Ricostituzione di base Mitotic mandrini sferici Emulsione goccioline

Summary

L'assemblaggio e il posizionamento del fuso mitotico dipendono dalle forze combinate generate dalla dinamica dei microtubuli, dalle proteine motorie e dai reticolanti. Qui presentiamo i nostri metodi recentemente sviluppati in cui il confinamento geometrico di goccioline di emulsione sferica viene utilizzato per la ricostituzione dal basso verso l'alto di fusi mitotici basici.

Abstract

L'assemblaggio, il posizionamento e l'orientamento del fuso mitotico dipendono dalle forze combinate generate dalla dinamica dei microtubuli, dalle proteine motorie dei microtubuli e dai reticolanti. I microtubuli in crescita possono generare forze di spinta, mentre i microtubuli depolimerizzanti possono convertire l'energia dal restringimento dei microtubuli in forze di trazione, quando sono attaccati, ad esempio, alla dineina corticale o ai cromosomi. Inoltre, le proteine motrici e i reticolanti diffusibili all'interno del fuso contribuiscono all'architettura del fuso collegando e facendo scorrere i microtubuli antiparalleli. In vivo, si è dimostrato difficile svelare il contributo relativo dei singoli attori all'equilibrio complessivo delle forze. Qui presentiamo i metodi che abbiamo recentemente sviluppato nei nostri sforzi per ricostituire i fusi mitotici di base dal basso verso l'alto in vitro. Utilizzando tecniche microfluidiche, i centrosomi e la tubulina sono incapsulati in goccioline di emulsione acqua-in-olio, portando alla formazione di astri microtubulici geometricamente confinati (doppi). Introducendo inoltre dineina ancorata corticalmente, motori a microtubuli diretti plus-end e reticolanti diffusibili, questo sistema viene utilizzato per ricostituire strutture simili a fusi. I metodi qui presentati forniscono un punto di partenza per la ricostituzione di fusi mitotici più completi, consentendo uno studio dettagliato del contributo di ogni singolo componente e per ottenere una visione quantitativa integrata del bilancio di forza all'interno del fuso mitotico.

Introduction

Durante la mitosi, i cromosomi del genoma replicato sono organizzati all'equatore cella per garantire la parità di distribuzione di cromatidi fratelli negli cellule figlie di nuova formazione. il posizionamento e la segregazione dei cromosomi è mediato da loro attaccamento ai microtubuli del fuso provenienti da due centrosomi opposte. Oltre a garantire la distribuzione cromosomica fedeli, l'orientamento del fuso mitotico detta anche il piano divisione cellulare ^1. Orientamento coordinato di divisione cellulare è essenziale durante molte fasi di sviluppo e per il tessuto omeostasi ^2. In particolare, regolata posizionamento fuso mitotico può comportare la distribuzione asimmetrica del contenuto cellulare o anche produrre cellule figlie di diverse dimensioni ^2. Assemblaggio del fuso mitotico e l'orientamento inizia in profase e è orchestrato da una complessa interazione tra cooperazione e inimicarsi forza-generatori ^3,4. Le forze generate consistono btirando e spingendo le forze di OTH. Queste forze provengono sia dai contatti mandrino con la corteccia cellule così come all'interno del mandrino, e possono essere generati da dinamica dei microtubuli e da motori molecolari e reticolanti (Figura 1).

spinte possono essere generati quando microtubuli crescono contro strutture rigide come la corteccia cellulare. A seconda della forza resistente totale generato all'interno del sistema, questo può portare a riposizionamento del fuso mitotico (forze inferiori) o innescare instabilità microtubuli o catastrofi (elevate forze) ^5-8. La quantità di forza che può essere generato premendo dipende dalla lunghezza dei microtubuli, poiché la lunghezza è un forte determinante di microtubuli buckling ^9. Inoltre, microtubuli che hanno origine da uno dei centrosomi possono spingere contro l'altro centrosoma, un meccanismo che è stato suggerito di guidare la separazione centrosome nei primi mesi del profase ^3,10.

in annunciocondizione per spingere le forze generate da microtubuli in crescita, microtubuli che tocca la corteccia cellula può anche mediare forze di trazione ^11. Studi di molteplici laboratori hanno mostrato che l'attività controllata di generatori di forza corticali è necessaria per il posizionamento asimmetrico dei fusi mitotici in vivo ^1. Essenziale per queste forze di trazione è Cortex-localizzato dynein citoplasmatica (di seguito denominato 'dynein'), un meno-end microtubuli diretto proteine ​​motore ^8,12,13. Ad esempio, in il lievito, interazioni laterali di dynein corticale con il risultato lattice microtubuli in microtubuli base al motore scorrevole lungo la corteccia ^14. Tuttavia, le forze di trazione corticali possono essere generati anche dalla capacità di dynein di formare raccordi di estremità-a depolimerizzante microtubuli ^8. L'energia generata dal restringimento microtubuli può portare a forze che sono generalmente di un ordine di grandezza superiore (~ 50 pN (riferimento ¹⁵ )) che le forze generate dai singoli proteine ​​motrici (~ 7-8 pN (rif. ^16)). Attaccamento Fine-in di dynein corticale ai microtubuli depolimerizzante promuove posizionamento del mandrino in erba lievito ¹⁷ e C. elegans ^13. Sia che sia in base al motore scorrevole e microtubuli depolimerizzazione guidato forze di trazione corticali possono cooperare o si escludono a vicenda in vivo è attualmente sconosciuto.

Oltre a spinta forze microtubuli e forze di trazione corticali dynein-mediata, posizionamento centrosoma è controllata all'interno del fuso mitotico da numerose altre proteine. Kinesin-5 motori, ad esempio, esistono come tetrameri che può reticolare antiparalleli microtubuli interpolari, con conseguente generazione di forze di scorrimento verso l'esterno ^18-20. I membri della famiglia del motore chinesina-5 sono necessari per la separazione centrosome e montaggio fuso bipolare in tutti gli eucarioti studiati, con l'eccezione di C. elegans (recensito in riferimento ^21).

Inoltre, sono anche noti diffusibili reticolanti della famiglia / PRC1 Ase1 localizzare per sovrapposizione delle regioni microtubuli di microtubuli interpolari in vivo e in vitro ^22-27. Le forze generate dalla espansione Ase1-driven del microtubulo-regione di sovrapposizione sono grandi abbastanza per controbilanciare kinesin-14 delle forze di scorrimento in vitro mediata ^28,29. Nelle cellule, Ase1 / PRC1 è necessario per la formazione stabile di sovrapposizione regioni microtubuli nella zona mediana del mandrino ^25-27,30, il che suggerisce che le forze generate da diffusibili reticolanti possono contribuire in modo significativo alla organizzazione del mandrino. Infine, le forze della cromatina mitotico e cinetocori influenzano assemblaggio del fuso mitotico e il posizionamento attraverso vari percorsi ^3. Dal momento che questi componenti non sono parte dei saggi ricostituzione qui descritte, non saranno discussi in dettaglio.

jove_content "> Diverse teorie esistono su come le diverse componenti molecolari e forze sopra descritte cooperano nel montaggio e posizionamento del mandrino, ma siamo ancora lontani da una comprensione quantitativa. Oltre a esperimenti nelle cellule viventi, gli esperimenti in vitro con componenti purificati forniscono un potente percorso per aiutare raggiungere questo obiettivo. presentiamo qui una guida visiva per una versione adattata ed estesa dei metodi pubblicati recentemente (Roth et al. ^31), in cui mandrini base sono ricostituiti in acqua-in-olio di goccioline di emulsione, iniziando con un numero minimo di componenti. Utilizzando tecniche di microfluidica, goccioline sferiche vengono generati con i formati che sono paragonabili alle cellule in mitosi. All'interno di queste goccioline, centrosomi purificati e tubulina possono essere combinati al fine di studiare la dinamica aster microtubuli, forzare le interazioni generazione e Aster-Aster. di introducendo corticali (come dineina) e inter-polari (come ad esempio kinesin-5 / Ase1) forza-generatori, abbiamoricostituire strutture sempre più complesse mandrino-like che iniziano ad assomigliare alla situazione in vivo.

Protocol

1. Preparazione del chip microfluidica

NOTA: Per lo studio bottom-up di assemblaggio del fuso, vengono utilizzati sferiche goccioline di emulsione acqua-in-olio. Questi sono microgocce acquose separate dalla circostante fase oleosa da un monostrato di fosfolipidi e tensioattivo. Questi emulsione-goccioline sono prodotte all'interno di microfluidica polidimetilsilossano (PDMS) chip. Variazioni geometrie di canale e le portate possono essere utilizzati per regolare dimensioni delle gocce. Nella progettazione microfluidica qui descritto, goccioline vengono generati con un diametro di circa 15 micron di imitare il confinamento geometrico di una cella mitotica mammiferi.

1. Photomask Progettazione e Mold Fabrication
   1. Progettare un photomask contenente tre canali di ingresso ^31. canale di ingresso 1 si collega al l'acqua-fase, che contiene il contenuto delle gocce (vedi sezione 3 "Ricostituzione aster microtubuli di base"). canale di ingresso 2 si collega alla fase oleosa (vedi sezione 2.1 "Lipid / olio-PHAse la preparazione "). Usare il canale di ingresso 3 per diluire emulsione-goccioline con l'aggiunta di lipidi / olio-fase di prima osservazione (opzionale) (Figura 2a-b).
      NOTA: Tutti i canali di ingresso sono seguiti da una polvere filtro (un labirinto di 2 micron canali) per intrappolare la polvere, le particelle PDMS e aggregati (proteinuria) e per impedire loro di bloccare i canali microfluidica (figura 2d). I canali sono 75 micron di larghezza e la lipidi / olio-fase e acqua-fase si incontrano in un ampio incrocio 12,5 micron dove emulsione gocce formeranno (Figura 2c).
   2. Ordine e ottenere fotomaschere stampate su un substrato di pellicola, con una polarità negativa (fotomaschera sarà scuro con strutture progettate trasparenti).
2. Mold Fabrication
   1. Realizzare stampi di spin-coating SU-8 3025 photoresist su un wafer di silicio da 4 pollici utilizzando uno spin-coater (500 rpm, 10 sec, seguito da 1.800 rpm, 45 sec) in un ambiente sterile.
   2. Esporre la 8-SU rivestitowafer di silicio attraverso la fotomaschera. Sviluppare wafer secondo le istruzioni del produttore per creare canali di ~ spessore di 40 micron.
3. Fare un chip microfluidico
   1. Miscelare 10 parti PDMS pre-polimero con 1 parte di catalizzatore (totale ~ 40 gr) in un recipiente barca-come con una spatola di plastica. Inserire PDMS contenenti nave barca-come in una camera a vuoto per ~ 30 min. per rimuovere le bolle d'aria. Avvolgere un foglio di alluminio intorno allo stampo per formare una tazza con ~ 1 cm onesto bordi.
   2. Versare il PDMS (~ 75% del volume totale) nello stampo, lasciato in una camera a vuoto per un altro ~ 30 min. (Per rimuovere le bolle d'aria) e curare per 1 ora a 100 ° C in un forno.
   3. Spin-coat rimanenti PDMS su vetrini (5 sec a 200 rpm seguita da 30 secondi a 4000 rpm) seguita da indurimento per 1 ora a 100 ° C. Rimuovere la polvere da vetrini con aria compressa / N ₂ FUORI-USCITA, pre-pulizia non è necessaria.
      NOTA: Il PDMS rivestito vetrini possono essere utilizzati sia per il microfonoChip rofluidic e la produzione di flusso delle cellule (vedi anche 2.2).
   4. striscia delicatamente i PDMS fuori dello stampo con una lama di rasoio e perforare (0,5 mm per ingressi, 0,75 mm per uscita) .Corona-trattare il chip microfluidica e un vetrino PDMS rivestite con una superficie treater laboratorio corona per alcuni secondi .
   5. Posizionare il chip microfluidico sul vetrino (canali rivolti verso il basso) e cuocere le patatine o / n a 100 ° C (Figura 3a). Conservare chip microfluidici per diversi mesi in un ambiente privo di polvere.

2. Installazione Microfluidic

NOTA: acqua-in-olio goccioline di emulsione vengono generati utilizzando una configurazione microfluidica e le patatine microfluidici sopra descritti. La composizione del lipide / fase oleosa può essere variata a seconda delle esigenze sperimentali. lipidi olio solubilizzati formeranno un monostrato all'interfaccia acqua-olio con i loro polari testa-gruppi affrontano l'acqua all'interno. Al fine di indirizzare le proteine(Ad esempio dynein) al confine delle gocce, basse quantità di Biotinyl-fosfatidiletanolamina (PE-Biotinyl) lipidi può essere aggiunto. Questo permette il reclutamento di dineina biotinilato (vedere paragrafo 4.1 "Dynein mira alla corteccia delle gocce") tramite multimerizzazione streptavidina-mediata. Goccioline sono stabilizzate mediante aggiunta di un tensioattivo e memorizzati in celle di flusso PDMS rivestite.

1. Lipid / olio-Fase di preparazione
   1. Mescolare il cloroformio-sciolto 1,2-dioleoyl- sn- glycero-3-fosfo-L-serina (DOPS) e lipidi Biotinyl-PE in un rapporto di 4: 1 molare in un tubo di vetro con pipette di vetro (ampiamente sciacquare pipette con cloroformio prima uso). Preparare un totale di ~ 250 mcg lipidi, ottenendo una concentrazione di lipidi ~ 0,5 mg / ml.
   2. Asciugare accuratamente la miscela lipidica con N ₂ FUORI-USCITA e, successivamente, in una camera a vuoto per ~ 1 ora. Sciogliere i lipidi secchi in olio minerale e il 2,5% di tensioattivo a 0,5 mg / ml (fare ~ 500 microlitri).
   3. Mettere il campione di lipidi / olio in unbagno a ultrasuoni e ultrasuoni per 30 minuti. a 40 kHz per sciogliere completamente i lipidi.
2. Preparazione Flow-cellule
   1. PDMS Spin-coat (vedere anche paragrafo 1.3) su vetrini (5 sec a 200 rpm seguita da 30 sec a 4.000 rpm) e vetrini (5 sec a 100 rpm seguita da 30 sec 1.500 rpm) per depositare lo strato omogeneo di PDMS.
      NOTA: Per una qualità delle immagini ottimale, assicurarsi di utilizzare vetrini con uno spessore che corrisponde l'obiettivo microscopio. In questo caso: 1.5 (~ 0,17 millimetri).
   2. Curare i vetrini PDMS rivestita e vetrini per 1 ora a 100 ° C in un forno. Fare portate cellule distanziando da vicino (~ 2 mm) fette sottili di pellicola laboratorio di tenuta (~ 3 mm di larghezza) sui PDMS-rivestite di vetro scorrevoli. Se conservato in un ambiente privo di polvere, i canali che non sono stati utilizzati possono essere usati in altri momenti.
   3. Coprire le portate cellule con un vetrino PDMS a polvere e sigillo fondendo il laboratorio di saldatura del film ~ 1 min. a 100 ° C, premeredelicatamente (figura 3c). Chiudere i Film Laboratory tenuta -GLASS-confini con Valap (Figura 3c). flow-cellule negozio per diversi mesi in un ambiente privo di polvere.
3. PDMS Cup Preparazione
   1. Per l'imaging a lungo termine, una tazza PDMS, da un foro 4 mm di diametro in una fetta di PDMS (~ 3 mm di spessore)
   2. Corona-trattare la fetta PDMS e un vetro di copertura PDMS rivestito e metterli uno sopra l'altro. Cuocere la coppa PDMS o / n (a 100 ° C) (figura 5a).
4. Formazione Emulsion-goccioline
   1. Monitorare la formazione di goccioline su un microscopio in campo chiaro invertito. Collegare il regolatore di pressione al chip microfluidico utilizzando tubi in PEEK (diametro: 510 micron (esterno) e 125 micron (interno)) (Figura 3a). Riempire chip microfluidici completamente con lipidi / olio-fase da ingresso 2.
   2. Introdurre MRB80 a base di acqua-fase (vedi sezione 3 "Ricostituzione aster microtubuli di base4;) da ingresso 1. Controllo delle gocce di dimensioni modificando le pressioni di lipidi / olio-fase e acqua-fase per creare goccioline di ~ 15 m di diametro (Figura 3b).
      NOTA: Usando questa configurazione, utilizzare ~ 800 mbar per lipide / fase oleosa e ~ 200 mbar per l'acqua fasi per creare goccioline di dimensioni desiderate.
   3. Dopo aver ottenuto la goccia-dimensione desiderata e la quantità necessaria (~ 10 microlitri per campione), raccogliere le goccioline di canale di uscita e carico nella cella a flusso (riempire completamente il flusso delle cellule).
   4. Chiudere le estremità della cella a flusso accuratamente con Valap (non completamente chiusi portate cellule possono provocare vasta movimento delle goccioline, rendendo difficile immagine loro). Inoltre, evitare la formazione di bolle d'aria che si traduce in movimento gocciolina.
   5. Sciacquare i tubi in PEEK ampiamente con isopropanolo prima e dopo l'uso per evitare campione contaminazione incrociata e intasamento.

3. Ricostituzione di base microtubuli Aster

NOTA: contenuti gocciolina può essere variato a seconda delle esigenze sperimentali. Tutti i tamponi sono MRB80 basati (80 TUBI mM, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl ₂ (pH 6,8)), e tutti i campioni sono preparati su ghiaccio. In generale, le goccioline contengono sempre centrosomi, componenti necessari per la polimerizzazione dei microtubuli, un sistema di ossigeno al tesoro e agente bloccante (vedi paragrafo 3.1). forza-generatori microtubuli e cofattori necessari e di targeting fattori può essere incluso, se desiderato (vedere paragrafi 4.1 e 4.2).

1. Impostazioni generali per la formazione aster in gocce di emulsione (figura 3d)
   1. Preparare glucosio ossidasi (20 mg / ml di glucosio ossidasi in 200 mM DTT e 10 mg / ml catalasi) mix in anticipo e conservare in piccole aliquote a -80 ° C.
   2. Preparare un 'blocco mix' contenente κ-caseina, albumina sierica bovina (BSA), Tween-20 e destrano fluorescente (come marcatore neutro) (vedi tabella 1) in anticipo e conservare in piccoli aliquots a -80 ° C. Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. Assicurarsi che tutti i componenti sono preparati al momento.
   3. Purificare centrosomi da linee cellulari umane KE37 linfoblastica come descritto da Moudjou et al. ³² e conservare a -150 ° C in piccole aliquote.
   4. Scongelare centrosomes a temperatura ambiente e incubare a 37 ° C per ~ 20 min. prima dell'uso per garantire una corretta nucleazione dei microtubuli.
      NOTA: Questo favorisce microtubuli nucleazione durante l'esperimento.
   5. Nel frattempo, preparare 'saggio mix', contenente tubulina (fluorescente e 'scuro'), guanosina trifosfato (GTP), un sistema di ossigeno scavenger (glucosio, glucosio-ossidasi, catalasi e 1,4-ditiotreitolo (DTT)), forza molecolare generatori (per esempio motori microtubuli / reticolanti), adenosina trifosfato (ATP) e un sistema ATP-rigenerante (fosfoenolpiruvato (PEP), piruvato chinasi (PK) e lattato deidrogenasi (LDH)) sul ghiaccio (vedi Tabella 2).
   6. Pre-raffreddare ilrotore airfuge sul ghiaccio. Spin giù il campione nel rotore raffreddata airfuge (30 psi per 3 min) .Add centrosomi pre-riscaldato (ottimizzare la quantità di centrosomi di puntare per le goccioline contenenti 1-2 centrosomi).
   7. Utilizzare il mix combinato per la produzione di goccioline di emulsione utilizzando i metodi descritti nella sezione 2.3.

Componente	la concentrazione della	Concentrazione finale (in test)	Volume	Commento
Destrano-647nm	75 micron	3,75 UM (0,6 micron)	5 ml
κ-caseina	20 mg / ml	12,5 mg / ml (2 mg / ml)	62,5 ml
Tween-20	5%	0,375% (0,06%)	7,5 ml
BSA	200 mg / ml	12 mg / ml (1,9 mg / ml)	6 ml
MRB80			19 ml
			100 ul finale	Conservare in 2 aliquote microlitri

Tabella 1: Componenti di 'Blocco Mix' Costituenti di bloccare mix, necessari per la ricostituzione di strutture mandrino-come in acqua-in-olio di goccioline di emulsione.. Per la descrizione, vedere la sezione testo principale 3 "Ricostituzione aster microtubuli di base". Per ulteriori informazioni sui materiali, consultare la sezione "Materiali tabella.

Componente	Archivio concentration	Concentrazione finale	Volume	Commento
Blocco mix			1,6 ml
tubulina	500 micron	30 mM	0,6 ml
Tubulina-488/561	50 mM	3 micron	0,6 ml
GTP	50 mm	5 mM	1,0 ml
Dynein-TMR	178 nM	30 nm	1,7 ml
streptavidina	5 mg / ml	200 nm	0,4 ml	Per corticale Dynein solo
Kinesin-5	1,6 mm	80 nm	0,5 ml
ATP	25 mM	1 mM	0,4 ml	Per i motori solo
PEP	0.5 M	25.6 mM	0,5 ml	Per i motori solo
PK / LDH	800 U / 1.100 U	23 U / 32 U	0,3 ml	Per i motori solo
Ase1-GFP	400 nm	80 nm	2,0 ml
Glucosio	2.5 M	50 mm	0,3 ml	Ultimo passo
Glucosio-ossidasi	50x	1.0x	0,3 ml	Ultimo passo
MRB80			X
			9 ml finale

Tabella 2: Componenti di 'Assay Mix'. Componenti di mix di test, richiesto per la ricostituzione di strutture mandrino-come in acqua-in-olio di goccioline di emulsione. Per la descrizione, vedere la sezione testo principale 3 "Ricostituzione aster microtubuli di base". Per i dettagli su materiali, vedi Materiali Tavolo.

4. Introduzione del mandrino montaggio-fattori

NOTA: nei saggi qui descritte, una proteina fluorescente verde (GFP) -tagged versione troncata di S. cerevisiae dineina stata utilizzata che è artificialmente dimerizzato mediante un glutatione S-transferasi ammino-terminale (GST) -tag ^33. Questa proteina è purificata tramite un tag di affinità che contiene due copie della proteina A dominio IgG-binding. La variante usato qui è etichettato con un'etichetta tetrametilrodamina (TMR) sul carbossi-terminale ed il terminale N SNAP-tag è utilizzato per biotinilato proteine ​​purificate. Per i dettagli costruire, vedi Roth et al ^31.; per i dettagli di depurazione, vedere Reck-Peterson et al. ^33. GFP-biotina-dynein-TMR può essere mirata a goccia-corteccia attraverso la formazione di complessi biotina-streptavidina che puntano lipidi dynein a Biotinyl-PE (Figura 3E).

1. Dynein Targeting per la goccia Cortex
   1. Includi GFP-biotina-dynein-TMR in 'saggio mix' (vedi Tabella 2) in una finale gocciolina-concentrazione di 30 Nm. Includi streptavidina in 'saggio mix' (vedi Tabella 2) in una finale gocciolina concentrazione di 200 Nm.
      NOTA: Dynein dipende ATP-idrolisi per il movimento graduale su microtubuli. Pertanto, comprendono ATP e un sistema ATP rigenerante (contenente PEP e PK / LDH) nel 'test mix' (vedi Tabella 2).
      NOTA: ricombinante full-length S. pombe GFP-Cut7 (kinesin-5) è stato gentilmente fornito dal laboratorio Diez (Center for Molecular Bioingegneria, Technische Universität Dresden, Dresda, Germania), vedi. Ricombinante full-length istidina-marcato S. pombe GFP-Ase1 è stato gentilmente fornito dal laboratorio Jansons (Università di Wageningen, Wageningen, Paesi Bassi) e aggiunto al 'saggio mix' a concentrazioni a 80 Nm.

5. Imaging

NOTA: Durante l'esperimento, la crescita dei microtubuli può essere controllato variando la temperatura. Nella scelta delle condizioni di imaging, compromessi devono essere fatta tra immagini di alta qualità e la possibilità di monitorare l'assemblaggio del fuso per lunghi periodi di tempo. Per confrontare la cinetica di formazione del fuso in condizioni diverse, goccioline con differenti contenuti possono essere mescolati e ripreso nello stesso canale di flusso.

1. Impostazioni di imaging di base
   1. Immagine in un ambiente a temperatura controllata utilizzando una camera chiusa. Visualizzare i singoli microtubuli dopo ~ 30 minuti a 26 ° C. Mentre l'imaging, la promozione dei microtubuli crescita aumentando la temperatura fino a ~ 30 ° C.
      NOTA: I smpostazioni di seguito sono specifiche per il nostro setup microscopio e può variare con i diversi sistemi e software operativo diverso. Tutti i saggi descritti qui vengono esposte su un sistema invertito motorizzato con una testa confocale disco rotante e gestito utilizzando software di imaging come Andor iQ 3.1. Ottenere tutte le immagini con un obiettivo ad immersione 100X e fotocamera EMCCD.
   2. Impostare laser di eccitazione 488, 561 e 641 nm di intensità circa ~ 10%. Vai al pannello 'acquisizione', fare clic sulla scheda e laser slitta la 'AOTF' intensità al 10%. Clicca su 'record' per memorizzare le impostazioni.
   3. Per z -projections, prendere pile con 1 micron intervalli (~ 20 immagini / goccioline). Vai alla principale "camera 'del pannello, clicca su' Modifica z 'e impostare' passo Z 'a 1,0. Fare clic su' Next 'per memorizzare le impostazioni.
   4. Impostare lineare massima EM-gain facendo clic sulla scheda 'macchina fotografica' nel pannello 'acquisizione' e far scorrere la barra di guadagno EM a 300. esposizione Setvolte a 200 msec nella stessa scheda. Clicca su 'record' per memorizzare le impostazioni.
2. immagini dal vivo
   1. Per l'imaging dal vivo, utilizzando i controlli software rendono z -projections ogni 2 min. per la durata di 1-2 ore, riducendo i tempi di esposizione al ~ 100 msec. (come descritto in 5.1.4) e aumentare z -intervals a 2 micron (come descritto in 5.1.3). Impostare la serie storica nel pannello principale 'macchina fotografica', clicca su 'ripetizione t' e impostare a 2 min. intervalli per un tempo totale di 120 min.
   2. Per i saggi vivi, utilizzare una tazza PDMS invece di un normale flusso delle cellule per garantire che le goccioline sono immobile come possibile.
3. Imaging combinato di 2 Condizioni
   1. Produrre goccioline utilizzando microfluidica e memorizzare su di un vetrino PDMS rivestito su ghiaccio. Questo impedisce microtubuli nucleazione finché non viene formata la seconda serie di goccioline. Prima di produrre la seconda serie di gocce, lavare i tubi in PEEK e chip microfluidico conMRB80 e completamente ricarica chip microfluidico con il lipide / olio-fase.
   2. Generare goccioline con e senza destrano fluorescente (o usando destrano con differenti fluorofori lunghezza d'onda) per discriminare tra goccioline con diversi colori. Dopo aver prodotto il secondo lotto di goccioline, delicatamente mescolare le goccioline pipettando e caricare in un unico flusso celle / PDMS-tazza.
4. Image Analysis.
   1. Analizzare le immagini utilizzando Fiji (software open source disponibile online) ^34.
   2. Per i saggi dal vivo, convertire pile in hyperstacks utilizzando 'immagine' - 'hyperstacks' - 'stack per HyperStack'. Impostare il numero corretto di Z-fette e scadenze.
   3. Al fine di rendere z-proiezioni, scegliere 'immagine' - 'stack' - 'z-progetto'. Scegli proiezione 'intensità max'.
   4. Per 3D ricostruzioni, prima andare a 'immagine' - 'proprietà' e impostare il pixel corretto con, altezza dei pixel, profondità di voxel e frintervalli ame. Fare clic su 'OK'. Scegliere 'immagine' - 'pile' - 'progetto 3D', selezionare la casella 'interpolate' e cliccare su 'OK'.

Results

I metodi presentati nelle sezioni precedenti permettono la ricostituzione di strutture mandrino-come al crescere della complessità utilizzando il confinamento geometrico di acqua-in-olio di goccioline di emulsione. Questa sezione descrive i risultati rappresentativi che qualitativamente dimostrare la capacità di questi test.

Durante la mitosi, quando il fuso bipolare è assemblato, cellule completano a formare sfere con un diametro di circa 15 micron, come misurato per le cellule umane. Questa caratteristica forma cellulare mitotico fornisce un confine geometrico che sia limita e dirige le dimensioni del mandrino e l'orientamento ^35,36. Tecniche di microfluidica, forniscono un livello di confinamento geometrica che ricorda con precisione la situazione osservata nelle cellule viventi, e quindi permette la ricostruzione bottom-up di mandrini mitotico in vitro.

(Figura 4a, pannello di sinistra). Dopo circa 20-30 minuti, i primi microtubuli diventano visibili diffusione e centrosome diventa limitato come microtubuli crescono contro la corteccia in tutte le direzioni. Asters con microtubuli di lunghezza intermedia (circa il 50% del diametro delle gocce) possono (stericamente) respingono un'altra, con microtubuli spingendo contro l'altro, gli altri centrosomi e la corteccia. Ciò si traduce in una tipica disposizione mandrino come 'bipolare' con i due centrosomes opposti tra loro (figura 4a, pannello centrale). Quando microtubuli crescono più di ~ 50% della goccia-diametro, i centrosomi ottenere spinto ulteriormente al opposti confini della gocciolina, con microtubuli che crescono lungo la corteccia delle gocce (Figura 4a, pannello di destra). È importante notare che i tassi di crescita dei microtubuli in questi test sono molto sensibili alla temperatura e tubulina concentrazioni. Questi parametri saranno quindi influenzare fortemente il momento in cui nucleazione viene prima osservato e quando si raggiungono posizioni di aster steady-state.

Nelle cellule, le forze di trazione corticali sono generati attraverso la formazione di collegamenti portanti tra microtubuli plus-end e dynein Cortex-associata. In cellule animali, questa associazione dipende dal complesso Gαi / LGN / NuMA, che si rivolge alla membrana plasmatica tramite myristoylation N-terminale della Gαi ^1. In questi saggi ricostituzione, il requisito del complesso Gαi / LGN / NuMA viene bypassato accoppiando direttamente dynein di lipidi biotinilati attraverso laformazione di complessi biotina-streptavidina-biotina. Questi legami sono relativamente stabili (K _D ~ 10 ^-14 M) ³⁷ e formano rapidamente (di solito entro 10 min dopo la formazione dell'emulsione gocciolina, prima microtubuli nucleazione diventa evidente) (Figura 4b). In presenza di dineina corticale, centrosomes tipicamente mantengono una posizione più centrale, mentre in assenza di dineina, centrosomi sono spinti ai lati opposti della corteccia goccia (figura 4c). Abbiamo ragione per cui questo è il risultato di due effetti, che prevenire e contrastare le forze di microtubuli spingere. (1) Dynein promuove direttamente catastrofi microtubuli, limitando in tal modo la lunghezza dei microtubuli e prevenendo eccessiva deformazione dei microtubuli, e (2) forze di trazione corticali portare alla forza risultante di centraggio sulle singole astri ^8, che contrastano le forze di repulsione Aster-Aster.

Il diffusibile cross-linker Ase1 induce forces che tendono ad aumentare la regione di sovrapposizione dei microtubuli anti-parallele ^29. Coerentemente con questo, in presenza di Ase1 (e l'assenza di dineina) centrosomi si trovano vicini tra loro con Ase1 localizzazione di bundle microtubuli interpolari (Figura 4D). I membri della famiglia kinesin-5 auto separazione dei centrosomi, fornendo forze che spingono dall'interno del mandrino (vedi introduzione). In presenza di Cut7 (S. pombe chinesina-5 ortologo), centrosomi sono spinti a lati opposti delle goccioline di emulsione, anche in presenza di Ase1 (figura 4e). Grazie alla combinazione di generatori di forza corticali e inter-polari, il livello di complessità può essere ulteriormente aumentata in questi esperimenti, alla fine portano a una comprensione globale del montaggio mitotico fuso bipolare. Una descrizione quantitativa dettagliata di questi risultati saranno disponibili in futuro (Roth et al., Manoscritto in preparazione).

(Figura 5C). Questo facilita lo studio del comportamento sia stato stazionario e cinetica di montaggio del mandrino. Combinando goccioline con diversi contenuti nello stesso campione, è, ad esempio, possibile confrontare direttamente centrosoma posizionamento e montaggio del mandrino cinetica in goccioline con e senza generatori di forza corticali (Figura 5b).

Figura 1: forze agenti sul mitotica mandrino diverse molecole genera forza agiscono sui microtubuli del fuso mitotico per promuovere la formazione del fuso e posizionamento.. I microtubuli che crescono nella corteccia delle cellule generano una forza di spinta sul centrosoma. dineina corticale (viola) cattura microtubuli depolimerizzante e genera una forza di trazione sulle centrosomi. All'interno del mandrino, kinesin-5 proteine ​​motrici / Cut7 forniscono una forza di scorrimento verso l'esterno microtubuli anti-parallele, mentre cross-linkers della famiglia PRC1 / Ase1 generano un avversario verso l'esterno forza di scorrimento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .

Figura 2:. Microfluidic Chip Design (A) Progettazione di fotomaschere 4 pollici contenente 4 chip microfluidica. (B) Rappresentazione dettagliata di un singolo chip. Chips contengono un canale di uscita e tre canali di entrata seguita da una polvere filtro. canale di ingresso 1 contiene l'acqua-fase canale 2 lipide / fase oleosa e il canale 3 può essere utilizzato per diluire le goccioline formate con ulteriori lipidi / fase oleosa. (C) Rappresentazione dettagliati di giunzione in cui il lipide / fase oleosa (proveniente dalla parte superiore e inferiore) incontra con l'acqua-fase (proveniente da sinistra). Al bivio, goccioline formeranno e fluire verso il canale di uscita a destra. (D) la rappresentazione dettagliata di un polvere filtro con 2 micron canali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3:. Metodologia per la formazione di acqua-in-olio Emulsione gocciolina (A) chip microfluidico e tubi microfluidica su un microscopio in campo chiaro. Entrambi i tubi di acqua e lipidi / olio-fase sono collegate agli ingressi di chip 1 e 2 rispettivamente. (B) Restrizioni sul chip microfluidica in cui l'acqua e lipidi / olio-fasi si incontrano. Cambiando le pressioni, goccioline formato può essere controllato. (C) Design di portate cellule PDMS rivestite. Dopo aver caricato le goccioline nella cella a flusso, le estremità aperte vengono chiuse con ulteriori Valap. (D) Schema di formazione di goccioline. Goccioline vengono utilizzati per incapsulare centrosomi, tubulina e componenti aggiuntivi necessari per la formazione del fuso mitotico. (E) Schema del targeting corticale-dynein. Biotinilato (Bio) dynein si rivolge a lipidi biotinilati attraverso streptavidina (Strp).

Figura 4:. Risultati rappresentativi di mandrini-Reconstitutions con complessità crescente (A) proiezioni di massima intensità di goccioline contenenti due centrosomi che mostrano esempi di brevi, intermedi, e lungo i microtubuli. Centrosomi e microtubuli sono visualizzate con l'aggiunta di 10% HiLyte-488 marcato tubulina. Barre di scala = 10 micron. (B) Localizzazione di GFP-biotina-dynein-TMR in assenza (-, a sinistra) e la presenza (+, a destra) di streptavidina (Strp). Posizionamento (C) Microtubulo aster in assenza (-, a sinistra) o la presenza (+, a destra) della corticale GFP-biotina-dynein-TMR. (D) Microtubulo aster (pannello di sinistra, green) posizionamento in presenza di Ase1 (pannello centrale, rosso). (E) Microtubulo aster (pannello di sinistra, verde) il posizionamento in presenza di Ase1 e Cut7 (kinesin-5) (pannello centrale, rosso). Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Imaging Aster Posizionamento Dynamics in vitro (a) Progettazione di una tazza PDMS che permette l'imaging delle gocce per diverse ore.. (B) generazione, lo stoccaggio e l'imaging di goccioline (trasmessa) che contiene diversi contenuti, illustrate da assenza (a sinistra) inclusione (a destra) di destrano fluorescente (Alexa 647). (C) le immagini solo piano di un 60 min time-lapse (2 min intervalli) tratto da un z-stack (2 micron distanze) di annuncioroplet contenente un singolo centrosome. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

I metodi descritti sforzi qui presenti recenti per ricostituire fusi mitotici di base in acqua-in-olio di goccioline di emulsione. Studiando l'assemblaggio del fuso all'interno dei confini geometrici offre numerosi vantaggi. meccanismi importanti di feedback esistono tra microtubuli del fuso mitotico ei vincoli geometrici in cui sono assemblati. I microtubuli possono generare forze di spinta quando crescono in confini geometrici, che può risultare in spostamento fuso mitotico. Inoltre, cresce in una barriera fisica può indurre catastrofi microtubuli. Inoltre, del fuso entro una geometria confinato può portare ad un progressivo esaurimento delle singole componenti, come tubulina, che a sua volta influisce direttamente sulla velocità di crescita dei microtubuli ^36. Questi sono tutti fattori determinanti essenziali di assemblaggio del fuso, che possono essere studiati utilizzando i saggi descritti qui.

I saggi descritti sono molto sensibili alla piccola differe concentrazioneNCEs dei componenti di una goccia. Questo è il caso per la tubulina, in cui le differenze di concentrazione minori possono risultare in crescita troppo lento o troppo rapido microtubuli. In questo caso, i tassi di crescita microtubuli spesso possono ancora essere corrette regolando la temperatura durante il primo ~ 30 min dell'esperimento. del fuso mitotico e posizionamento è anche molto sensibile alle variazioni della concentrazione di generatori (corticale) di forza. Questo è probabilmente dipende dalla concentrazione, la purezza e l'attività dei componenti purificati e deve essere titolato con attenzione per ogni nuova proteina purificata.

Inoltre, alcuni compromessi devono essere effettuate in ambienti di imaging, a seconda della natura del saggio. Inizialmente, alti livelli di dimeri di tubulina fluorescenti solubili rendono difficile immagine singoli microtubuli. Come microtubuli si allungano e tubulina solubile è esaurito lentamente, il rapporto segnale-rumore diventa gradualmente più elevata e permette l'imaging del individuAl microtubuli. In contrasto con configurazioni con sistemi aperti, il confinamento geometrico impedisce lo scambio di molecole fluorescenti e componenti di sistema assorbitore di ossigeno all'interno di un serbatoio di massa, con conseguente sbiancamento significativo. Soprattutto per monitorare assemblaggio del fuso e posizionamento nel tempo, si richiede di immagine con basse intensità di luce, anche in presenza di un potente sistema di ossigeno scavenger.

Questi metodi consentono la ricostituzione bottom-up di semplificate strutture mandrino simili in vitro. Oltre ai componenti introdotti qui, molti altri fattori sono stati descritti da influenzare la formazione bipolare mandrino, posizionamento, orientamento, sagomatura, ecc ^3. Questo sistema può essere ulteriormente ampliato per studiare gli effetti individuali e combinati di generatori di forza aggiuntivi. contributori importanti per la formazione del fuso che sono attualmente assente da questo sistema sono i cromosomi mitotici. cromatina mitotico ha dimostrato diformazione diretta mandrino (1) chromokinesins che possono generare la cosiddetta 'forze polari-espulsione' ^3, (2) la formazione di un gradiente RanGTP dalla cromatina-bound RanGEF RCC1 ^38, (3) cinetocori che possono interagire con (depolimerizzante ) microtubuli ³⁹ e (4) la cromatina stessa, che può funzionare come una molla meccanica in-tra microtubuli opposte ^40.

Infine, il sistema descritto fornisce attualmente limitato controllo temporale e spaziale sull'attività e localizzazione di forza generatori introdotte. Nelle cellule, molti fattori di assemblaggio del fuso localizzano a compartimenti specifici o sono attivi all'interno di una finestra temporale limitata. Un esempio lampante è l'attività di dineina, che è specificamente arricchito sul lato posteriore del C. elegans una cellula embrionale per promuovere il posizionamento del mandrino asimmetrica e la divisione cellulare. In questo sistema, stiamo esplorando la possibilità di imitare tale tattività utilizzando metodi emporal e asimmetrici presi in prestito dalle tecniche opto-genetiche. Inoltre, come è il caso per la C. elegans embrione e cellule con una parete cellulare rigida, molte cellule non completano in mitosi. La forma del confinamento geometrica avrà un impatto fondamentale sulle forze che agiscono sul mandrino ^41. Sarà quindi importante ricostituire assemblaggio del mandrino e posizionamento nelle goccioline non sferiche e, potenzialmente utilizzando sistemi microfluidici più complessi che permettono di plasmare e la memorizzazione di emulsione di goccioline di ^42,43. Infine, nei tessuti, cellula-cellula e cellula-segnalazione substrato e attaccamento forniscono stimoli esterni che possono essere tradotti in orientamento del mandrino diretto, come spesso osservato in cellule epiteliali e le cellule staminali. Tutti questi aspetti specialistici non sono stati presi in considerazione in questo studio e potrebbe fornire le sfide del futuro per costruire verso più in vivo -come ricostruzioni di mitotico assemb mandrinoly e posizionamento.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Preparazione di chip microfluidici
Photomask (Fotomaschera su substrato di pellicola)	Selba S.A. Switzerland
SU-8 3025	MicroChem
Wafer di silicio (wafer di silicio da 4 pollici p/Boro < 1-0-0>10-20 Ω-cm, 500-550 μ m, SSP, con 2 piatti)	WRS Materiali	4P0SSP-005
Spin coater	Polo	SPIN150I
PDMS pre-polimero RVT615 A+B	Lubribond	9481
Trattamento corona	Prodotti elettrotecnici	BD-20ACV
2. Configurazione microfluidica
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DOPS (1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina)	Avanti Polar Lipids	840035
Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-( biotinil))	Avanti Lipidi polari	870285
Cloroformio	Sigma-Aldrich	650498
Pipette
vetro Tubi
Pompa a vuoto	Laboport	KNF
Camera a vuoto	Kartell	Polipropilene Essiccatore
a vuoto Olio minerale	Sigma-Aldrich	M5904
Tensioattivo (Span80)	Sigma-Aldrich	85548
Sonicatore	Branson	M2800H
Vetrini			coprioggetti 24 mm x 60 mm, spessore 1,5
Vetrini			26 mm x 76 mm
Perforatore	Harris Uni-Core	135840/135841/135843
Sigillatura da laboratorio film	Parafilm
Valap (vaselina, lanolina, cera di paraffina sciolta a concentrazioni uguali)			Microscopio a campo chiaro fatto in casa
	Leica	PMIRB	Qualsiasi campo chiaro invertito sarebbe sufficiente
Regolatore di pressione	Fluigent	MFCS-FLEX-4C-1000
Tubo in PEEK	Cluzeau Info. Labo, Francia
Fiale di microfluidica (Tubi Micrew 0,5 ml e 1 ml)	VWR, Paesi Bassi
3. Formazione e posizionamento del mandrino di ricostituzione
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10.000 MW, Anionic, Fixable)	Life Technologies
Tween-20	Sigma-Aldrich
BSA - Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich
Glucosio (D-(+)-Glucosio)	Sigma-Aldrich	G8270
Glucosio-ossidasi (Glucosio ossidasi da Aspergillus niger)	Sigma-Aldrich	G6125
DTT (DL-ditiolitolo)	Sigma-Aldrich	646563
Catalasi (Catalasi dal fegato bovino)	Sigma-Aldrich	C9322
Tubulina (Tubulina da cervello bovino)	Cytoskeleton Inc.
Tubulina-488/561 (Tubulina marcata con HiLyte-488/Rhodamine dal cervello suino)	Cytoskeleton Inc.
GTP (Guanosina-'5-trifosfato, sale sodico idrato)	Sigma-Aldrich	51120
κ-caseina (κ-caseina da siero di latte bovino)	Sigma-Aldrich	C0406
Airfuge (Ultracentrifuga ad aria)	Beckman-Coulter	CLS
4. Presentazione dei fattori di assemblaggio del mandrino
Name	>Azienda	Numero di catalogo	Comments
Neutravidin	Sigma-Aldrich	A2666
ATP (Adenosina-'5-trifosfato, sale disodico idrato)	Sigma-Aldrich	A9187
PEP (Acido fosfo(enol)piruvico sale monosodico idrato ≥ 97% (enzimatico))	Sigma-Aldrich	P0564
PK/LDH -(Piruvato chinasi/enzimi lattico deidrogenasi dal muscolo del coniglio)	Sigma-Aldrich	P0294