Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all'interno di matrice extracellulare

Summary

Questo manoscritto descrive una tecnica di litografia morbida a base di ingegnerizzare matrici uniformi di tridimensionale (3D) tessuti epiteliali di geometria definita circondati da matrice extracellulare. Questo metodo è suscettibile di una grande varietà di tipi di cellule e contesti sperimentali e consente di high-throughput screening di replicati identici.

Abstract

L'architettura degli organi ramificati come i polmoni, i reni e le ghiandole mammarie nasce attraverso il processo di sviluppo della morfogenesi ramificata, che è regolata da una varietà di segnali solubili e fisici nel microambiente. Qui descritto è un metodo creato per studiare il processo di morfogenesi ramificata formando tessuti epiteliali tridimensionali ingegnerizzati (3D) di forma e dimensioni definite che sono completamente incorporati all'interno di una matrice extracellulare (ECM). Questo metodo consente la formazione di array di tessuti identici e consente il controllo di una varietà di fattori ambientali, tra cui la geometria dei tessuti, la spaziatura e la composizione della ECM. Questo metodo può anche essere combinato con tecniche ampiamente utilizzate come la microscopia a forza di trazione (TFM) per ottenere maggiori informazioni sulle interazioni tra le cellule e la MEC circostante. Il protocollo può essere utilizzato per studiare una varietà di processi cellulari e tissutali oltre alla morfogenesi ramificata, inclusa l'invasione del cancro.

Introduction

Lo sviluppo dei tessuti epiteliali ramificati, noto come ramificazione morfogenesi, è regolata da, e fattori ambientali fisici derivati ​​dalle cellule. Nella ghiandola mammaria, branching morfogenesi è un processo iterativo attraverso il quale guidata migrazione cellulare collettiva crea un'architettura ad albero. Il primo passo è la formazione gemma primaria dai condotti del latte, seguita da iniziazione ramo e l'allungamento ^1,2. Invasione delle filiali in stroma circostante è indotta dal rilascio sistemico di ormoni steroidei alla pubertà. Nuovi germogli primarie poi iniziano dalle estremità dei rami esistenti, e questo processo continua a crea....

Protocol

1. preparazione di soluzioni

1. Per preparare un 5 mg / ml soluzione di insulina, diluire l'insulina magazzino in polvere con 5 mm di acido cloridrico (HCl) in DH ₂ O (500 mg di insulina in 100 ml di solvente). Preparare 100 ml di solvente con l'aggiunta di 50 ml di HCl concentrato a 100 ml di acqua distillata (DH ₂ O).
2. Per fare una soluzione 1x di PBS, diluire la soluzione madre 10x tampone fosfato (PBS) a 1x con dH ₂ O in condizioni sterili.
3. Preparare il polidimetilsilossano (PDMS) elastomero soluzione come segue: mescolare il prepolimero PDMS insieme con il catalizzatore in un rapporto di 10: 1 (....

Results

Schematica generale di mammaria microfabrication tessuto epiteliale

Uno schema generale della procedura microfabbricazione illustra il flusso di lavoro sperimentale è mostrato in Figura 1. Il risultato finale è un array di tessuti epiteliali della geometria identica e spaziatura che sono completamente incorporati all'interno di un gel ECM. Un esperimento rappresentativo utilizza EpH4 topo cellule epiteliali mammarie coltivate.......

Discussion

Il protocollo sopra descritto delinea un metodo per produrre tessuti epiteliali identici di forma predefinita, consentendo il controllo spaziale dello stress meccanico sperimentato dalle cellule del tessuto. Uno stampo elastomerico viene utilizzato per creare cavità nel collagene di tipo I che vengono poi riempite con cellule epiteliali e ricoperte da uno strato aggiuntivo di collagene in modo che le cellule siano completamente incapsulate in un ambiente di matrice di collagene 3D. L'ulteriore coltura di questi tessuti e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polidimetilsilossano (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
Agente indurente	PDMS Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
Master in silicone litograficamente modellato	autoprodotto	N/A
Pesa in plastica	Fisher Scientific	08-732-115
Piastre di Petri da 100 mm di diametro	BioExpress	D-2550-2
Alcool etilico 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200	Preparare una soluzione di EtOH al 70% (v:v) miscelandola con dH2O
Rasoio	di sicurezza americano	620179
1:1 Dulbecco' s Aquila modificata' s Mezzo : Ham' s Miscela di nutrienti F12 (DMEM/F12) (1:1)	Siero di iclone	SH30023FS
fetale bovino (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H
10x Hank' Life	Technologies	14185-052
Insulina	Sigma Aldrich	I6634-500MG
Gentamicina	Life Technologies	15750-060
10x Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Fisher Scientific	BP399-500
Idrossido di sodio (NaOH)	Sigma Aldrich	221465-500G
Bovino collagene di tipo I (non pepsinizzato)	Koken	IAC-50
Albumina da siero bovino (BSA)	Sigma Aldrich	A-7906
Pinzetta curva in acciaio inossidabile	Dumont	7
piastre per colture tissutali da 35 mm di diametro	BioExpress	T-2881-6
Provette coniche da 15 ml	BioExpress	C-3394-2
1,5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube	USA Scientific	1615-5500
Vetrini coprioggetti circolari #1, diametro 15 mm Bellco	Glass Inc.	Ordine
0,05% 1x Tripsina-EDTA	Life Technologies	25300-054
Paraformaldeide	VWR	100503-916
Triton X-100	Perkin Elmer	N9300260	Detergente
HGF	Sigma Aldrich	H 9661	Risospeso in dH2O a 50 mg/ml
Coniglio anti-topo FAK anticorpo	Life Tecnologie	AMO0672
Capra anti-coniglio Alexa 488 anticorpo	Life Technologies	A-11034
Adobe Photoshop	Adobe	N/A	Utilizzato per la codifica a colori delle mappe di frequenza dei pixel.
FIJI (ImageJ)	NIH n	/A	Software gratuito di analisi delle immagini utilizzato per la soglia, la registrazione e la sovrapposizione di immagini per creare una mappa di frequenza dei pixel. Il plug-in StackReg è stato utilizzato per la registrazione di immagini binarie.