Questo protocollo descrive una tecnica di trasferimento di carico bisturi-colorante fluorescente che misura la comunicazione intercellulare attraverso i canali gap junction. Gap giunzionale comunicazione intercellulare è un importante processo cellulare attraverso il quale l'omeostasi tissutale è mantenuto e la rottura di questa segnalazione cellulare ha effetti negativi sulla salute.
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Articolo metodologico
Spazi di giunzione intercellulare di comunicazione: un biomarker funzionale per valutare gli effetti avversi dei tossici e tossine, e benefici per la salute di prodotti naturali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive un bisturi loading fluorescente trasferimento della tintura tecnica (SL-DT) che misura la comunicazione intercellulare attraverso canali di giunzione gap, che è un importante processo intercellulare attraverso cui omeostasi tessuto sia conservato. Interruzione di spazi di giunzione comunicazione intercellulare (GJIC) di sostanze tossiche, tossine, farmaci, ecc è stato collegato a numerosi effetti negativi sulla salute. Molte malattie umane genetiche basata sono state legate a mutazioni in geni gap junction. La tecnica SL-DT è un semplice saggio funzionale per la valutazione simultanea GJIC in una grande popolazione di cellule. Il test prevede cellule pre-caricamento con un colorante fluorescente perturbando brevemente la membrana cellulare con una lama di bisturi attraverso una popolazione di cellule. Il colorante fluorescente è quindi consentito di attraversare attraverso canali di giunzione gap celle adiacenti per un tempo designato. Il saggio viene quindi interrotta mediante aggiunta di formalina alle cellule. La diffusione del fluocolorante fluore- attraverso una popolazione di cellule è valutato con un microscopio a epifluorescenza e le immagini vengono analizzate con qualsiasi numero di pacchetti software morfometrici che sono disponibili, tra cui pacchetti di software libero presenti sul dominio pubblico. Questo test è stato adattato per gli studi in vivo utilizzando fette di tessuto da vari organi da animali trattati. In generale, il dosaggio SL-DT può servire una vasta gamma di esigenze farmacologiche e tossicologiche in vitro, e può essere potenzialmente adatto per sistemi set-up high throughput con l'imaging microscopia a fluorescenza automatizzato e analisi di chiarire più campioni in un tempo più breve.
Introduzione
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una tecnica semplice, completo e relativamente poco costoso per valutare i potenziali tossicità di composti. Questo è un approccio in vitro che possono essere utilizzati in molteplici linee cellulari. laboratori di biologia delle cellule standard dotate di microscopi epifluorescenza possono condurre una ricerca utilizzando questo test.
La nostra conoscenza di base delle funzioni cellulari è stato fortemente dipendente test biologici in vitro, ed è diventato una componente essenziale nelle valutazioni tossicologiche dei prodotti farmaceutici, inquinanti ambient....
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Protocollo
Il protocollo per questo studio è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo dei National Institutes of Health Sciences del Giappone, che è dove in vivo esperimenti sono stati fatti, per assicurare che i ratti sono stati trattati umanamente e con riguardo per alleviare le sofferenze.
1. SL-DT Bioassay
- Seed 3 x 10 5 WB-F344 cellule epiteliali di fegato di ratto Onto 35 piastre di coltura mm di diametro contenenti Eagles modificati medie più il 5% di siero fetale bovino, e cultura le cellule in un incubatore a 37 ° C, 100% di umidità relativa (RH), 5% CO 2.
- Culture cellule fino a raggiung....
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Risultati
Interruzione di GJIC è stato ampiamente utilizzato come biomarker per l'identificazione di composti tossici a, il livello epigenetico non genotossica di controllo gene che induce effetti negativi sulla salute 14. Ad esempio, idrocarburi aromatici policiclici (PAH) sono contaminanti ubiquitari dell'ambiente ma variano nelle loro tossicità epigenetiche in funzione delle loro strutture molecolari 15. I PAH di peso molecolare inferiore si trovano tipicamente a concentra.......
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Discussione
Il saggio SL-DT è una tecnica semplice e versatile in misura GJIC, ma ci sono diverse preoccupazioni critiche che dovrebbero essere contabilizzati nella progettazione di adeguati protocolli sperimentali. Per misurazioni affidabili di GJIC utilizzando il test SL-DT ci deve essere una buona diffusione tintura della LY attraverso giunzioni delle cellule. Come minimo, un tempo adeguato deve essere scelto per assicurare che il colorante si diffonde attraverso otto o più righe di celle dalle cellule bisturi caricata in entram.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Supportato dalle sovvenzioni NIEHS #R01 ES013268-01A2, e i contenuti sono di esclusiva responsabilità dell'autore e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali del NIEHS, e supportati dal progetto CETOCOEN UPgrade No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| WB-F344 Cellule epiteliali del fegato di ratto | Dai dottori J. W. Grisham e M. S. Tsao dell'Università della Carolina del Nord (Chapel Hill, NC) | Nessuna | fornita dai dottori J. W. Grisham e M. S. Tsao Università della Carolina del Nord-Chapel Hill-NC |
| Piastre di coltura da 35 mm | Corning | 430165 | |
| fiasche di coltura da 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Fiasche da coltura da 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| D-medium, un terreno modificato da Eagles... | ThermoFisher/GIBCO | Formula n. 78-5470EF | |
| siero fetale bovino | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0,25% tripsina-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| soluzione salina tamponata con fosfato | fatta in casa | vedi sotto per l'ingrediente cat # | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Panettiere - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Panettiere - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifero Giallo CH, sale di litio | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rodamina-destrano | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-metilantracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| fenantrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrolo | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| soluzione al 37% formaldeide | JT Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 lama chirurgica | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| Provette sterili coniche da 50 ml | Thermo scientific | ||
| Microscopio a epifluorescenza Nikon | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC cubo dicroico | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ sistema di imaging CCD | |
| Nikon -Mager Scientific Nikon | NIS-Elements F2.2. | ||
| ImageJ | Istituto Nazionale di Sanità | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Riferimenti
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S.
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Ristampe e permessi
Tag
Trasferimento di colorante fluorescente tramite caricamento con bisturitrasferimento di colorante Lucifer Yellowmicroscopia a epifluorescenzasaggio di tossicità del fenantreneperturbazione della membrana cellulareanalisi della migrazione del colorantevalutazione degli effetti dei tossicantitossicologia in vitrosaggio di biomarcatori funzionali
