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Articolo metodologico

Misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività Burst nel sangue umano

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DOI:

10.3791/54264

⸱

12 settembre 2016

 ,  ,  ,  , 
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

In questo articolo

Sommario

Lo scopo di questo manoscritto è quello di presentare un metodo per misurare la fagocitosi di monociti e granulociti e l'attività di scoppio ossidativo in campioni di sangue umano.

Abstract

Il test di fagocitosi dei granulociti e dei monociti e dell'attività di scoppio ossidativo (OB) può essere utilizzato per studiare il sistema immunitario innato. Questo manoscritto fornisce la metodologia necessaria per aggiungere questo test a un arsenale di immunologia dell'esercizio. Il primo passo di questo test consiste nel preparare due aliquote ("H" e "F") di sangue intero (eparina). Quindi, il diidroetidio viene aggiunto all'aliquota H ed entrambe le aliquote vengono incubate in un bagno di acqua calda seguito da un bagno di acqua fredda. Successivamente, lo Staphylococcus aureus (S. aureus) viene aggiunto all'aliquota H e S. aureus marcato con isotiocianato di fluoresceina viene aggiunto all'aliquota F (batteri:fagocita = 8:1), ed entrambe le aliquote vengono incubate in un bagno di acqua calda seguito da un bagno di acqua fredda. Quindi, il blu di tripano viene aggiunto a ciascuna aliquota per estinguere la fluorescenza extracellulare e le cellule vengono lavate con soluzione salina tamponata con fosfato. Successivamente, i globuli rossi vengono lisati e i globuli bianchi vengono fissati. Infine, un citometro a flusso e un software di analisi appropriato vengono utilizzati per misurare la fagocitosi di granulociti e monociti e l'attività OB. Questo test è stato utilizzato per oltre 20 anni. Dopo uno sforzo pesante e prolungato, gli atleti sperimentano un aumento significativo ma transitorio della fagocitosi e una diminuzione prolungata dell'attività ostetrica. L'aumento della fagocitosi post-esercizio è correlato all'infiammazione. A differenza degli individui normopeso, la fagocitosi dei granulociti e dei monociti è cronicamente elevata nei partecipanti in sovrappeso e obesi ed è modestamente correlata con la proteina C-reattiva. In sintesi, questo test basato sulla citometria a flusso misura la fagocitosi e l'attività ostetrica dei fagociti e può essere utilizzato come misura aggiuntiva dell'infiammazione indotta dall'esercizio fisico e dall'obesità.

Introduzione

Il granulociti e monociti fagocitosi / burst ossidativo (OB) saggio di attività è una tecnica semplice, straight-forward che viene spesso utilizzato per raccogliere informazioni sui innato funzione immunitaria dopo l'attività fisica intensa e prolungata. 1-4 Quando si studia la risposta del sistema immunitario a uno stimolo, granulociti e monociti sono di particolare interesse perché giocano un ruolo centrale nella difesa ospite e sono le prime cellule immunitarie per accumulare nel sito di infezione. 5 neutrofili, un tipo di granulociti, sono le prime cellule di traslocare nel muscolo danneggiato tessuto dopo l'attività fisica intensa. 6 fagocitosi e l'attività OB sono le misure più comuni di granulociti e monociti funzione, 7 e sono preferiti come indicatori di funzione delle cellule immunitarie innate a causa del loro ruolo centrale sia nel processo di infezione e il processo di riparazione.

Il test descritto in questo Utili manoscrittozes un flusso base citometro a fornire una determinazione quantitativa di granulociti e monociti fagocitosi e l'attività OB nel sangue intero. L'uso di sangue intero in questa tecnica è vantaggiosa perché permette il test da condurre senza una procedura di purificazione tempo. Questo test può essere facilmente modificato per accogliere una varietà di disegni di ricerca e capacità di laboratorio. Ad esempio, Liao et al. Utilizzato una tecnica simile a dimostrare che l'attività dei neutrofili OB è aumentata e neutrofili fagocitosi è diminuita in seguito a lesione cerebrale traumatica. 8 In un altro esempio, McFarlin et al. Descrive un elegante modifica di questa tecnica che utilizza allophycocyanin (APC ) coniugata CD66b e ad alte prestazioni in tandem APC-coniugato etichettatura CD45 con image-based citometria a flusso per classificare i granulociti in termini di attività di fagocitosi e OB. 7,9

Il nostro gruppo di ricerca ha utilizzato vari adattamenti di questo TEchnique come un indicatore della funzione immunitaria innata nelle popolazioni in sovrappeso, obesi, e atletiche per quasi 20 anni. 10,11 Il testo qui di seguito vi fornire al lettore con le istruzioni passo-passo per l'esecuzione di questo test ed evidenziare le aree che il lettore può adattare per soddisfare le esigenze della loro ricerca.

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Protocollo

NOTA: Tutte le procedure di raccolta del sangue sono state condotte in conformità con le linee guida stabilite dalla Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB).

1. Preparazione Assay

  1. Raccogliere, preparare e organizzare i materiali specificati per la procedura (si prega di fare riferimento alla tabella di specifici materiali / attrezzature).
    1. Etichettare tubi 12 x 75 mm.
      1. Etichetta due tubi per ogni partecipante: un tubo per il saggio fagocitosi (etichettare questo tubo con inchiostro nero e una "F" per isotiocianato di fluorescina [FITC]) e un tubo per il saggio di attività OB (etichettare questo tubo con inchiostro rosso e una " H "per dihydroethidium [HE]).
        NOTA: L'uso di provette sterili 12 x 75 mm si consiglia di ridurre al minimo l'attivazione cellulare non intenzionale e associato aumento del rumore di fondo.
      2. Etichetta tre tubi per i controlli di analisi: un tubo per il saggio di fagocitosi (controllo FITC: etichettare questo tubo con black inchiostro e una "F"), un tubo per il saggio di attività OB (HE controllo: etichettare questo tubo con inchiostro rosso e una "H"), e una provetta per il controllo negativo (Blood solo: etichettare questo tubo con inchiostro verde e "solo sangue").
    2. Preparare soluzioni di almeno un giorno prima del giorno del test.
      1. Preparare la soluzione salina sterile tampone fosfato (PBS). Diluire 100 ml di PBS 10x con 900 ml di 18,2 MW H 2 O. Filtro sterilizzare con un filtro da 0,2 micron. Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
      2. Preparare la PBS sterile-glucosio. Sciogliere 1.0 g di glucosio in 100 ml di PBS. Filtro sterilizzare con un filtro da 0,2 micron. Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
      3. Preparare il tampone 0,1 M citrato sterile. Sciogliere 1.2 g di acido citrico e 1,1 g di citrato di sodio in 100 ml di 18,2 MW H 2 O. Regolare il pH a 4,0. Filtro sterilizzare con un filtro da 0,2 micron. Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
      4. Preparare la soluzione madre HE. Resuspend 1,0 mg di HE in 1,0 ml di dimetilsolfossido (DMSO). Mescolare delicatamente, aliquota, e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
      5. Preparare la coniugati con fluoresceina Staphylococcus aureus (S. aureus) stock soluzione (2 x 10 9 particelle / ml). Risospendere 10 mg di FITC-marcato S. aureus in 1,5 ml (o quantità appropriata) di PBS. Dividere in tre aliquote di 500 microlitri e ultrasuoni in base alle raccomandazioni del produttore. Aliquotare e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
      6. Preparare il senza etichetta S. soluzione madre aureus (2 x 10 9 particelle / ml). Risospendere 100 mg di senza etichetta S. aureus in 15 ml (o quantità appropriata) di PBS. Dividere in una trentina di 500 aliquote microlitri e ultrasuoni in base alle raccomandazioni del produttore. Aliquotare e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
    3. Preparare soluzioni di lavoro fresco il giorno del test.
      1. Preparare la soluzione di lavoro HE. Trasferire 10 ml diSoluzione scongelati HE a 990 ml di PBS-glucosio. Esporre alla luce e tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
      2. Preparare la S. coniugati con fluoresceina Soluzione di lavoro aureus (133,333 particelle / ml). Trasferire 70 ml di scongelato coniugati con fluoresceina S. Soluzione aureus a 980 ml ​​di PBS. Esporre alla luce e tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
      3. Preparare il senza etichetta S. Soluzione di lavoro aureus (133,333 particelle / ml). Trasferimento 70 ml di scongelato senza etichetta S. Soluzione aureus a 980 ml ​​di PBS. Esporre alla luce e tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
      4. Preparare la soluzione di raffreddamento. Aggiungere 750 ml di 0,4% trypan soluzione blu a 11,25 ml di sterile tampone 0,1 M citrato. Mantenere in un bagno di ghiaccio-acqua fino al momento dell'uso.
    4. Avere un flebotomo certificato prelevare il sangue secondo le linee guida dell'Organizzazione Mondiale della Sanità per un prelievo di sangue.
      1. Disegnare il sangue in un 4 ml di tubo di raccolta sangue contenente K 2 EDTA. Intubo vert raccolta del sangue secondo le istruzioni del produttore. Mantenere tubo di raccolta di sangue a temperatura ambiente su un agitatore meccanico banco fino al momento dell'uso. Utilizzare questo sangue per la completa emocromo (CBC) con l'analisi dei globuli bianchi (WBC) differenziale descritto al punto 1.2.1.
      2. Disegnare il sangue in provetta di raccolta un 4 ml di sangue contenente litio eparina. Capovolgere tubo di raccolta sangue secondo le istruzioni del produttore. Mantenere tubo di raccolta del sangue a temperatura ambiente su una sedia a dondolo da banco fino al momento dell'uso. Utilizzare questo sangue per il dosaggio dei monociti e granulociti fagocitosi e l'attività OB descritto al punto 2.
  2. Determinare la quantità di batteri (cioè, S. aureus) che sarà necessario per completare il saggio per ogni campione.
    1. Utilizzare un analizzatore ematologico per eseguire CBC con differenziale analisi WBC sul sangue come descritto nelle istruzioni del produttore. Prendere nota della conta leucocitaria (in cellule / ml),% neutrofili e%valori monociti.
    2. Utilizzare le equazioni di seguito per determinare le conta dei neutrofili e monociti per ogni campione.
      Conta dei neutrofili (in cellule / ml) =% × neutrofili WBC (in cellule / ml)
      Conteggio dei monociti (in cellule / ml) =% monociti × WBC (in cellule / ml)
    3. Utilizzare le equazioni di seguito per determinare il conteggio fagociti per ciascun campione e il numero dei fagociti presenti in 100 microlitri di campione.
      Count fagocita (in cellule / ml) = conta dei neutrofili (in cellule / ml) + conteggio dei monociti (in cellule / ml)
      Numero dei fagociti in 100 microlitri = (count Fagocita (in cellule / ml)) / 10
    4. Usare l'equazione seguente per determinare il numero di batteri (cioè, S. aureus) necessari per ciascun campione e la quantità di FITC-marcato S. aureus o senza etichetta S. soluzione aureus di lavoro (133,333 particelle / ml) che dovrebbe essere aggiunto ad ogni provetta.
      NOTA: I batteri bersaglio: il rapporto dei fagociti è di 8: 1.
      Numero di batteri necessaria =Numero dei fagociti in 100 ml × 8
      Volume di soluzione di lavoro FITC o senza etichetta necessario (in ml) = (numero di batteri necessari) / (133,333 particelle / ml)

2. Eseguire Assay

  1. Preparare sangue intero per il saggio.
    1. Per ogni provetta partecipante e controllo, utilizzare un puntale esteso lunghezza per trasferire 100 ml di sangue intero dalla provetta di raccolta del sangue litio eparina al fondo di una provetta 12 x 75 mm. Rimettere i tappi.
      NOTA: Fare attenzione per evitare di ottenere il sangue ai lati dei tubi 12 x 75 mm.
    2. Utilizzare una micropipetta di aggiungere 10 ml di soluzione HE ai tubi etichettati con inchiostro rosso e una "H", compresa la provetta di controllo HE lavorare. Rimettere i tappi e brevemente vortice.
    3. Incubare tutte le provette in un bagno d'acqua a 37 ° C per 15 min. Poi, trasferire immediatamente tutte le provette per un bagno di ghiaccio-acqua per 12 min.
      NOTA: utilizzare un rack metallo apertoe agitare delicatamente la rastrelliera ogni 5 minuti per assicurare che i tubi sono rapidamente e adeguatamente riscaldati o refrigerati.
  2. Aggiungere batteri (cioè, S. aureus) per le provette dei campioni e di controllo.
    1. Utilizzare una micropipetta per aggiungere la giusta quantità (calcolato al punto 1.2.4) di S. senza etichetta soluzione di lavoro aureus ai tubi etichettati con inchiostro rosso e una "H", compresa la provetta di controllo HE. Rimettere i tappi e brevemente vortice.
    2. Utilizzare una micropipetta per aggiungere la giusta quantità (calcolato al punto 1.2.4) del marcato con FITC S. soluzione di lavoro aureus ai tubi etichettati con inchiostro nero e una "F", compresa la provetta di controllo FITC. Rimettere i tappi e brevemente vortice.
    3. Vortex il "sangue solo" provetta di controllo, ma non aggiungere entrambi i tipi di batteri (ad esempio, S. aureus) ad esso.
    4. Incubare tutte le provette in un bagno d'acqua a 37 ° C per 20 min. Utilizzare un rack metallo aperto e scuotere delicatamente la rastrelliera ogni 5 minutiper assicurare che i tubi sono rapidamente e adeguatamente riscaldati. Dopo il periodo di incubazione, trasferire immediatamente tutte le provette per un bagno di ghiaccio-acqua per 1 min.
  3. Lavare le cellule.
    1. Utilizzare una pipetta ripetitore per aggiungere 100 ml di soluzione di tempra ghiacciata a tutte le provette. Rimettere i tappi, vortex brevemente, e poi incubare tutte le provette in ghiaccio per 1 min.
    2. Utilizzare una pipetta ripetitore di aggiungere 1 ml di PBS ghiacciato a tutte le provette. Vortex brevemente, e quindi aggiungere un ulteriore 2 ml di PBS ghiacciato a tutte le provette e sostituire tappi. Centrifugare tutte le provette per 5 minuti a 4 ° C e 270 xg, e quindi aspirare il surnatante.
    3. Ripetere il punto 2.3.2 una sola volta (per un totale di 2 lavaggi).
  4. Preparare i campioni per citometria a flusso.
    1. Utilizzare una pipetta ripetitore di aggiungere 50 ml di siero fetale bovino ghiacciata a tutte le provette. In breve vortice tutte le provette.
    2. Trasferire tutte le provette ad una giostra appropriata e utilizzare una stazione di lavoro di preparazione Lyse cella automatizzata con il rosso del sangue cell (RBC) lisi e WBC fissare i reagenti per la lisi dei globuli rossi e fissare i globuli bianchi come descritto nelle istruzioni del produttore.
    3. Dopo la Lyse cellule corsa automatizzata workstation preparazione è stata completata, avvolgere i tubi in un foglio di alluminio e conservare in frigorifero a 4 ° C fino a quando la citometria a flusso analisi può essere effettuata.

3. Citometria a Flusso di acquisizione

  1. Imposta il sistema di citometria a flusso.
    1. Riscaldare la citometria a flusso sistema come indicato nel manuale utente fornito dal produttore. Quindi, controllare i livelli del reagente e del serbatoio rifiuti. Se necessario, riempire i serbatoi di reagenti e / o svuotare il serbatoio di scarico.
    2. Utilizzare la funzione "Clean Panel" per eseguire il sistema ciclo di pulizia. Poi, eseguire le fluorosfere di allineamento e fluidica verifica, e assicurarsi che il coefficiente mezzo di picco di variazione (HPCV) per ogni rivelatore è compreso nell'intervallo predefinito descritto nel controllo di qualità (QC) protocolli forniti dal produttorer.
  2. Creare acquisizione specifico per il dosaggio e protocolli di impostazione dello strumento.
    1. Creare protocolli di acquisizione specifiche del dosaggio per i saggi di fagocitosi e di attività OB.
      NOTA: I protocolli di acquisizione qui descritti possono essere adattati per l'uso su qualsiasi citofluorimetro con un laser blu (488 nm), un filtro (530/30) per FITC, e un filtro (575/26) per HE.
      1. Aprire la citometria a flusso software di acquisizione del sistema e creare un "nuovo protocollo".
      2. Scegliere il "FL1 Parameter" per il saggio fagocitosi (FITC) e il "FL2 Parameter" per il saggio di attività OB (HE).
      3. Creare le trame (vale a dire, scatter in avanti [FSC] vs. lato scatter [SSC] dot plot, FL1 istogramma, FL2 istogramma) richiesto per l'acquisizione.
      4. Creare regioni poligonali per il WBC (globuli bianchi), dei granulociti e monociti popolazioni sulla trama SSC FSC e creare e regioni lineari sugli istogrammi FL1 e FL2. Impostare un & #34; Arresto Conte "di 50.000 eventi per il cancello WBC.
      5. Salvare i protocolli con nomi specifici test.
    2. Creare protocolli impostazione degli strumenti specifici del dosaggio per i saggi di fagocitosi e di attività OB.
      1. Trascinare i "protocolli specifici test di acquisizione" (definiti al punto 3.2.1) dal "Esplora risorse" al "Acquisition Manager" sulla citometria a flusso software di acquisizione del sistema.
        NOTA: Informazioni aggiunte in questo modo apparirà sempre alla fine della lista di lavoro.
      2. Inserire le informazioni campione nella lista di lavoro, e salvare la lista di lavoro.
      3. Rimuovere le provette dei campioni di controllo dal frigorifero 4 ° C e consentire loro di equilibrare a temperatura ambiente per 15 min. Poi, Vortice brevemente ogni provetta campione di controllo.
      4. Utilizzare i "protocolli di acquisizione specifici test" definiti al punto 3.2.1 per eseguire il campione di controllo negativo (vale a dire, il sangue solo) e il controllo positivocampioni (ad esempio, controllo che, di controllo CIC) attraverso il sistema di citometria a flusso. Esamina gli istogrammi e regolare il tubo fotomoltiplicatore (PMT) tensioni dei canali ficoeritrina (PE) FITC e come necessario.
      5. Agitare i campioni di controllo e trasferirli al flusso citometria giostra sistema secondo l'ordine sul lista di lavoro. Quindi, posizionare la giostra nella camera di campionamento e fare clic sul pulsante citometro Barra degli strumenti "Start" per acquisire i dati per i campioni di controllo. Salvare il "xxx Impostazione Pro" protocollo di impostazione.
  3. Acquisire campioni di studio sul sistema di citometria a flusso.
    1. Rimuovere le provette dei campioni di studio dal frigorifero a 4 ° C e lasciare equilibrare a temperatura ambiente per 15 min.
    2. Mentre i campioni vengono equilibrante, trascinare i protocolli di acquisizione specifiche di studio predefiniti allo spazio lista di lavoro per fare una lista di lavoro del progetto.
    3. Verificare che il "protocollo di impostazione" è legata alla &# 34;. L'impostazione dei protocolli specifici test "definiti al punto 3.2.2 Quindi, immettere le informazioni di identificazione (ad esempio, nome dello studio, disegnare il numero, il numero di visita, soggetto ID) per ogni tubo nella lista di lavoro.
    4. Dopo il periodo di equilibrazione di 15 min, campioni di studio vortice e trasferirli al flusso citometria giostra sistema secondo l'ordine sul lista di lavoro. Quindi, posizionare la giostra nella camera di campionamento e fare clic sul pulsante citometro Barra degli strumenti "Start" per acquisire i dati per i campioni di studio.
    5. Valuta la qualità dei dati controllando l'efficienza RBC lisi e la distribuzione sottogruppo di cellule WBC, proporzioni, conte assolute e intensità di fluorescenza sul pannello rapporto di ciascun campione.
      NOTA: La qualità dei dati è considerata accettabile se tutti questi criteri sono entro i limiti predefiniti. Se tutti i criteri non sono soddisfatti, campione deve essere ritrattato.
    6. Pulire e spegnere il sistema citometria a flusso. Conservare la citometria a flussoi dati sui due dischi diversi computer per prevenire la perdita accidentale dei dati.

Analisi 4. I dati

  1. Eseguire l'analisi fagocitosi.
    1. Consolidare tutti i fagocitosi (vale a dire, F-etichettato) file di dati dei dati in modalità di campionamento e la lista di controllo (LMD) in una singola cartella. Quindi, aprire la citometria a flusso software di analisi e trascinare i file nello spazio del campione.
    2. Impostare il WBC, granulociti, monociti, linfociti e cancelli.
      1. Fare doppio clic sul nome del file per aprire qualsiasi dei "campioni di controllo FITC". Utilizzare i menu a discesa per impostare l'asse x per "FSC" e "lineare" e l'asse y per "SSC" e "lineare".
      2. Utilizzare il "selettore di porta poligono" per preparare un cancello della popolazione totale WBC.
        NOTA: Assicuratevi di includere tutte le celle ai bordi del grafico. Etichettare questa porta "WBC".
      3. Fare doppio clic sulla "nuova porta WBC" e utilizzare il drop-down menu per impostare l'asse x per "FSC" e "lineare" e l'asse y per "SSC" e "lineare".
      4. Utilizzare il "selettore di porta poligono" per impostare la "granulociti gate" e il cancello Monocita ", e quindi utilizzare il" selettore di porta ellittica "per impostare la" linfociti porta ". Etichettare ogni porta di conseguenza. Trascinare i" Dati di gate (%) "di lato in modo che le cellule sono facilmente visualizzati.
    3. Impostare il "Fagocitosi positivo gate" e la "Fagocitosi porta negativo" per le popolazioni dei granulociti e monociti.
      1. Fare doppio clic sul "campione di controllo FITC" utilizzato nel passaggio 4.1.2.1. Quindi, fare clic sul "porta granulociti" e utilizzare i menu a discesa per impostare l'asse x per "FL1" e "Log" e l'asse y per "SSC" e "lineare".
      2. Utilizzare il "selettore di porta piazza" per impostare un "Fagocitosi porta negativo" e un "fagocitosi Positive gate ".
        NOTA: Poiché i campioni di controllo FITC non hanno ricevuto batteriche (ad esempio, S. aureus) stimoli, tutte le celle dovrebbe teoricamente fagocitosi negativo. Usare discrezione al momento di stabilire i confini di queste popolazioni.
      3. Ripetere il punto 4.1.3.1 e 4.1.3.2 passo per la popolazione dei monociti.
    4. Aggiungere statistiche per "% di WBC", "intensità di fluorescenza", e "cellule positive% fagocitosi" per le popolazioni dei granulociti e monociti.
      1. Clicca su "campione di controllo FITC" utilizzato nel passaggio 4.1.2.1. Evidenziare il "granulociti porta", e quindi cliccare su "Area di lavoro" e "Aggiungi Statistica". Evidenziare "media geometrica" ​​e "FL1 Log" e fare clic su "Aggiungi". Poi ha scelto la statistica "Frequenza di Parent" e cliccare su "Aggiungi".
        NOTA: Questo darà l'intensità di fluorescenza (media geometrica) di tutta la popolazione di granulociti ela percentuale di WBC (genitore) che sono granulociti.
      2. Clicca su "campione di controllo FITC" utilizzato nel passaggio 4.1.2.1. Evidenziare il "Fagocitosi porta positiva" della popolazione granulociti, e quindi fare clic su "Area di lavoro" e "Aggiungi Statistica". Evidenziare "media geometrica" ​​e "FL1 Log" e fare clic su "Aggiungi". Quindi scegliere la statistica "Frequenza di Parent" e cliccare su "Aggiungi".
        NOTA: Questo darà l'intensità di fluorescenza (media geometrica) dei granulociti fagocitosi positivi e la percentuale dei granulociti (genitore) che sono fagocitosi positive.
      3. Ripetere il punto 4.1.4.1 e 4.1.4.2 passo per la popolazione dei monociti.
      4. Clicca su "campione di controllo FITC" utilizzato nel passaggio 4.1.2.1. Evidenziare il "linfociti porta", e quindi cliccare su "Area di lavoro" e "Aggiungi Statistica". Evidenziare la statistica "Frequenza di Parent" e cliccare su "Aggiungi".
        NOTA: Questodarà la percentuale di WBC (genitore) che sono i linfociti.
      5. Evidenziare tutte le porte e le statistiche create nel campione di controllo FITC utilizzato nel passaggio 4.1.2.1. trascinarli in "Tutti Campioni" nel pannello "gruppo" nella parte superiore dello schermo.
        NOTA: Questo si applica queste impostazioni per tutti i campioni di studio.
      6. Salva e nome lavoro come un file con estensione wsp nella stessa cartella che contiene la cartella LMD.
    5. Regolare le singole porte di esempio.
      1. Fare clic sul "primo campione" nel set di dati e verificare che il cancello WBC si adatta in modo appropriato la distribuzione delle cellule sullo schermo. In caso contrario, fare clic e trascinare i bordi della porta regolare il cancello per quel campione. Clicca su "freccia destra" (vale a dire, "˃") per passare al campione successivo. Ripetere questa operazione fino a quando tutti i campioni sono stati esaminati.
      2. Fare clic sul "porta WBC" per il primo campione nel set di dati e confermare che il "Granulocyte cancello "," Monocita porta ", e" linfocitaria porta "per ogni campione opportunamente adattare la distribuzione delle cellule sullo schermo. Regolare, se necessario. Fare clic sulla" freccia destra "(vale a dire," ˃ ") per avanzare al campione successivo .
      3. Ripetere il punto 4.1.5.2 fino a quando tutti i campioni sono stati esaminati. Quindi, fai clic su "Salva".
    6. Visualizzare i dati in un foglio di calcolo elettronico.
      1. Fare clic sull'icona "Table Editor" nella parte superiore dello schermo. Fai clic su "Modifica", "Parole chiave", e "$ DATA" per includere la data di campionamento sul foglio di calcolo finale. Quindi, fai clic su "Modifica", "Parole chiave", e "@ SAMPLEID1" per includere l'identificazione di campionamento sul foglio di calcolo finale. Ripetere l'operazione per "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3", e "@ SAMPLEID4".
      2. Regolare lo schermo "Table Editor" e la schermata "campione" in modo che possano entrambi essere visualizzate sullo schermo del computer. Select qualsiasi "campione" sullo strato campione. Quindi, trascinare ogni statistica di interesse per la "Tabella Editor".
        1. Trascinare il ". Di Parent Freq" statistica elencati sotto la "porta di granulociti" al "Table Editor". Tipo "% WBC come granulociti" sotto la colonna "Nome" del "Table Editor".
        2. Trascinare la statistica "media geometrica" ​​elencati sotto la "porta di granulociti" al "Table Editor". Tipo "media geometrica fluorescenza, granulociti" sotto la colonna "Nome" del "Table Editor".
        3. Trascinare il ". Di Parent Freq" statistica elencati sotto la "granulociti / Fagocitosi positivo cancello" al "Table Editor". Tipo "% fagocitosi positivi granulociti" sotto la colonna "Nome" del "Table Editor".
        4. Trascinare la statistica "media geometrica" ​​elencati sotto la "granulociti / Fagocitosi positivo porta" a the "Table Editor". Tipo "media geometrica di fluorescenza, la fagocitosi Granulociti positivi" nella colonna "Nome" del "Table Editor".
        5. Trascinare il ". Di Parent Freq" statistica elencati sotto la "porta monociti" al "Table Editor". Tipo "% WBC come monociti" sotto la colonna "Nome" del "Table Editor".
        6. Trascinare la statistica "media geometrica" ​​elencati sotto la "porta monociti" al "Table Editor". Tipo "media geometrica di fluorescenza, monociti" sotto la colonna "Nome" del "Table Editor".
        7. Trascinare il ". Di Parent Freq" statistica elencati sotto la "monociti / Fagocitosi positivo cancello" al "Table Editor". Tipo "% fagocitosi Monociti positiva" nella colonna "Nome" del "Table Editor".
        8. Trascinare la statistica "media geometrica" ​​elencati sotto la "monociti / PhagocyTosis positivo porta "al" Table Editor ". TIPO" media geometrica di fluorescenza, la fagocitosi monociti positivi "sotto la" "colonna" Nome Table Editor ".
        9. Trascinare il ". Di Parent Freq" statistica elencati sotto la "linfociti porta" al "Table Editor". Tipo "% WBC come Linfociti" sotto la colonna "Nome" del "Table Editor".
      3. Trascinare i parametri visibili nella "Table Editor" fino a quando non sono disposte secondo l'ordine preferito.
      4. Fai clic su "Salva". Quindi, fai clic su "Crea tabella" per visualizzare i dati in un formato foglio di calcolo. Clicca su "salva con nome" per salvare e il nome del lavoro come .xlsx file.
  2. Ripetere il punto 4.1 per il saggio di attività OB (cioè, H-etichettato) campioni e controllare i file di dati LMD.
    NOTA: assicurarsi di sostituire tutti i riferimenti alla fagocitosi con riferimenti ad attività di OB.

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Risultati

attività intensa e prolungata ha effetti profondi sulla funzione immunitaria innata, tra cui la funzione Natural Killer delle cellule, la risposta dei macrofagi citochina-mediata alle infezioni virali, e granulociti e monociti fagocitosi e l'attività OB. Diversi studi indicano che i granulociti e monociti fagocitosi aumenta in modo significativo post-esercizio, che riflettono l'infiammazione indotta da danno muscolare e richieste metaboliche. Al contrario, granulociti e monociti ...

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Discussione

Questo manoscritto fornisce un protocollo passo-passo per la determinazione di due indicatori di granulociti e monociti funzione. Abbiamo identificato alcuni punti che sono fondamentali per il successo di questo test. Un tale passo è l'incubazione bagno di ghiaccio che si verifica immediatamente prima dell'aggiunta di batteri. raffreddamento completa di tutti i campioni minimizzerà l'effetto della temperatura sull'attività fagocitosi e OB. Un altro punto critico è l'aggiunta di batteri per ogni campi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori vorrebbero riconoscere Zack Shue, Casey John, e Lynn Cialdella-Kam per la loro assistenza durante l'ottimizzazione di questa procedura.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
12 provette da 75 mm, con tappoVWR20170-579Sono necessarie 2 provette per campione ("H" e "F") più 3 provette per lotto (per i controlli dei saggi; "F", "H" e "Solo sangue").
PBS (10x), pH 7,4Life Technologies70011-044
Tappo del flacone 0,2 &; m filtro in acetato di cellulosa (capacità 500 ml)Fisher Scientific09-741-07 
Glucosio, polvereLife Technologies15023-021
Acido citrico (anidro, testato per colture cellulari, testato per colture cellulari vegetali)Sigma-AldrichC2404-100G
Citrato di sodio tribasico diidratoSigma-AldrichS4641-25G
Diidroetidio (Idroetidina) (HE)Life TechnologiesD11347
Dimetile solfossido (DMSO) AnhydrousLife TechnologiesD12345
Staphylococcus aureus ( Ceppo di legno senza proteina A) BioParticelle, coniugato di fluoresceina (FITC)Life TechnologiesS2851
Staphylococcus aureus ( Ceppo di legno senza proteine A) BioParticles, soluzione diTechnologiesS-2859
, 0,4%Life Technologies15250-061
vacutainer da 4,0 ml contenente 7,2 mg di K2EDTA, VWR essiccato a spruzzoBD367861Sarà necessaria 1 provetta per prelievo di sangue K2EDTA per campione.
Vacutainer da 4,0 ml contenente 68 unità USP Litio eparina, rivestimento a spruzzoVWRBD367884Avrai bisogno di 1 provetta per la raccolta del sangue al litio eparina per campione.
COULTER Ac· T 5diff CPBeckman Coulter6605705i.e., analizzatore ematologico
COULTER Ac· T 5diff RisciacquoBeckman Coulter8547167
COULTER Ac· T 5diff FixBeckman Coulter8547171
COULTER Ac· T 5diff WBC LyseBeckman Coulter8547170
COULTER Ac· T 5diff Hgb LyseBeckman Coulter8547168
COULTER Ac· T 5diff Calibratore CalBeckman Coulter7547175
COULTER Ac· T 5diff Control PlusBeckman Coulter7547198
AcT 5diff DiluenteBeckman Coulter8547169
200 µ l Puntali per pipette di lunghezza estesaVWR37001-526
Vaschetta del ghiaccio isolataVWR89198-980Per bagnomaria con acqua ghiacciata.
Rack per provette metalliche aperteVWR60916-702
Siero fetale bovinoLife Technologies26140-111
Stazione di lavoro TQ-Prep BeckmanCoulter6605429i.e., stazione di lavoro automatizzata per la preparazione della lisi cellulare
Sistema di reagenti ImmunoPrepBeckman Coulter7546999i.e., sistema di reagenti per la lisi globulica/WBC
Sistema di citometria a flusso Cytomics FC500 MCL con software CXPBeckman Coulter626553
IsoFlow Sheath FluidBeckman Coulter8547008
COULTER CLENZBeckman Coulter8546929
Fluorosfere di controllo del flusso Beckman Coulter6605359i.e., verifica dell'allineamento e della fluidica fluorosfere
FlowJo Software FlowJoFlowJoFlowJoi.e., software per analisi della citometria a flusso
Software ExcelMicrosoftMicrosoft Exceli.e., programma per fogli di calcolo elettronici
tripano blu Life non marcata

Riferimenti

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