Articolo metodologico

Spazi di giunzione intercellulare di comunicazione: un biomarker funzionale per valutare gli effetti avversi dei tossici e tossine, e benefici per la salute di prodotti naturali

DOI:

10.3791/54281

⸱

25 dicembre 2016

 ,  , 
1Department of Pediatrics & Human Development, Institute for Integrative Toxicology, Michigan State University, 2RECETOX — Research Centre for Toxic Compounds in the Environment, Faculty of Science, Masaryk University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive una tecnica di trasferimento di carico bisturi-colorante fluorescente che misura la comunicazione intercellulare attraverso i canali gap junction. Gap giunzionale comunicazione intercellulare è un importante processo cellulare attraverso il quale l'omeostasi tissutale è mantenuto e la rottura di questa segnalazione cellulare ha effetti negativi sulla salute.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un bisturi loading fluorescente trasferimento della tintura tecnica (SL-DT) che misura la comunicazione intercellulare attraverso canali di giunzione gap, che è un importante processo intercellulare attraverso cui omeostasi tessuto sia conservato. Interruzione di spazi di giunzione comunicazione intercellulare (GJIC) di sostanze tossiche, tossine, farmaci, ecc è stato collegato a numerosi effetti negativi sulla salute. Molte malattie umane genetiche basata sono state legate a mutazioni in geni gap junction. La tecnica SL-DT è un semplice saggio funzionale per la valutazione simultanea GJIC in una grande popolazione di cellule. Il test prevede cellule pre-caricamento con un colorante fluorescente perturbando brevemente la membrana cellulare con una lama di bisturi attraverso una popolazione di cellule. Il colorante fluorescente è quindi consentito di attraversare attraverso canali di giunzione gap celle adiacenti per un tempo designato. Il saggio viene quindi interrotta mediante aggiunta di formalina alle cellule. La diffusione del fluocolorante fluore- attraverso una popolazione di cellule è valutato con un microscopio a epifluorescenza e le immagini vengono analizzate con qualsiasi numero di pacchetti software morfometrici che sono disponibili, tra cui pacchetti di software libero presenti sul dominio pubblico. Questo test è stato adattato per gli studi in vivo utilizzando fette di tessuto da vari organi da animali trattati. In generale, il dosaggio SL-DT può servire una vasta gamma di esigenze farmacologiche e tossicologiche in vitro, e può essere potenzialmente adatto per sistemi set-up high throughput con l'imaging microscopia a fluorescenza automatizzato e analisi di chiarire più campioni in un tempo più breve.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una tecnica semplice, completo e relativamente poco costoso per valutare i potenziali tossicità di composti. Questo è un approccio in vitro che possono essere utilizzati in molteplici linee cellulari. laboratori di biologia delle cellule standard dotate di microscopi epifluorescenza possono condurre una ricerca utilizzando questo test.

La nostra conoscenza di base delle funzioni cellulari è stato fortemente dipendente test biologici in vitro, ed è diventato una componente essenziale nelle valutazioni tossicologiche dei prodotti farmaceutici, inquinanti ambientali e contaminanti alimentari nato. Purtroppo, non esiste un unico sistema in vitro nel saggio biologico che può ampiamente soddisfare le richieste di tutte le valutazioni tossicologiche. Molti test in vitro sono progettati e ottimizzati per valutare e valutare uno specifico endpoint biochimica o molecolare. Questi sono spesso combinati in un flusso elevato impostato per riflettere una perturbazione di uncerto trasduzione del segnale, come ad esempio recettore per gli estrogeni segnalazione 1. Questa strategia ha avuto un discreto successo, ma il vasto numero di vie di trasduzione del segnale coinvolti nella espressione genica rende il compito di scegliere un percorso di segnalazione specifica per valutare abbastanza complessa. Alte protocolli through-put sono attualmente in fase di sviluppo e utilizzati per misurare simultaneamente numerose vie di segnalazione, che è stato uno approccio per superare alcuni dei limiti dei singoli test. Tuttavia, non tutte le vie di segnalazione sono stati inseriti con successo in approcci più completi, oltre a nuove vie di segnalazione sono costantemente scoperto che complica ulteriormente il processo di valutazione. Utilizzando i numeri ampi di approcci in vitro, particolarmente elevato through-put sistemi, per le valutazioni tossicologiche complete sono anche molto costosi e non sono favorevoli alla più unico investigatore condotto progetti di ricerca.

GJIC è un processo tightly controllato da variazioni di tensione, concentrazione di calcio, pH, redox equilibrio, regolamentati da importanti vie di trasduzione del segnale intracellulare e le interazioni con la membrana e citoscheletro proteine 2,3. Quindi, l'inibizione della GJIC può riflettere i diversi tipi di stress cellulare, interruzione delle diverse funzioni cellulari, o perturbazioni di diverse vie di trasduzione del segnale. Un altro approccio per superare l'uso di limitate biosaggi trasduzione del segnale è di sfruttare i fenomeni biologici che molti, se non la maggior parte, trasduzione del segnale sono ulteriormente modulati da sistemi di segnalazione intercellulari cooperativi attraverso canali gap junction 4-8. Sebbene i sistemi di segnalazione intercellulari sono anche numerose e sotto controllo percorso multiplo, la segnalazione intercellulare attraverso canali di giunzione gap è in definitiva una funzione dei canali essendo aperto, parzialmente chiusa o completamente chiusa. Questo fornisce un punto finale che può essere facilmente misurata utilizzando diversinei sistemi di saggi biologici in vitro 7. Considerando che il set point di un tessuto omeostatico richiede canali aperti, determinare l'effetto dei composti su spazi di giunzione comunicazione intercellulare (GJIC) è un approccio più completo nel determinare i potenziali effetti tossici dei composti 4,8. In sostanza, questo fenomeno biologico fondamentale che svolge un ruolo centrale nel coordinamento più eventi di trasduzione del segnale che controllano l'espressione genica permette una ampia valutazione degli effetti tossici. Così, test biologici che valutano GJIC sono un ottimo punto di partenza per valutare il potenziale tossicità dei composti.

I più estese tecniche utilizzate per valutare GJIC sono basati su precarico cellule con una sonda fluorescente e poi per controllare la migrazione del colorante dalla cella caricato o celle alle celle adiacenti. Tecniche per precaricare il colorante hanno coinvolto microiniezione 9, raschiare carico 10, e metilici esteri delle sonde 11 . Il bisturi loading fluorescente trasferimento della tintura metodo (SL-DT) è una modifica del carico raschiatura - colorante assay transfer sviluppato da El Fouly 10. Piuttosto che il raschiare più invasivo, il metodo bisturi carico di questo rapporto implica un dolce rotolo di un bisturi con lama circolare attraverso un monostrato di cellule che riducano al minimo i danni invasiva (Figura 1). I vantaggi di questa tecnica sono la valutazione tossicologica di una popolazione di cellule piuttosto che singole cellule del dosaggio microiniezione. Inoltre, la semplicità di questo test consente la rapida rilevazione di più lastre in breve tempo mentre i metodi che utilizzano tecniche di microiniezione e tecniche che utilizzano gli esteri metilici di sonde fluorescenti sono significativamente più tempo e richiedono livello di abilità notevolmente superiore.

Anche se non esiste un unico metodo per soddisfare tutte le esigenze di studio GJIC; il saggio SL-DT è un test semplice, piuttosto economico e versatile che puòsoddisfare molte delle esigenze per le valutazioni iniziali di tossicità di vari composti. I principali vantaggi sono: semplicità, senza particolare bisogno di attrezzature o le competenze che sono necessarie per altri metodi come la microiniezione, recupero fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) analisi e attivazione locale di saggi sonda fluorescente molecolare, una valutazione rapida e simultanea di GJIC in una grande numero di cellule, favorisce un alto rendimento set-up con imaging di fluorescenza automatizzata microscopia ed analisi, nonché la sua adattabilità per studi in vivo.

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Protocollo

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Il protocollo per questo studio è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo dei National Institutes of Health Sciences del Giappone, che è dove in vivo esperimenti sono stati fatti, per assicurare che i ratti sono stati trattati umanamente e con riguardo per alleviare le sofferenze.

1. SL-DT Bioassay

  1. Seed 3 x 10 5 WB-F344 cellule epiteliali di fegato di ratto Onto 35 piastre di coltura mm di diametro contenenti Eagles modificati medie più il 5% di siero fetale bovino, e cultura le cellule in un incubatore a 37 ° C, 100% di umidità relativa (RH), 5% CO 2.
  2. Culture cellule fino a raggiungere il 100% di confluenza (tipicamente, 2 giorni) e condurre il trattamento sperimentale desiderata delle cellule come descritto di seguito.
    1. Condurre esperimenti Dose Response
      1. Aggiungere 10 ml e 20 ml di una mM soluzione madre di fenantrene 2 in 100% acetonitrile e 4 ml, 6 ml e 8 ml di una soluzione di 20 mM magazzino di phenanthrene in 100% acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di coltura per ogni volume aggiunto di soluzione madre.
      2. Aggiungere 4 ml, 6 microlitri, 8 microlitri, 10 microlitri, e 20 pl di una soluzione 100% di acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di coltura per ogni volume aggiunto di soluzione di acetonitrile per servire come controllo del veicolo.
      3. Incubare le piastre per 15 minuti in un incubatore a 37 ° C, 100% UR e 5% CO 2.
      4. Passare al punto 1.3.
    2. Comportamento Tempo Esperimenti di risposta
      1. Aggiungere 7 ml di una soluzione madre mM di fenantrene in 100% acetonitrile 20 a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di crescita per ciascun punto di tempo (cioè, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min).
      2. Aggiungere 7 ml di 100% acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di crescita per ciascun punto di tempo per servire come controllo del veicolo.
      3. Incubare le piastre per ogni tempo designato pmista in un incubatore a 37 ° C, 100% UR e 5% CO 2.
      4. Passare al punto 1.3.
    3. Condurre esperimenti tempi di recupero
      1. Aggiungere 7 ml di una soluzione madre mM di fenantrene in 100% acetonitrile 20 a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di coltura per 15 min.
      2. Aggiungere 7 ml di 100% acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di coltura per 15 min per servire come controllo del veicolo.
      3. Decantare il mezzo contenente sia il fenantrene o acetonitrile e risciacquare 3x ciascuno con 3 ml di tampone fosfato salino (PBS).
      4. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura fresco per ciascuna piastra e incubare per i tempi di recupero desiderati (cioè, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) in un incubatore a 37 ° C, 100 % UR e 5% di CO 2.
      5. Passare al punto 1.3.
    4. Condurre esperimenti Meccanismo
      1. Aggiungere l'inibitore trasduzione del segnale, vale a dire
      2. Aggiungere 5 ml di 100% acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di coltura per 15 min per servire come controllo del veicolo.
      3. Aggiungere 7 ml di una soluzione madre mM di fenantrene in 100% acetonitrile 20 a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di crescita più la D609 per altri 15 min.
      4. Aggiungere 7 ml di 100% acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di crescita più l'acetonitrile 100% per altri 15 min per servire come controllo del veicolo.
      5. Passare al punto 1.3.
  3. Eliminare il terreno di coltura da una delicatezza travaso del mezzo o per aspirazione sotto vuoto.
    Nota: Smaltire terreno di coltura contenente rifiuti pericolosi in modo appropriato.
  4. Lavare le cellule tre volte ciascuno con 3 ml di PBS e sia decantare o aspirare between risciacqua.
  5. Pipettare 1 ml di 1 mg / ml Lucifer colorante giallo disciolto in PBS (LY) in ciascuna piastra di cella.
  6. Precaricare il colorante nelle cellule da dolci un # 20 lama in acciaio chirurgico con un bordo arrotondato attraverso una popolazione di cellule in tre diverse aree della piastra.
    1. Iniziare mettendo bisturi perpendicolare (angolo di 90 °) e 5 mm dal bordo della piastra di coltura, e quindi scorrere il bisturi da questo angolo perpendicolare a circa un angolo di 15 ° (vedere Figura 1).
      Nota: Questo si ottiene pizzicando la bisturi tra il dito indice e il pollice. Utilizzare gravità per consentire il bisturi per andare delicatamente dalle 90 ° a 15 ° posizione (come la lama arrotondata rotola semplicemente sulle celle). Questo movimento lascerà una linea di rientro visivamente evidente.
  7. Incubare le cellule con la soluzione LY per 3 minuti a temperatura ambiente.
  8. Decantare o aspirare il LY e sciacquare tre volte con 3 ml di PBS per rimuovere tutti extracellular tingere di eliminare sfondo extracellulare fluorescenza.
  9. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di formalina tamponata al 10% per fissare le cellule.
    Nota: Dopo aver fissato in formalina, asciugare le cellule e conservare al buio per un massimo di due anni con photobleaching minima del colorante LY. Quando richiesto, reidratare con formalina al 10% per visualizzare il fronte del colorante fluorescente.
  10. Mostra le cellule fissate utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato di un cubo dicroico per i picchi di eccitazione / emissione di 428/536 nm con un ingrandimento di 200X. Allineare tutte le piastre in modo che la linea di rientro è parallelo al campo visivo orizzontale.
    Nota: Un cubo FITC dicroico funziona bene.
    1. Acquisire l'immagine di una telecamera CCD e il software di supporto.
      1. Aprire il software di supporto per la fotocamera CCD e utilizzare le impostazioni per l'esposizione automatica. Utilizzare il pulsante "cattura" per acquisire digitalmente l'immagine. Salvare l'immagine come tif file utilizzando il tasto "Salva".

2. Adattamento del SL-DT test di tessuto epatico

  1. Rimuovere circa una fetta 2 x 2 cm dal lobo sinistro del fegato da un 5 settimane di età, di sesso maschile Fischer 344 ratti utilizzando forbici dissezione e posizionarlo su una plastica pesare piatto coperto con una garza bagnata 12.
  2. Pipettare 0,5 ml di una soluzione di PBS contenente 1 mg / ml ciascuna di Lucifero targa gialla e rodamina-destrano (RD) sulla superficie della fetta fegato in plastica peso.
    Nota: La RD è un colorante che non può attraversare canali giunzione gap e segnerà le cellule che sono state caricate.
  3. Effettuare tre a cinque incisioni lunghe circa 1 cm sulla superficie della fetta fegato che ha la soluzione colorante nel piatto di pesatura con una lama tagliente e quindi aggiungere ulteriori colorante sufficiente per riempire le incisioni.
  4. Incubare il tessuto per 3 minuti a temperatura ambiente sulla plastica pesare piatto.
  5. Risciacquare tre volte con 5 ml di PBS.
  6. Fissare il tessuto overnight in 30 ml di 10% tampone fosfato di formalina in un tubo da 50 ml conica per centrifuga al buio a temperatura ambiente.
  7. Il giorno seguente, lavare le fette con l'acqua, tagliare il tessuto intorno al incisione con dissezione forbici in 1 x 1 x 0,5 centimetri 3 strisce e quindi utilizzare le tecniche standard per incorporare le fette in paraffina 13.
  8. Sezione le fette perpendicolari alla linea di incisione di spessore di 5 micron e conservare i campioni al buio fino al momento di essere ripreso utilizzando tecniche di sezionamento standard con un microtomo 13.
  9. Utilizzare un microscopio a epifluorescenza dotato di una fotocamera digitale CCD di visualizzare e catturare le immagini dei fronti colorante fluorescente secondo la sezione 1.10 7.

3. Quantificare GJIC

  1. Misurare la diffusione colorante fluorescente utilizzando un pacchetto morfometrica software (ad esempio, ImageJ).
    1. Fare clic sulla scheda "File" e poi su "Apri" per aprire laimmagine salvata.
    2. Clicca su "strumento Free Hand" nella barra degli strumenti Tab per tracciare il contorno del fronte del colorante.
    3. Fare clic sulla scheda "Analizza" e quindi su "Misura".
      Nota: Questo genererà un valore di area in un foglio di calcolo, che può essere copiato in altri programmi di foglio elettronico se lo si desidera.
  2. Utilizzando un foglio di calcolo, calcolare la frazione del controllo (FOC) dividendo l'area di diffusione colorante nel piatto sperimentale per la superficie colorante viaggiato nella piastra di controllo utilizzando la seguente equazione:
    figure-protocol-1
    A = area e della diffusione di colorante in cellule esposte ad una variabile sperimentale, come le cellule trattate con una sostanza chimica in una dose o tempo specifico
    A c = area della diffusione colorante nel controllo, che sono cellule trattate con il veicolo usato per sciogliere la sostanza chimica di interesse
    Nota: Per determinare l'effetto del veicolo,A e sarebbe l'area di diffusione colorante nelle cellule trattate con il veicolo e A c sarebbe l'area di diffusione colorante in cellule non trattate con il veicolo. L'effetto del veicolo dovrebbe essere preferibilmente inferiore al 10%.

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Risultati

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Interruzione di GJIC è stato ampiamente utilizzato come biomarker per l'identificazione di composti tossici a, il livello epigenetico non genotossica di controllo gene che induce effetti negativi sulla salute 14. Ad esempio, idrocarburi aromatici policiclici (PAH) sono contaminanti ubiquitari dell'ambiente ma variano nelle loro tossicità epigenetiche in funzione delle loro strutture molecolari 15. I PAH di peso molecolare inferiore si trovano tipicamente a concentra...

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Discussione

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Il saggio SL-DT è una tecnica semplice e versatile in misura GJIC, ma ci sono diverse preoccupazioni critiche che dovrebbero essere contabilizzati nella progettazione di adeguati protocolli sperimentali. Per misurazioni affidabili di GJIC utilizzando il test SL-DT ci deve essere una buona diffusione tintura della LY attraverso giunzioni delle cellule. Come minimo, un tempo adeguato deve essere scelto per assicurare che il colorante si diffonde attraverso otto o più righe di celle dalle cellule bisturi caricata in entram...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Supportato dalle sovvenzioni NIEHS #R01 ES013268-01A2, e i contenuti sono di esclusiva responsabilità dell'autore e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali del NIEHS, e supportati dal progetto CETOCOEN UPgrade No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
WB-F344 Cellule epiteliali del fegato di rattoDai dottori J. W. Grisham e M. S. Tsao dell'Università della Carolina del Nord (Chapel Hill, NC)Nessunafornita dai dottori J. W. Grisham e M. S. Tsao Università della Carolina del Nord-Chapel Hill-NC
Piastre di coltura da 35 mmCorning430165
fiasche di coltura da 25 cm2Corning430639
Fiasche da coltura da 75 cm2Corning430641
D-medium, un terreno modificato da Eagles...ThermoFisher/GIBCO Formula n. 78-5470EF
siero fetale bovinoThermoFisher/GIBCO 10437
0,25% tripsina-EDTA ThermoFisher/GIBCO 15050
soluzione salina tamponata con fosfatofatta in casavedi sotto per l'ingrediente cat #137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4
KClJT Baker - Mallinckrodt 3040-01
NaClJT Panettiere - Mallinckrodt3624-05
Na2HPO4JT Baker - Mallinckrodt 3819--01
KH2PO4JT Panettiere - Mallinckrodt 3246-01
Lucifero Giallo CH, sale di litioSigma-Aldrich ChemicalL0259
rodamina-destranoSigma-Aldrich ChemicalR9379
1-metilantraceneSigma-Aldrich Chemical
fenantreneSigma-Aldrich ChemicalP11409
resveratroloSigma-Aldrich ChemicalR5010
D609Tocris Bioscience 1437
acetonitrilEMDAX0145-1
soluzione al 37% formaldeideJT Baker - Mallinckrodt 2106-01
#20 lama chirurgicaFine Science Tools Inc.10317-14
Provette sterili coniche da 50 mlThermo scientific 
Microscopio a epifluorescenza Nikon Nikon -Mager ScientificEclipse TE300
Nikon FITC cubo dicroicoNikon -Mager Scientific96107
CCD cameraNikon -Mager ScientificNikon Cool Snap EZ sistema di imaging CCD
Nikon -Mager Scientific NikonNIS-Elements F2.2.
ImageJIstituto Nazionale di Sanitàhttp://imagej.nih.gov/ij/
339652

Riferimenti

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Gap Junctional Intercellular CommunicationScalpel Loading Fluorescent Dye TransferLucifer Yellow Dye TransferEpifluorescence MicroscopyPhenanthrene Toxicity AssayCell Membrane PerturbationDye Migration AnalysisToxicant Effects AssessmentIn Vitro ToxicologyFunctional Biomarker Assay

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