Abbiamo raccolto, colorato e analizzato cellule dalla congiuntiva del margine interno della palpebra di soggetti umani. Caratterizzando la morfologia cellulare e l'attività metabolica, questo metodo può migliorare la nostra comprensione dell'occhio secco e del ruolo che l'attrito tra le superfici oculari può svolgere nella percezione del disagio oculare.
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Articolo metodologico
Citologia ad impressione del coperchio Area Wiper
In questo articolo
Sommario
Abstract
Esistono pochi rapporti sull'anatomia cellulare dell'area del tergicristallo della palpebra interna (LW) e solo un rapporto fa uso di metodi citologici. In questo studio viene descritta l'ottimizzazione di un metodo di raccolta, colorazione e imaging di cellule dalla regione LW utilizzando la citologia da impronta (IC). Le cellule vengono raccolte dalla superficie interna della palpebra superiore di soggetti umani utilizzando membrane idrofile in politetrafluoroetilene (PTFE) e colorate con coloranti citologici per rivelare la presenza di cellule caliciformi, mucine, nuclei cellulari e vari gradi di pre- e para-cheratinizzazione. I coloranti immunocitochimici mostrano l'attività dell'esterasi cellulare e la compromissione delle membrane cellulari mediante l'uso di un microscopio laser a scansione confocale. Per ogni campione vengono acquisite fino a 100 immagini digitali microscopiche e unite in un'immagine ad alta risoluzione su larga scala dell'intero intervallo IC. Dimostriamo una maggiore sensibilità dell'IC rispetto a quanto riportato in precedenza, appropriata per identificare le morfologie cellulari e l'attività metabolica nell'area LW. Per quanto ne sappiamo, questa è la prima volta che questa selezione di coloranti fluorescenti è stata utilizzata per l'imaging delle membrane IC LW. Questo protocollo sarà efficace negli studi futuri per rivelare dettagli non documentati dell'area LW, come la valutazione delle particolarità cellulari dei portatori di lenti a contatto o dei pazienti con occhio secco o epiteliopatia dei tergicristalli.
Introduzione
La palpebra superiore umano esegue circa 10.000 lampeggia ogni giorno 1, con appena un 1 - regione congiuntivale due millimetri stretta opposti del globo oculare. Grazie al suo moto di pulitura durante il lampeggio, questa porzione del margine coperchio è stata definita la regione "coperchio tergicristallo" 2. Si presume che l'attrito aumenta in questa regione durante lampeggiamento abituale, grazie al coperchio pulire il mondo. Questo può svolgere un ruolo significativo in termini di comfort oculare. Di lenti a contatto, in particolare, l'esperienza disagio oculare e questo è uno dei motivi principali per cessare l'obiettivo di usur....
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Protocollo
Etica dichiarazione: prima di raccogliere le cellule da soggetti umani, consenso informato e l'approvazione etica deve essere ottenuto.
1. Preparare Stain
NOTA: Preparare macchia il giorno dell'esperimento.
- Aggiungere 5 ml di etidio (o 4 micron) e 5 ml calceina AM (o 4 micron) a 2,5 ml di tampone fosfato salino (PBS) in 15 ml provetta da centrifuga; mescolare. Avvolgere in un foglio di alluminio per proteggere dalla luce e conservare a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.
2. Le cellule Raccogliere
- Rimuovere gli inserti colture cellu....
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Risultati
La membrana coltura cellulare attraversato tutto il supporto di plastica è un comodo strumento per la raccolta portatile delle cellule epiteliali della congiuntiva coperchio tergicristallo. Questo metodo elimina la necessità di strumenti sterilizzati supplementari tipicamente usati per preparare e gestire membrane IC. Figura 1 illustra la IC dell'area tergicristallo coperchio usando un inserto di coltura cellulare. Abbiamo ottimizzato due diversi protocolli di colora.......
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Discussione
Citologia ad impressione viene in genere eseguita sulla congiuntiva bulbare, utilizzando cellulosa misto membrane estere. I campioni sono tagliati a misura da fogli di materiale alla rinfusa, sterilizzati, applicati e rimossi dalla superficie congiuntivale con pinze. Utilizzando lo stesso materiale della membrana, un dispositivo IC pistone controllato è stato recentemente progettato per abbinare la geometria della superficie della congiuntiva bulbare, e mantenere la pressione costante tra le applicazioni 13. .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno finanziamenti rilevanti o conflitti da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il nostro collega Dr. Jalaiah Varikooty che ha fornito informazioni e competenze sul tema del tergicristallo del coperchio, che ha aiutato notevolmente questa ricerca.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Blu di Alciano, 1% in 3% di acido acetico | Sigma | B8438-250ML | |
| Ematossilina, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Colorazione di Papanicolaou, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Colorazione di Papanicolaou, EA | Sigma modificato | HT40232-1L | |
| Kit di vitalità/citotossicità vivo/morto | Life Technologies | L-3224 | contiene etidio omodimero-1 e coloranti Calceina AM |
| Alcaine (0,5% proparacaina cloridrato) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, PTFE idrofilo, 0,4 µ m | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Piatti con fondo in vetro da 35 mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Riferimenti
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
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Ristampe e permessi
