificare le morfologie cellulari e l'attività metabolica nell'area LW. Per quanto ne sappiamo, questa è la prima volta che questa selezione di coloranti fluorescenti è stata utilizzata per l'imaging delle membrane IC LW. Questo protocollo sarà efficace negli studi futuri per rivelare dettagli non documentati dell'area LW, come la valutazione delle particolarità cellulari dei portatori di lenti a contatto o dei pazienti con occhio secco o epiteliopatia dei tergicristalli.
Introduzione
La palpebra superiore umano esegue circa 10.000 lampeggia ogni giorno 1, con appena un 1 - regione congiuntivale due millimetri stretta opposti del globo oculare. Grazie al suo moto di pulitura durante il lampeggio, questa porzione del margine coperchio è stata definita la regione "coperchio tergicristallo" 2. Si presume che l'attrito aumenta in questa regione durante lampeggiamento abituale, grazie al coperchio pulire il mondo. Questo può svolgere un ruolo significativo in termini di comfort oculare. Di lenti a contatto, in particolare, l'esperienza disagio oculare e questo è uno dei motivi principali per cessare l'obiettivo di usura 3. Quando una lente a contatto è posto sugli occhi, il coefficiente di attrito tra il materiale della lente e la superficie oculare ha dimostrato di cambiare 4. Ci sono prove che suggeriscono che i sintomi di secchezza potrebbero essere correlati a questo attrito alterato 2,5,6.
Questa associazione può anche tradursi in fenomeni osservabili clinicamente, in particolare coperchio wiper epiteliopatia (LWE), chiamato anche palpebra superiore margine di colorazione (ULMs) 6. LWE è un segno precoce di irritazione oculare e un potenziale fattore predittivo per la malattia dell'occhio secco. Si è osservato e misurato dalla colorazione vitale delle regioni margine coperchio superiore e inferiore. Anche se questo sistema di classificazione 2 e la sua validità clinica (ad esempio, la correlazione con i sintomi soggettivi) sono ancora in discussione, fastidio oculare rimane un enigma per i medici e gli scienziati allo stesso modo e, soprattutto, un inconveniente per i pazienti.
Ad oggi, poco si sa circa le variazioni clinicamente rilevanti nel (sotto) l'anatomia e la fisiologia cellulare del coperchio zona tergicristallo 7 e un solo rapporto fa uso di metodi citologici 8. Citologia ad impressione (IC) è stato impiegato per più di 40 anni per raccogliere le cellule dalla superficie epiteliale del bulbare o congiuntiva tarsale mediante l'applicazione di una membrana 9,10. Dopo la rimozione, le cellule aderenti subiscono ccolorazione ytological e di imaging microscopico. A causa delle differenze anatomiche e cellulari della regione tergicristallo coperchio, questa tecnica richiede l'ottimizzazione.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Etica dichiarazione: prima di raccogliere le cellule da soggetti umani, consenso informato e l'approvazione etica deve essere ottenuto.
1. Preparare Stain
NOTA: Preparare macchia il giorno dell'esperimento.
- Aggiungere 5 ml di etidio (o 4 micron) e 5 ml calceina AM (o 4 micron) a 2,5 ml di tampone fosfato salino (PBS) in 15 ml provetta da centrifuga; mescolare. Avvolgere in un foglio di alluminio per proteggere dalla luce e conservare a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.
2. Le cellule Raccogliere
- Rimuovere gli inserti colture cellulari dalla loro confezione e un'etichetta per ogni palpebra da campionare. Mark orientamento della raccolta delle cellule sul lato del supporto in plastica a membrana usando pennarello indelebile. Comportamento fessura ispezione lampada con ingrandimento moderata (circa 20X) per confermare appropriata la salute della regione a subire IC.
- Erogare una goccia di anestetico topico (0,5% proparacaina cloridrato) nel sacco congiuntivale inferiore each occhio e istruire partecipante di tenere gli occhi chiusi per un minuto.
- Evert superiore palpebra e tenere in posizione dalle ciglia; evitare il contatto con l'area coperchio tergicristallo.
Optional: l'aiuto di un investigatore secondaria può essere richiesto di eseguire questo passaggio. - Applicare membrana perpendicolarmente sulla parte centrale della regione tergicristallo coperchio con pressione minima.
- Tenere membrana in posizione per 3-5 secondi. Osservare la membrana diventare trasparente nella zona di contatto. A questo punto, rimuovere delicatamente la membrana e permettere il coperchio del partecipante a "flip" al suo posto.
- applicare prontamente una goccia di PBS al campione, per evitare che si secchi. Membrane diventerà traslucida e non deve girare opaco in qualsiasi momento, come indica essiccazione. Avere l'investigatore secondaria a procedere immediatamente con l'elaborazione di campioni (sezione 3).
- Condurre controllo occhio finale per garantire l'integrità della congiuntiva. Dispensare lubrificanti oculari e istruire partecipanteper evitare di strofinare gli occhi fino a effetto anestetico svanisce (circa 15 min.).
Processing 3. Campione
- Utilizzando micro-forbici, tagliare la membrana a metà (la metà per ciascuna delle analisi a valle), perpendicolarmente attraverso il centro della raccolta delle cellule. Tagliare lungo il margine esterno di una metà membrana per separarlo dal supporto di plastica; evitare l'interazione con le cellule raccolte sulla membrana, tra cui quella che la membrana non si piega su se stesso.
- Fissare la membrana con una pinzetta prima completamente staccando dal titolare. Posizionare la membrana in etichetta provetta 2 ml contenente 500 ml di 95% (v / v) di etanolo e lasciare a fissare per un minimo di 20 minuti ad un massimo di 2 ore prima della trasformazione (paragrafo 4.2).
- Immediatamente separata seconda metà di membrana (come descritto nella sezione 3.2) e prontamente procedere con la sezione 4.1.
La colorazione 4. Campione
- Immunocytochemical colorazione
- Posizionare con cura la membrana su 35 mm fondo piatto cultura di vetro con il lato rivolto verso il basso di raccolta; garantire membrana è piatta.
- Pipettare 20 ml di composizione macchia immunocitochimica assemblato nella sezione 1 a membrana. Se riccioli campione, usare puntali monouso per appiattire con attenzione la membrana spingendo i bordi verso il basso. Evitare il contatto con le zone di raccolta delle cellule.
- coprire delicatamente la membrana con copertura in vetro antiscivolo. Evitare movimenti inutili di campione. Coprire con coperchio e sigillare con lab-pellicola intorno ai bordi. Non ostruire la trasparenza di piatto (in alto e in basso) e la visibilità del campione. Etichetta con pennarello laboratorio.
- Immediatamente procedere con l'imaging (paragrafo 5.1), poi tornare alla sezione 4.2 per continuare con colorazione citologica dell'altra metà della membrana.
- citologico colorazione
- Gradualmente idratare membrana aggiungendo lentamente 500 ml di acqua distillata al tubo used per la fissazione nella sezione 3.4. Aspirare il contenuto più volte in punta della pipetta per mescolare, quindi rimuovere il contenuto.
- Aggiungere 500 ml di acqua distillata. Lasciate riposare per qualche secondo, quindi rimuovere. Aggiungere 500 ml di alcian blu e lasciar riposare per 3 min. Rimuovere macchie ed eseguire 3 consecutivi acqua distillata 500 microlitri risciacqui o fino a quando il liquido risciacqua chiaro.
- Aggiungere 500 ml di Hematoxylin # 1 macchia e lasciare per 3 min. Rimuovere macchie e di eseguire tre consecutivi 500 microlitri risciacqui acqua distillata o fino a quando il liquido risciacqua chiaro. Disidratare (inverso del paragrafo 4.2.1) aspirando il liquido chiaro.
- Aggiungere 500 ml di Papanicolaou OG 6-macchia e lasciare per 3 min. Rimuovere macchie ed eseguire una 500 microlitri 95% (v / v) etanolo risciacquo.
- Aggiungere 500 ml di Papanicolaou EA-65 macchia e lasciare per 3 min. Rimuovere macchia ed eseguire 3 consecutivi 500 microlitri 95% (v / v) di etanolo risciacqua.
- Completamente disidratano utilizzando tre consecutivi 500 microlitri 100% risciacqui etanolo. utilizzando tweEzers, rimuovere il campione dalla soluzione; evitare le zone di raccolta delle cellule commoventi.
- Posizionare la membrana sul vetrino; assicurare che la linea di raccolta delle cellule è parallelo o perpendicolare scorrere margine per facilitare l'allineamento durante l'imaging.
- Applicare una goccia di 100% di etanolo e coprire con slip in vetro. Immediatamente procedere con l'imaging (paragrafo 5.2).
Imaging 5. Campione
- Imaging fluorescenti immunocitochimiche Macchie
- Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser (CLSM) 11 o microscopio a fluorescenza 12, dotato di una fotocamera digitale a colori, collegato a un computer che esegue un software di acquisizione delle immagini. Grazie ai campioni essendo contenuto all'interno piastre di coltura, un microscopio invertito può essere necessario.
- Impostare microscopio 11,12 secondo assorbimento ed emissione spettri di etidio omodimero-1 (528/617 nm maxima Ex / Em in presenza di DNA) e calceina AM (494/517 nm Ex / Em maxima).
- Selezionare l'ingrandimento più basso del microscopio (ad esempio, oggettiva 2.5X) e attivare il sistema di imaging digitale; osservare il campione visualizzata sul monitor del computer.
- Controllare campione per le caratteristiche cellulari di interesse.
- Selezionare l'ingrandimento del microscopio desiderato e di acquisire le immagini utilizzando il software di imaging.
- Salvare i file sia in formato di file microscopio nativo o un formato di file non compresso (ad esempio, * .raw, * .tiff).
- Imaging citologico Macchie
- Utilizzare un microscopio standard di laboratorio in campo chiaro senza filtri, dotato di una fotocamera digitale a colori, collegato a un computer che esegue un software di acquisizione delle immagini.
- Luogo e vetrino di blocco (dal punto 4.2.8) sul palco microscopio. Reidratare campione con 100% di etanolo come necessario, durante l'intera procedura di imaging.
- Selezionare l'ingrandimento più basso del microscopio (ad esempio, oggettiva 2.5X) e attivare °sistema di imaging digitale e; osservare il campione visualizzata sul monitor del computer.
- raccolta delle cellule Garantire è allineato con entrambi gli assi X o Y del controllo palco microscopio. Regolare, se necessario, rimuovendo il vetrino e ruotando il campione con un puntale o di una pinzetta.
- Utilizzando il software di imaging, cattura di immagini (s) dell'intero campione con il più basso di ingrandimento del microscopio.
- Passare a un ingrandimento al microscopio moderata (ad esempio, 10 - 20X obiettivo) e regolare fonte di luce microscopio e parametri di imaging software (esposizione, contrasto, bilanciamento del bianco, ecc), e disabilitare il controllo del software automatizzato. Salvare queste impostazioni per un utilizzo futuro.
- Determinare inizio e fine i punti di scansione (ad esempio, in alto a sinistra e angoli basso a destra della raccolta delle cellule).
- Utilizzando il software di imaging, cattura di immagini (s) di tutta l'area di raccolta delle cellule all'interno dei punti iniziale e finale. Garantire un 20% side-to-side e top-to-bottom sovrapposizione between tutte le immagini adiacenti.
- Salvare i file utilizzando il formato di file nativo del microscopio o un formato di file non compresso (ad esempio, * .raw, * .tiff).
- Genera immagine panoramica finale utilizzando software automatici di cucitura di scelta (ad esempio, Adobe Photoshop Elements). Utilizzare immagini di riferimento prese a passo 5.2.5) per confermare l'accuratezza delle cuciture automatizzata nell'immagine finale.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La membrana coltura cellulare attraversato tutto il supporto di plastica è un comodo strumento per la raccolta portatile delle cellule epiteliali della congiuntiva coperchio tergicristallo. Questo metodo elimina la necessità di strumenti sterilizzati supplementari tipicamente usati per preparare e gestire membrane IC. Figura 1 illustra la IC dell'area tergicristallo coperchio usando un inserto di coltura cellulare. Abbiamo ottimizzato due diversi protocolli di colora...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Citologia ad impressione viene in genere eseguita sulla congiuntiva bulbare, utilizzando cellulosa misto membrane estere. I campioni sono tagliati a misura da fogli di materiale alla rinfusa, sterilizzati, applicati e rimossi dalla superficie congiuntivale con pinze. Utilizzando lo stesso materiale della membrana, un dispositivo IC pistone controllato è stato recentemente progettato per abbinare la geometria della superficie della congiuntiva bulbare, e mantenere la pressione costante tra le applicazioni 13. ...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno finanziamenti rilevanti o conflitti da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il nostro collega Dr. Jalaiah Varikooty che ha fornito informazioni e competenze sul tema del tergicristallo del coperchio, che ha aiutato notevolmente questa ricerca.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Blu di Alciano, 1% in 3% di acido acetico | Sigma | B8438-250ML | |
| Ematossilina, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Colorazione di Papanicolaou, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Colorazione di Papanicolaou, EA | Sigma modificato | HT40232-1L | |
| Kit di vitalità/citotossicità vivo/morto | Life Technologies | L-3224 | contiene etidio omodimero-1 e coloranti Calceina AM |
| Alcaine (0,5% proparacaina cloridrato) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, PTFE idrofilo, 0,4 µ m | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Piatti con fondo in vetro da 35 mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Riferimenti
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. Confocal microscopy. , Academic Press. London. 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
