Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine ​​27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare il piccolo RNA interferente specifico della proteina da shock termico 27 (HSP27) per valutare la funzione di HSP27 durante la guarigione delle ferite epiteliali corneali. L'interferenza dell'RNA è il metodo migliore per abbattere efficacemente l'espressione genica per studiare la funzione delle proteine in vari tipi di cellule.

Abstract

Il piccolo RNA interferente (siRNA) è tra i metodi di interferenza dell'RNA più utilizzati per il silenziamento a breve termine di geni codificanti proteine. siRNA è un duplex di RNA sintetico creato per colpire specificamente un trascritto di mRNA per indurne la degradazione ed è stato utilizzato per identificare nuovi percorsi in vari processi cellulari. Esistono pochi studi sul ruolo della proteina da shock termico fosforilata 27 (HSP27) nella guarigione delle ferite epiteliali corneali. In questo caso, le cellule epiteliali corneali umane in coltura sono state suddivise in un gruppo trasfettato con siRNA di controllo criptato e in un gruppo trasfettato con siRNA specifico per HSP27. Sono stati quindi eseguiti saggi di ferita direzionale indotta da graffio, western blotting e citometria a flusso. Concludiamo che HSP27 ha un ruolo nella guarigione delle ferite epiteliali corneali che può comportare l'apoptosi e la migrazione delle cellule epiteliali. Qui vengono fornite descrizioni dettagliate della preparazione del campione e del protocollo di studio.

Introduzione

Corneali cellule epiteliali (PEC) sono continuamente capannone in film lacrimale, mentre sono allo stesso tempo sostituite da cellule del limbus e corneali strati basali epiteliali. ¹ vari fattori di stress estrinseci possono indurre l'apoptosi e desquamazione della CEC. ² Le proteine da shock termico (HSP) sono altamente conservati e possono essere suddivisi in due famiglie secondo dimensione molecolare. ³ la più grande famiglia HSP comprende HSP90, HSP70 e HSP60, e la famiglia più piccola comprende HSP27. ⁴ la fosforilazione di HSP27 è noto a svolgere un ruolo importante nella sopravvivenza cellulare ed è necessario per la migrazione delle cellule a causa del ruolo di questa proteina in actina rimodellamento. ^5-7 Pertanto, abbiamo cercato di verificare il ruolo potenziale di HSP27 fosforilazione nella migrazione CEC e l'apoptosi in un modello in vitro di cellule epiteliali guarigione della ferita.

RNA interference (RNAi) utilizzando sia piccoli o brevi RNA interferenti (siRNA) ha geinteressi nerated sia in biologia di base e applicata, in quanto consente potenzialmente l'espressione di un gene di interesse da abbattuto. ⁸ In ^questo, abbiamo usato specifici siRNA-HSP27 per valutare il contributo di HSP27 a CEC guarigione della ferita e l'apoptosi. i metodi tradizionali per RNAi gene knock-down in cellule utilizzano duplex RNA sintetici, tra cui due non modificati oligonucleotidi 21-mer che possono essere assemblati per creare siRNA. La RNAi siRNA che abbiamo usato in questo studio è un metodo semplice e molto efficace trasfezione le cellule, e questo reagente funziona con varie linee cellulari immortalizzate. In questo studio, abbiamo dimostrato i metodi utilizzati per questa analisi, tra cui un saggio di zero-indotta ferita direzionale, western blotting, saggio di transfezione siRNA, test di immunofluorescenza e citometria a flusso.

Protocollo

1. Cell Line

1. Culture 10 ⁶ umani corneali cellule epiteliali telomerasi-immortalata (HCECs) in un 6-pozzetti (densità: 1039,9 cellule / mm ²⁾ in un incubatore a 37 ° con un'atmosfera 5% di CO ₂ con terreno di crescita dell'epitelio bronchiale (BEGM) fino raggiungono il 95% di confluenza.

2. Analisi Western Blot dopo aver creato epiteliali Ferite Scratch

1. Streak uno sterile 200 ml punta della pipetta sulla superficie di un pozzo di confluenti HCECs coltivate quattro volte al piatto in un armadio di sicurezza biologica (Classe II, Tipo A2) e incubare HCECs separatamente in un incubatore a 37 ° con un CO ₂ atmosfera 5% per 1, 5, 10, 30, 60 e 120 min.
2. Utilizzare una piastra da 6 pozzetti per sei campioni differenti a seconda del tempo di incubazione dopo corneale ferimento epiteliale.
3. Lavare feriti monostrati HCEC tre volte con PBS 1x e quindi aggiungere 2,0 ml BEGM in ogni pozzetto.
4. Staccare HCECs utilizzando 2ml 0,25% di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) per pozzetto per 5 minuti, centrifugare a 900 xg per 5 minuti in una provetta da 15 ml, e aspirare tripsina-EDTA con una pipetta 1 ml.
5. Sospendere HCECs con 1 ml di PBS 1x e trasferirli in una provetta da 1,5 ml.
6. Centrifuga HCECs a 10.000 xg per 15 sec e aspirare 1x PBS utilizzando una pipetta 1 ml.
7. Risospendere HCECs in 100 microlitri tampone di lisi ghiacciata (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro [PMSF], inibitori della proteasi [1 micron pepstatina A, 1 pM leupeptina, e 0,1 pM aprotinina] e 0,5% Triton X-100 [pH 7]) e mescolare bene.
8. Incubare le cellule per 30 min in ghiaccio per indurre lisi cellulare.
9. lisati centrifugare a 4 ° C a 10.000 xg per 15 minuti, e poi il trasferimento a surnatanti freschi provette da 1,5 ml (90 aliquote microlitri) e conservarli a -80 ° C.
10. Determinare le concentrazioni di proteine ​​totali di lisati cellulari che utilizzano il pr Bradfordsaggio otein. ⁹
11. Carico 30 mg proteine ​​cellulari totali in un gel di acrilammide 10% o 12% di sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel (SDS-PAGE) e quindi elettroforesi trasferimento separate bande proteiche filtri di nitrocellulosa con una corrente di 200 mA per 1 ora a 4 ° C da utilizzare in saggi di Western blot.
12. Blocco di nitrocellulosa membrane filtranti con il 5% di latte scremato in soluzione salina Tris tamponata con Tween 20 (TBST) per 1 ora, aggiungere anticorpi policlonali di coniglio primaria contro i non-fosforilata HSP27 (1: 1.000 diluizione) o primaria anticorpo policlonale di coniglio contro fosforilata HSP27 (1 : 1.000 diluizione) in 5% di albumina di siero bovino (BSA), e incubare le membrane notte a 4 ° C su un agitatore.
13. Rileva bande immunoreattive con rafano anticorpi di capra anti-coniglio coniugati con perossidasi (1: 10.000) diluizione in 5% di BSA dopo il lavaggio per 10 minuti 3 volte con TBST.
14. Incubare la membrana nei reagenti luminol Western blotting (6-7 ml per 10 cm x 5 cm membrane) per 1 min a temperatura ambiente.
15. Rimuovere la membrana dalla soluzione del reagente, rimuovere il liquido in eccesso con un panno assorbente, e posto in un protettore foglio di plastica.
16. Lavorare in una stanza buia con una luce di sicurezza, posizionare la membrana ricoperta di una cassetta pellicola con il lato rivolto verso l'alto di proteine.
17. Posizionare pellicola a raggi X in cima a membrana ed esporre per 1 min.

3. siRNA Transfection Assay ¹⁰

1. HCECs Culture a 5 × 10 ⁵ cellule / pozzetto in una piastra da 6 pozzetti in un incubatore a 37 ° con un'atmosfera 5% CO ₂ utilizzando BEGM fino a raggiungere il 95% di confluenza.
2. Diluire il reagente di trasfezione (2.5 o 7.5 ml) con 100 ml riduzione media siero per trasfezione (il fattore di diluizione è 41 o 14.3) e sciogliere il HSP27-specifica e strapazzate controllo siRNA in 100 ml di medio siero ridotto per creare 10 o 50 nm di specifici HSP27 e si arrampicò di controllo siRNA.
3. Mescolare 100 μ; L soluzione siRNA con 100 microlitri di reagente diluito trasfezione (rapporto 1: 1) e incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente.
4. Aggiungere i complessi siRNA-lipidi alle cellule. Poi, dopo 4 mezzi di modifica ore per completare BEGM e incubare le cellule per 2 giorni a 37 ° C.
5. Analizzare le cellule trasfettate mediante western blotting, come descritto dalle sezioni da 4.1 a 4.7.

4. Western Blot test per celle siRNA-trasfettate ¹¹

1. Estrarre specifici HSP27 e strapazzate controllo HCECs siRNA-trasfettate in una cappa di sicurezza biologica con 100 microlitri tampone di lisi ghiacciata (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF), inibitori della proteasi, e 0,5% Triton X-100, pH 7).
2. Incubare le cellule per 30 min in ghiaccio per indurre lisi cellulare.
3. lisati pellet a 10.000 xg per 15 minuti e poi trasferire surnatanti di fresco 1,5 ml vascaes (90 microlitri aliquote) e conservarli a -80 ° C.
4. Determinare le concentrazioni di proteine dei lisati cellulari che utilizzano il Metodo di Bradford. ⁹
5. Caricare i campioni con la stessa quantità di proteine ​​cellulari totali su un gel di acrilammide 10% o 12%, sottopongono il gel di SDS-PAGE, e trasferire elettroforeticamente le bande proteiche separate su filtri di nitrocellulosa con una corrente di 200 mA per 1 ora a 4 ° C a utilizzare nei test Western blot.
6. Blocco membrane filtranti di nitrocellulosa con 5% di latte scremato in soluzione salina Tris tamponata con Tween 20 (TBST) per 1 ora, aggiungere anticorpi primari contro fosforilata e non fosforilata HSP27 (1: 1000 diluizione), fosforilata Akt (1: 1000 diluizione), non fosforilata Akt (1: 1000 diluizione, usato come marcatore sopravvivenza cellulare), Bcl-2 associata X proteina (1: 1000 diluizione, usato come una proteina pro-apoptotica) e gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH; 1 : 200 diluizione, usato come controllo di carico) in 5% di albumina di siero bovino (BSA), eincubare le membrane notte a 4 ° C su un agitatore.
7. Rileva bande immunoreattive con rafano anticorpi di capra anti-coniglio coniugati con perossidasi (1: 10.000) diluizione in 5% di BSA dopo il lavaggio 3 volte con TBST, 10 minuti ogni lavaggio.
8. Incubare la membrana nei reagenti luminol Western blotting (6-7 ml per 10 cm cm x 5 cm membrane) per 1 min a temperatura ambiente.
9. Rimuovere la membrana dalla soluzione del reagente, rimuovere il liquido in eccesso con un panno assorbente, e posto in un protettore foglio di plastica.
10. Lavorando in una stanza buia con una luce di sicurezza, posizionare la membrana coperto in una cassetta pellicola con il lato rivolto verso l'alto proteine.
11. Posizionare pellicola per raggi X sulla parte superiore della membrana ed esporre per 1 min.

5. Scratch-indotta direzionale Ferimento test di valutazione della migrazione delle cellule ¹²

1. In una cappa di sicurezza biologica, fare una ferita trascinando una punta di pipetta sterile attraverso la superficie di un pozzo di culture confluenti dispecifici HSP27 siRNA-trasfettate o HCECs siRNA-trasfettate controllo strapazzate.
2. Subito dopo il ferimento, lavare le cellule due volte con 1x tampone fosfato salino (PBS) e mantenerli nelle culture BEGM in un incubatore a 37 ° con un CO ₂ atmosfera 5% per 24 ore dopo il ferimento.
3. Fotografare immagini HCEC utilizzando un microscopio in posizione verticale a ingrandimento 100X 24 ore dopo il ferimento ed eseguire sfondo appiattimento utilizzando il filtro comando nel software di analisi delle immagini.
4. Utilizzando il comando SELECT Misure, definire l'area di interesse (AOI), con la stessa forma poligonale dimensioni che possono coprire perpendicolarmente da un capo all'altro della ferita iniziale, e determinare tre diversi AOI nella zona ferita di ciascun campione.
5. contare automaticamente il numero di cellule in ogni campo usando il conteggio / Dimensioni opzioni di menu Misura.

6. flusso Analisi Citometria di Apoptosis

1. Cultura HSP27-specifici siRNA-trasfettate e controllo sHCECs contenenti ciascuna 10 nM siRNA iRNA-trasfettate ad una concentrazione di 5 x 10 ⁵ cellule / pozzetto in piastre da 6 pozzetti fino a quando le cellule raggiungono il 95% di confluenza in un incubatore a 37 ° con CO ₂ atmosphere 5% in BEGM.
2. Sfilare HCECs utilizzando 2 ml 0,25% tripsina-EDTA per pozzetto per 5 minuti, centrifugare a 900 xg per 5 minuti in una provetta da 15 ml, e aspirare tripsina-EDTA con una pipetta 1 ml.
3. Lavare le cellule due volte con PBS freddo e risospendere le cellule in 1x tampone (0,1 M HEPES / NaOH [pH 7,4], 1.4 M NaCl, e 25 mM CaCl ₂₎ rilegatura ad una concentrazione di 10 ⁶ cellule / ml.
4. Trasferire 100 microlitri sospensione cellulare (1 x 10 ⁵ cellule) in una provetta 5 ml.
5. Aggiungere 5 ml di fluoresceina isotiocianato coniugato annessina V e 5 ml ioduro di propidio.
6. Delicatamente vortice le cellule e incubare per 15 min a temperatura ambiente al buio.
7. Aggiungere 200 ml di 1x tampone di legame a ciascuna provetta e analizzare le cellule da un flusso cytometer entro 1 ora.

Risultati

L'espressione di HSP27 fosforilata significativamente aumentata a 5, 10, e 30 minuti dopo il ferimento zero confrontato con HCECs illesi ^13. Analisi Western Blot ha rivelato che l'espressione di HSP27 fosforilata e fosforilata Akt sono stati entrambi significativamente ridotto, mentre l'espressione di Bax era significativamente aumentata in HCECs siRNA-trasfettate specifici Hsp27 (Figura 1A-E). L'espressione HSP27 fosforilata è stato ridotto del 30% e del 40% ...

Discussione

In questo studio, abbiamo valutato il potenziale ruolo di HSP27 nel wounding epiteliale corneale utilizzando approcci in vitro . I passaggi critici hanno riguardato la trasfezione di siRNA per il knock-down di HSP27 per osservare la funzione di HSP27 nelle cellule sottoposte a stress. In particolare, un ruolo per HSP27 è stato rivelato da questi esperimenti nella migrazione delle cellule epiteliali e nell'apoptosi durante la guarigione delle ferite epiteliali corneali. A differenza degli studi precedenti^10<...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cabina di sicurezza biologica	CHC LAB Co., Ltd,  Daejeon, Repubblica di Corea	CHC-777A2-06	Classe II, Tipo A2
Thermo	Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA		RNAi siRNA; siRNA di controllo criptato e siRNA specifico per HSP27
BEGMTM	Lonza, Inc., Walkersville, MD	CC-3171, CC4175	Terreno di crescita dell'epitelio bronchiale
Inibitore della proteasi	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	P8340, P7626	1 μ M Pepstatina A, 1 μ M Leupeptina, 0,1 μ M Saggio
	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	#500-0001	Saggio delle proteine di Bradford
Filtri nitrocellulosici	Amersham, Little Chalfont, Regno Unito	RPN3032D	Membrana di blotting
occidentale HSP27 non fosforilata	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab12351	Diluizione 1:1.000 (HSP27 totale)
HSP27 fosforilata (Ser85)	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab5594	Diluizione 1:1.000 HSP27 è stata fosforilata a Ser85
Lipofectamina® Reagente RNAiMAX	Invitrogen, Carlsbad, CA	13-778-075	Reagente di trasfezione
Akt fosforilato (Ser473)	Tecnologia di segnalazione cellulare, Danvers, MA	n. 4060	Diluizione 1:1.000 Akt è stato fosforilato a Ser473 (marcatore di sopravvivenza cellulare)
Akt non fosforilato	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	n. 4061	Diluizione 1:1.000 (Total Akt)
Proteina X associata a Bcl-2	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	No. 4062	1:1.000 (marcatore proteico anti-apoptotico)
GAPDH	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	No. 4063	1:1.000 marcatore di controllo del carico (gene housekeeping)
Anticorpi anti-coniglio di capra coniugati con perossidasi di rafano	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	NCI1460KR	diluizione 1:10.000
OPTI-MEM	Invitrogen, Carlsbad, CA	31985	terreno sierico ridotto per trasfezione
Software di analisi delle immagini	Olympus, Inc., Tokyo, Giappone	Image-Pro Plus 5.0
Latte scremato in polvere	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germania	T145.2
Tris	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0497
Cloruro di sodio	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0241
Piastra di coltura a sei pozzetti	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	140675	pozzetti di diametro 35,00 mm / pozzetto
	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	142475
Agitatore orbitale	N-Bioteck, Inc., Seoul, Corea del Sud	NB1015
Albumina sierica bovina	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2323
BDFACSCantoTM II	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ		citometria a flusso
	Kodak, Rochester, NY		Cassetta a raggi X medica con schermo verde 400
reagente luminol western blotting	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2048
Kit di rilevamento dell'apoptosi dell'annessina V FITC I	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ	556547