Lo scopo di questo manoscritto è quello di presentare un metodo per misurare la fagocitosi di monociti e granulociti e l'attività di scoppio ossidativo in campioni di sangue umano.
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Articolo metodologico
Misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività Burst nel sangue umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il test di fagocitosi dei granulociti e dei monociti e dell'attività di scoppio ossidativo (OB) può essere utilizzato per studiare il sistema immunitario innato. Questo manoscritto fornisce la metodologia necessaria per aggiungere questo test a un arsenale di immunologia dell'esercizio. Il primo passo di questo test consiste nel preparare due aliquote ("H" e "F") di sangue intero (eparina). Quindi, il diidroetidio viene aggiunto all'aliquota H ed entrambe le aliquote vengono incubate in un bagno di acqua calda seguito da un bagno di acqua fredda. Successivamente, lo Staphylococcus aureus (S. aureus) viene aggiunto all'aliquota H e S. aureus marcato con isotiocianato di fluoresceina viene aggiunto all'aliquota F (batteri:fagocita = 8:1), ed entrambe le aliquote vengono incubate in un bagno di acqua calda seguito da un bagno di acqua fredda. Quindi, il blu di tripano viene aggiunto a ciascuna aliquota per estinguere la fluorescenza extracellulare e le cellule vengono lavate con soluzione salina tamponata con fosfato. Successivamente, i globuli rossi vengono lisati e i globuli bianchi vengono fissati. Infine, un citometro a flusso e un software di analisi appropriato vengono utilizzati per misurare la fagocitosi di granulociti e monociti e l'attività OB. Questo test è stato utilizzato per oltre 20 anni. Dopo uno sforzo pesante e prolungato, gli atleti sperimentano un aumento significativo ma transitorio della fagocitosi e una diminuzione prolungata dell'attività ostetrica. L'aumento della fagocitosi post-esercizio è correlato all'infiammazione. A differenza degli individui normopeso, la fagocitosi dei granulociti e dei monociti è cronicamente elevata nei partecipanti in sovrappeso e obesi ed è modestamente correlata con la proteina C-reattiva. In sintesi, questo test basato sulla citometria a flusso misura la fagocitosi e l'attività ostetrica dei fagociti e può essere utilizzato come misura aggiuntiva dell'infiammazione indotta dall'esercizio fisico e dall'obesità.
Introduzione
Il granulociti e monociti fagocitosi / burst ossidativo (OB) saggio di attività è una tecnica semplice, straight-forward che viene spesso utilizzato per raccogliere informazioni sui innato funzione immunitaria dopo l'attività fisica intensa e prolungata. 1-4 Quando si studia la risposta del sistema immunitario a uno stimolo, granulociti e monociti sono di particolare interesse perché giocano un ruolo centrale nella difesa ospite e sono le prime cellule immunitarie per accumulare nel sito di infezione. 5 neutrofili, un tipo di granulociti, sono le prime cellule di traslocare nel muscolo danneggiato tessuto dopo l'attività fisica ....
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Protocollo
NOTA: Tutte le procedure di raccolta del sangue sono state condotte in conformità con le linee guida stabilite dalla Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB).
1. Preparazione Assay
- Raccogliere, preparare e organizzare i materiali specificati per la procedura (si prega di fare riferimento alla tabella di specifici materiali / attrezzature).
- Etichettare tubi 12 x 75 mm.
- Etichetta due tubi per ogni partecipante: un tubo per il saggio fagocitosi (etichettare questo tubo con inchiostro nero e una "F" per isotiocianato di fluorescina [FITC]) e un tubo per il saggio di attività OB (etichett....
- Etichettare tubi 12 x 75 mm.
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Risultati
attività intensa e prolungata ha effetti profondi sulla funzione immunitaria innata, tra cui la funzione Natural Killer delle cellule, la risposta dei macrofagi citochina-mediata alle infezioni virali, e granulociti e monociti fagocitosi e l'attività OB. Diversi studi indicano che i granulociti e monociti fagocitosi aumenta in modo significativo post-esercizio, che riflettono l'infiammazione indotta da danno muscolare e richieste metaboliche. Al contrario, granulociti e monociti .......
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Discussione
Questo manoscritto fornisce un protocollo passo-passo per la determinazione di due indicatori di granulociti e monociti funzione. Abbiamo identificato alcuni punti che sono fondamentali per il successo di questo test. Un tale passo è l'incubazione bagno di ghiaccio che si verifica immediatamente prima dell'aggiunta di batteri. raffreddamento completa di tutti i campioni minimizzerà l'effetto della temperatura sull'attività fagocitosi e OB. Un altro punto critico è l'aggiunta di batteri per ogni campi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere Zack Shue, Casey John, e Lynn Cialdella-Kam per la loro assistenza durante l'ottimizzazione di questa procedura.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 12 provette da 75 mm, con tappo | VWR | 20170-579 | Sono necessarie 2 provette per campione ("H" e "F") più 3 provette per lotto (per i controlli dei saggi; "F", "H" e "Solo sangue"). |
| PBS (10x), pH 7,4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Tappo del flacone 0,2 &; m filtro in acetato di cellulosa (capacità 500 ml) | Fisher Scientific | 09-741-07 | |
| Glucosio, polvere | Life Technologies | 15023-021 | |
| Acido citrico (anidro, testato per colture cellulari, testato per colture cellulari vegetali) | Sigma-Aldrich | C2404-100G | |
| Citrato di sodio tribasico diidrato | Sigma-Aldrich | S4641-25G | |
| Diidroetidio (Idroetidina) (HE) | Life Technologies | D11347 | |
| Dimetile solfossido (DMSO) Anhydrous | Life Technologies | D12345 | |
| Staphylococcus aureus ( Ceppo di legno senza proteina A) BioParticelle, coniugato di fluoresceina (FITC) | Life Technologies | S2851 | |
| Staphylococcus aureus ( Ceppo di legno senza proteine A) BioParticles, soluzione di | Technologies | S-2859 | |
| , 0,4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| vacutainer da 4,0 ml contenente 7,2 mg di K2EDTA, VWR essiccato a spruzzo | BD367861 | Sarà necessaria 1 provetta per prelievo di sangue K2EDTA per campione. | |
| Vacutainer da 4,0 ml contenente 68 unità USP Litio eparina, rivestimento a spruzzo | VWR | BD367884 | Avrai bisogno di 1 provetta per la raccolta del sangue al litio eparina per campione. |
| COULTER Ac· T 5diff CP | Beckman Coulter | 6605705 | i.e., analizzatore ematologico |
| COULTER Ac· T 5diff Risciacquo | Beckman Coulter | 8547167 | |
| COULTER Ac· T 5diff Fix | Beckman Coulter | 8547171 | |
| COULTER Ac· T 5diff WBC Lyse | Beckman Coulter | 8547170 | |
| COULTER Ac· T 5diff Hgb Lyse | Beckman Coulter | 8547168 | |
| COULTER Ac· T 5diff Calibratore Cal | Beckman Coulter | 7547175 | |
| COULTER Ac· T 5diff Control Plus | Beckman Coulter | 7547198 | |
| AcT 5diff Diluente | Beckman Coulter | 8547169 | |
| 200 µ l Puntali per pipette di lunghezza estesa | VWR | 37001-526 | |
| Vaschetta del ghiaccio isolata | VWR | 89198-980 | Per bagnomaria con acqua ghiacciata. |
| Rack per provette metalliche aperte | VWR | 60916-702 | |
| Siero fetale bovino | Life Technologies | 26140-111 | |
| Stazione di lavoro TQ-Prep Beckman | Coulter | 6605429 | i.e., stazione di lavoro automatizzata per la preparazione della lisi cellulare |
| Sistema di reagenti ImmunoPrep | Beckman Coulter | 7546999 | i.e., sistema di reagenti per la lisi globulica/WBC |
| Sistema di citometria a flusso Cytomics FC500 MCL con software CXP | Beckman Coulter | 626553 | |
| IsoFlow Sheath Fluid | Beckman Coulter | 8547008 | |
| COULTER CLENZ | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Fluorosfere di controllo del flusso | Beckman Coulter | 6605359 | i.e., verifica dell'allineamento e della fluidica fluorosfere |
| FlowJo Software FlowJo | FlowJo | FlowJo | i.e., software per analisi della citometria a flusso |
| Software Excel | Microsoft | Microsoft Excel | i.e., programma per fogli di calcolo elettronici |
Riferimenti
- Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725(2014).
- Knab, A. M., et al.
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Ristampe e permessi
