Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare il piccolo RNA interferente specifico della proteina da shock termico 27 (HSP27) per valutare la funzione di HSP27 durante la guarigione delle ferite epiteliali corneali. L'interferenza dell'RNA è il metodo migliore per abbattere efficacemente l'espressione genica per studiare la funzione delle proteine in vari tipi di cellule.
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Articolo metodologico
Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine 27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il piccolo RNA interferente (siRNA) è tra i metodi di interferenza dell'RNA più utilizzati per il silenziamento a breve termine di geni codificanti proteine. siRNA è un duplex di RNA sintetico creato per colpire specificamente un trascritto di mRNA per indurne la degradazione ed è stato utilizzato per identificare nuovi percorsi in vari processi cellulari. Esistono pochi studi sul ruolo della proteina da shock termico fosforilata 27 (HSP27) nella guarigione delle ferite epiteliali corneali. In questo caso, le cellule epiteliali corneali umane in coltura sono state suddivise in un gruppo trasfettato con siRNA di controllo criptato e in un gruppo trasfettato con siRNA specifico per HSP27. Sono stati quindi eseguiti saggi di ferita direzionale indotta da graffio, western blotting e citometria a flusso. Concludiamo che HSP27 ha un ruolo nella guarigione delle ferite epiteliali corneali che può comportare l'apoptosi e la migrazione delle cellule epiteliali. Qui vengono fornite descrizioni dettagliate della preparazione del campione e del protocollo di studio.
Introduzione
Corneali cellule epiteliali (PEC) sono continuamente capannone in film lacrimale, mentre sono allo stesso tempo sostituite da cellule del limbus e corneali strati basali epiteliali. 1 vari fattori di stress estrinseci possono indurre l'apoptosi e desquamazione della CEC. 2 Le proteine da shock termico (HSP) sono altamente conservati e possono essere suddivisi in due famiglie secondo dimensione molecolare. 3 la più grande famiglia HSP comprende HSP90, HSP70 e HSP60, e la famiglia più piccola comprende HSP27. 4 la fosforilazione di HSP27 è noto a svolgere un ruolo importante nella sopravvivenza cellulare ed è necessario p....
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Protocollo
1. Cell Line
- Culture 10 6 umani corneali cellule epiteliali telomerasi-immortalata (HCECs) in un 6-pozzetti (densità: 1039,9 cellule / mm 2) in un incubatore a 37 ° con un'atmosfera 5% di CO 2 con terreno di crescita dell'epitelio bronchiale (BEGM) fino raggiungono il 95% di confluenza.
2. Analisi Western Blot dopo aver creato epiteliali Ferite Scratch
- Streak uno sterile 200 ml punta della pipetta sulla superficie di un pozzo di confluenti HCECs coltivate quattro volte al piatto in un armadio di sicurezza biologica (Classe II, Tipo A2) e incubare HCECs separatamente in u....
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Risultati
L'espressione di HSP27 fosforilata significativamente aumentata a 5, 10, e 30 minuti dopo il ferimento zero confrontato con HCECs illesi 13. Analisi Western Blot ha rivelato che l'espressione di HSP27 fosforilata e fosforilata Akt sono stati entrambi significativamente ridotto, mentre l'espressione di Bax era significativamente aumentata in HCECs siRNA-trasfettate specifici Hsp27 (Figura 1A-E). L'espressione HSP27 fosforilata è stato ridotto de.......
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Discussione
In questo studio, abbiamo valutato il potenziale ruolo di HSP27 nel wounding epiteliale corneale utilizzando approcci in vitro . I passaggi critici hanno riguardato la trasfezione di siRNA per il knock-down di HSP27 per osservare la funzione di HSP27 nelle cellule sottoposte a stress. In particolare, un ruolo per HSP27 è stato rivelato da questi esperimenti nella migrazione delle cellule epiteliali e nell'apoptosi durante la guarigione delle ferite epiteliali corneali. A differenza degli studi precedenti10<.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari o esclusive in qualunque materiale o metodi citati in questo studio.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dalla Student Research Grant (13-14) dell'Università di Ulsan College of Medicine, Seoul, Corea e una borsa di studio (2014-464) presso l'Istituto di Scienze della Vita Asan, Seoul, Corea.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cabina di sicurezza biologica | CHC LAB Co., Ltd, Daejeon, Repubblica di Corea | CHC-777A2-06 | Classe II, Tipo A2 |
| Thermo | Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | RNAi siRNA; siRNA di controllo criptato e siRNA specifico per HSP27 | |
| BEGMTM | Lonza, Inc., Walkersville, MD | CC-3171, CC4175 | Terreno di crescita dell'epitelio bronchiale |
| Inibitore della proteasi | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | P8340, P7626 | 1 μ M Pepstatina A, 1 μ M Leupeptina, 0,1 μ M Saggio |
| Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | #500-0001 | Saggio delle proteine di Bradford | |
| Filtri nitrocellulosici | Amersham, Little Chalfont, Regno Unito | RPN3032D | Membrana di blotting |
| occidentale HSP27 non fosforilata | Abcam Inc., Cambridge, MA | ab12351 | Diluizione 1:1.000 (HSP27 totale) |
| HSP27 fosforilata (Ser85) | Abcam Inc., Cambridge, MA | ab5594 | Diluizione 1:1.000 HSP27 è stata fosforilata a Ser85 |
| Lipofectamina® Reagente RNAiMAX | Invitrogen, Carlsbad, CA | 13-778-075 | Reagente di trasfezione |
| Akt fosforilato (Ser473) | Tecnologia di segnalazione cellulare, Danvers, MA | n. 4060 | Diluizione 1:1.000 Akt è stato fosforilato a Ser473 (marcatore di sopravvivenza cellulare) |
| Akt non fosforilato | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | n. 4061 | Diluizione 1:1.000 (Total Akt) |
| Proteina X associata a Bcl-2 | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | No. 4062 | 1:1.000 (marcatore proteico anti-apoptotico) |
| GAPDH | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA | No. 4063 | 1:1.000 marcatore di controllo del carico (gene housekeeping) |
| Anticorpi anti-coniglio di capra coniugati con perossidasi di rafano | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | NCI1460KR | diluizione 1:10.000 |
| OPTI-MEM | Invitrogen, Carlsbad, CA | 31985 | terreno sierico ridotto per trasfezione |
| Software di analisi delle immagini | Olympus, Inc., Tokyo, Giappone | Image-Pro Plus 5.0 | |
| Latte scremato in polvere | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germania | T145.2 | |
| Tris | Amresco LCC, Inc. Solon, OH | No-0497 | |
| Cloruro di sodio | Amresco LCC, Inc. Solon, OH | No-0241 | |
| Piastra di coltura a sei pozzetti | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | 140675 | pozzetti di diametro 35,00 mm / pozzetto |
| Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | 142475 | ||
| Agitatore orbitale | N-Bioteck, Inc., Seoul, Corea del Sud | NB1015 | |
| Albumina sierica bovina | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA | sc-2323 | |
| BDFACSCantoTM II | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | citometria a flusso | |
| Kodak, Rochester, NY | Cassetta a raggi X medica con schermo verde 400 | ||
| reagente luminol western blotting | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA | sc-2048 | |
| Kit di rilevamento dell'apoptosi dell'annessina V FITC I | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 556547 |
Riferimenti
- Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. Corneal epithelial wound healing. Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).
- Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. Apoptosis in shed human corneal cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).
- Guay, J., et al.
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Ristampe e permessi
