Caratterizzazione delle derivate da monociti cellule dendritiche umane di Citometria a Flusso Imaging: un confronto tra due protocolli di isolamento dei monociti

Summary

Questo studio confronta due diversi metodi di isolamento dei monociti umani per ottenere cellule dendritiche (DC) in vitro. I monociti vengono selezionati per adesione o arricchiti negativamente per separazione magnetica. La resa e la vitalità dei monociti, insieme alla vitalità dell'MDDC, alla proliferazione e all'espressione del marcatore di superficie CD11c/CD14 saranno confrontate tra i due metodi.

Abstract

Le cellule dendritiche (DC) sono cellule presentanti l'antigene del sistema immunitario che svolgono un ruolo cruciale nelle risposte dei linfociti, nei meccanismi di difesa dell'ospite e nella patogenesi dell'infiammazione. L'isolamento e lo studio delle DC sono stati importanti nella ricerca biologica a causa delle loro caratteristiche distintive. Sebbene siano mediatori chiave essenziali del sistema immunitario, le DC sono molto rare nel sangue, rappresentando circa lo 0,1-1% delle cellule mononucleate totali del sangue. Pertanto, le alternative per i metodi di isolamento si basano sulla differenziazione delle DC dai monociti isolati dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). L'utilizzo di tecniche di isolamento adeguate che combinano semplicità, convenienza, elevata purezza e alta resa delle celle è imperativo da considerare. Nel presente studio, verranno confrontati due metodi distinti per la generazione di DC. I monociti sono stati selezionati per aderenza o arricchiti negativamente utilizzando la procedura di separazione magnetica seguita dal differenziamento in DC con IL-4 e GM-CSF. La vitalità, la proliferazione e il fenotipo dei monociti e dell'MDDC sono stati valutati utilizzando coloranti di vitalità, saggio MTT e analisi dei marcatori di superficie CD11c/CD14 mediante citometria a flusso di imaging. Sebbene il metodo di separazione magnetica abbia prodotto una percentuale significativamente più alta di monociti con una maggiore capacità proliferativa rispetto al metodo di adesione, i risultati hanno dimostrato la capacità di entrambe le tecniche di generare contemporaneamente monociti in grado di proliferare e differenziarsi in MDDC CD11c+ vitali dopo sette giorni di coltura. Entrambi i metodi hanno prodotto > 70% di MDDC CD11c+. Pertanto, i nostri risultati forniscono intuizioni che contribuiscono allo sviluppo di metodi affidabili per l'isolamento e la caratterizzazione delle DC umane.

Introduction

Le cellule dendritiche (DC) sono mediatori essenziali del sistema immunitario innato e adattativo. La loro funzione di indurre risposte immunitarie primari e facilitare lo sviluppo della memoria immunologica. Queste cellule sono i principali responsabili per la cattura l'antigene, la migrazione e la stimolazione delle cellule T e sono quindi indicati per le cellule presentanti l'antigene come professionali (APC) ¹ .Manipulation delle DC potrebbe essere utilizzato in una vasta gamma di settori di ricerca e in ambito clinico per il trattamento di diverse malattie infiammatorie come l'HIV ^6,7, il cancro, le malattie autoimmuni ^{8 9,} e le risposte allergiche ^10. DC sono anche utilizzati per la ricerca abuso di sostanze al fine di risolvere i meccanismi sconosciuti e percorsi, come quelli associati con la dipendenza da alcol ^11-14, tossicodipendenza ^13,15, e la combinazione di infezione da HIV e abuso di sostanze ^16-19. Questi studi in corso e studi di ricerca future In campo dell'immunologia fare in vitro generazione delle DC estremamente importante per la ricerca. Tuttavia, vi sono diverse difficoltà legate isolare cellule dendritiche dal sangue umano come costituiscono solo lo 0,1 - 1% delle cellule totali mononucleari del sangue ^20.

Ad oggi, alcune delle tecniche comunemente per la generazione di cellule dendritiche in vitro costituito da plastica o vetro aderenza dei monociti ^21,22, densità centrifugazione in gradiente ^23, specifica separazione basato marcatore come cellula magnetica attivato smistamento ^22, fluorescente cellule attivate classificare ^24, selezione positiva dei monociti CD14 + utilizzando nanoparticelle magnetiche rivestite destrano ^25, e un rapido isolamento dei monociti altamente purificati mediante selezione cellulare negativa completamente automatizzato ^26. Tuttavia, il miglior metodo di scelta rimane controverso. Pertanto, per migliorare le tecniche di generazione di DC, vari metodi sono stati sviluppati in cuila purezza di queste cellule può essere notevolmente aumentata di differenziazione da cellule CD34 + progenitrici purificati e monociti isolati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) ^27. Come accennato prima, un metodo ampiamente utilizzato e popolare per la generazione di monociti derivati da cellule dendritiche (MDDCs) è quello di esplorare la capacità dei monociti di aderire al vetro o plastica (metodo di aderenza) ^21,22,27. Il metodo aderenza è un metodo rapido e semplice che non richiede l'uso di attrezzature complesse. Tuttavia, alcuni svantaggi di questo processo includono contaminazione linfociti, scarsa flessibilità, e monociti manipolazione transitoria ^28. Un metodo alternativo al metodo aderenza è l'isolamento magnetico di monociti da PBMC totali, in particolare con l'uso di un kit monociti arricchimento umano, che è progettato per isolare monociti da PBMC da selezione negativa ^26. Durante questa procedura, le cellule indesiderate sono mirati per la rimozione con tetramericcomplessi di anticorpi e particelle magnetiche rivestite destrano. Il vantaggio di questo metodo di isolamento è che le cellule marcate indesiderate vengono separati usando un magnete mentre le cellule bersaglio possono essere liberamente versato fuori in un nuovo tubo senza bisogno di colonne. Ad oggi, con la disponibilità di specifici anticorpi monoclonali che possono etichettare popolazioni cellulari unici, la tecnica di separazione magnetica è diventata non semplicemente un ulteriore metodo, ma una necessità per l'isolamento di cellule rare nel campo della immunologia. Per esempio, tecniche come la cellula magnetica ordinamento con disponibili in commercio paramagnetiche MACS-nanoparticelle hanno facilitato lo sviluppo di nuovi approcci per la ricerca e applicazioni cliniche ^22,29. Inoltre, studi recenti ricerche che confrontano generazione DC dai metodi monociti aderenza e la tecnologia MACS hanno dimostrato una maggiore purezza DC e la vitalità usando MACS monociti ^22,30 separati.

I regali studioun confronto tra due metodi per la generazione di cellule dendritiche umane da monociti isolati da PBMC: 1) isolamento monociti da aderenza e 2) isolamento dei monociti di selezione negativa utilizzando un kit commerciale monociti arricchimento umano. Questo studio fornisce la prova per dimostrare che la procedura di selezione separazione magnetica negativa per isolare monociti genera il più alto rendimento dei monociti senza differenze significative nei monociti vitalità se confrontato con monociti isolati con il metodo di aderenza. A sua volta, dopo sette giorni, i monociti isolati da separazione magnetica differenziate in MDDCs con significativamente più alta capacità proliferativa e una maggiore quantità di cellule che esprimono doppio positivo (+ CD11c / CD14 +) fenotipo senza influenzare MDDC vitalità. Nel complesso, questo studio si differenzia dai precedenti studi citati sopra in quanto dimostra la capacità di entrambe le tecniche per generare simultaneamente monociti che sono in grado di proliferare e differenziarsi in CD11c +MDDCs (> 70%) dopo sette giorni di coltura senza compromettere la loro vitalità. Inoltre, l'attuale approccio fornisce per la prima volta la caratterizzazione di differenti CD11c / CD14 popolazioni MDDCs dal flusso di imaging citometria.

In sintesi, poiché DC giocano un ruolo centrale riguardante la ricerca nel campo della immunologia, diversi parametri devono essere presi in considerazione quando si considera come sono derivate e quali metodi sono utilizzati per isolare e cultura li in vitro. Pertanto, questo studio mira a fornire approfondimenti su due diversi metodi di isolamento dei monociti e di come questi metodi influenzano in modo differenziale monociti vitalità e la resa alla fine colpisce la vitalità delle cellule dendritiche, la proliferazione, e fenotipo. Questi risultati contribuiranno notevolmente al campo della immunologia e forniranno un protocollo dettagliato di DC isolamento, purificazione e caratterizzazione.

Protocol

studi del sangue umano complessivi sono stati esaminati e approvati dal Institutional Review Board (IRB) di FIU, protocollo IRB approvazione # IRB-13-0440. leukopaks umani sono stati acquistati dalla banca del sangue comunità in Miami, FL.

1. Isolamento di PBMC da Tecnica gradiente di densità standard

1. Eseguire una diluizione 1: 1 di sangue con soluzione salina 1x-tampone fosfato in un pallone T75.
2. Pipettare 15 ml di soluzione gradiente di densità in 50 ml provette da centrifuga e accuratamente strato (25 - 30 ml / provetta) del sangue diluito su tutto questo gradiente.
3. Centrifugare per 20 minuti a 1200 xg con accelerazione e decelerazione 1 0.
4. Dopo la centrifugazione, raccogliere lo strato di interfaccia (globuli bianchi) in un nuovo 50 ml provetta da centrifuga e lavare le cellule due volte in PBS (3 min a 1.080 xg). Gettare il surnatante ogni volta.
5. Trattare le cellule con ammonio-cloruro di potassio-lisi (ACK) tampone (per la lisi dei globuli rossi). Aggiungere 10 ml di tampone e incubate per 15 min a 4 ° C.
6. Lavare le cellule due volte con PBS, centrifugare per 3 min a 1.080 xg ed eliminare il surnatante ogni volta.
7. Salvare il pellet, che conterrà i PBMC.
8. Procedere con metodo di purificazione dei monociti di scelta.

2. Purificazione monociti secondo il metodo Aderenza

1. Preparare completa mezzo di coltura cellulare contenente L-glutammina (300 mg / ml) ed addizionato con penicillina (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) e 10% siero fetale bovino.
2. Lasciare PBMC di aderire per circa 2 ore dalla loro coltura in una beuta T75 ad una concentrazione di 5 x 10 ⁷ cellule per 10 ml di mezzo completo a 37 ° C e 5% CO ₂ in un incubatore umidificato.
3. Dopo l'incubazione, rimuovere le cellule galleggianti non aderenti dal pallone di coltura e lavare delicatamente cellule aderenti due volte con PBS.
4. Incubare cellule aderenti in mezzo completo di coltura cellulare integrato con 2 microlitri / ml di granulociti-MACR umanaophage fattore stimolante le colonie (GM-CSF) e l'interleuchina 4 (IL-4) conservato a uno stock concentrazione di 10 mg / ml.
5. Modificare la metà del mezzo e ricostituire le citochine ogni 48 ore.
6. Lasciare 5 - 7 giorni per la differenziazione dei monociti in MDDCs.

3. monociti Purificazione mediante metodo di separazione magnetica

1. Raccogliere PBMC di tecnica gradiente di densità standard, versare in una provetta di polistirene da 5 ml e risospendere in tampone PBS ad una concentrazione di cellule / ml.
2. Aggiungere cocktail monociti arricchimento umano per mezzo di 50 ml / ml cellule, mescolare bene e incubare a 4 ° C per 10 min.
3. Dopo l'incubazione, aggiungere particelle magnetiche che utilizzano 50 ml / ml cellule, mescolare bene e incubare a 4 ° C per 5 min.
4. Portare sospensione cellulare fino ad un volume totale di 2,5 ml aggiungendo tampone PBS, mescolare bene pipettando su e giù 2 - 3 volte.
5. Posizionare il tubo di polistirene senza un tappo nel dispositivo magnetico e mettere da parte a temperatura ambiente per 2.5 minuti.
6. Dopo l'incubazione e in un unico movimento continuo, prendere il magnete e versare la frazione dei monociti purificata desiderato in un tubo da 50 ml centrifugazione pulito.
7. Incubare cellule aderenti in mezzo completo di coltura cellulare integrato con 2 ml / ml di granulociti-macrofagi fattore stimolante le colonie (GM-CSF) umana e l'interleuchina 4 (IL-4) conservato a uno stock concentrazione di 10 mg / ml.
8. Ogni 48 ore, cambia la metà del mezzo, spin down a 1.080 xg per 5 minuti e risospendere pellet con nuovi media (CRPMI) e citochine.
9. Lasciare 5 - 7 giorni per la differenziazione dei monociti in MDDCs.

4. Trypan Blue Esclusione vitalità Assay

Nota: Utilizzare questa tecnica per ottenere la resa delle cellule e la vitalità di PBMC, monociti, e MDDCs.

1. Celle di raccolta che utilizzano standard di tripsina-EDTA ed eseguire lavaggi dei fiaschi e il pellet cellulare in PBS. A seconda delle dimensioni del pellet, risospendere in 5 a 10 ml di PBS per dissolvere il pellet.
2. In un tubo micro-centrifuga, eseguire una diluizione 1: 1 di trypan reagente blu con pellet cellulare diluito.
3. Da questo mix, aliquote 10 ml in una cella contando scivolo e leggere i risultati utilizzando un contatore di cellule automatizzato secondo il protocollo del produttore. Se un contatore di cellule automatizzato non è disponibile, una conta cellulare simile è possibile utilizzando un emocitometro o un contatore manuale.

5. MTT Assay

1. Cellule piastra a una concentrazione di 4 x 10 ^4/100 ml di completo supporto in ciascun pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Consentire 24 ore per le cellule per regolare alla cultura.
2. Incubare ed effettuare letture a 0 rispettivamente (giorno 0), 36 (giorno 3) e 84 ore (giorno 7).
3. Al termine della incubazione desiderato, rimuovere i supporti e sostituire con 100 microlitri di PBS solo.
4. Preparare 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio soluzione bromuro (MTT) (5 mg / ml) aggiungendo 10 ml di Dimethyl solfossido (DMSO) per 1 g di sodio dodecil solfato (SDS).
5. Aggiungere 10 ml (5 mg / ml) di soluzione MTT ad ogni pozzetto ed incubare a 37 ° C per 2 ore aggiuntive.
6. Dopo l'incubazione, rimuovere surnatanti che contengono PBS e la miscela di MTT non convertito (soluzione di colore giallo-colore).
7. Aggiungere 100 ml di soluzione di SDS-DMSO ad ogni pozzetto e incubare per un'ora supplementare.
8. Leggere l'assorbanza a 540 nm usando un lettore di micropiastre.

6. cellulari di superficie colorazione Analisi per Imaging citometria a flusso

1. Dopo 7 giorni di differenziazione da monociti purificati, dispensare 1x10 ⁶ aliquote cellulari delle cellule dendritiche derivate da monociti nel numero appropriato di provette da 1,5 ml.
2. Inizia la colorazione della superficie cellulare da parte delle cellule bloccando con 50 ml di calore inattivati ​​(HI) siero umano, incubare a 4 ° C per 10 min.
3. Dopo l'incubazione, le cellule centrifugare a 720 xg per 5 minuti, scartare il surnatante.
4. Alla cella pellet, aggiungere rispettivi anticorpi coniugati a fluorocromi (es, anti-CD11c o anti-CD14) e incubare a 4 ° C per 20 minuti al riparo dalla luce. In tubi separati, preparare singoli fluorocromi macchiato di campioni / ml) in quanto sono necessari per la compensazione.
5. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte in 1 ml di tampone PBS e centrifugare per volta a 720 xg per 5 min.
6. Mantenere le cellule al riparo dalla luce, ri-sospendere in tampone PBS alla concentrazione di cellule / 100 microlitri per citometria a flusso.
7. Al fine di cancello cellule vitali, aggiungere 1 ml di DAPI ad ogni provetta prima di acquisire le cellule sul singolo flusso di imaging cellulare citometria strumento secondo le istruzioni del produttore.

7. Analisi statistica

1. Ingresso tutti i dati in un foglio di calcolo.
2. Confrontare i risultati con t-test dello studente e / o ANOVA a seconda dei casi.
3. Considerare differenze statisticamente significativo se p <0.05.

Results

Monociti Resa dalla separazione magnetica è superiore rispetto a monociti Resa secondo il metodo Aderenza

I dati presentati in Figura 1 mostra PBMC e conta delle cellule monociti dal metodo di esclusione del trypan blue alla data di isolamento delle PBMC e separazione dei monociti. In media, monociti isolati con il metodo aderenza rappresentato circa il 6,2 per cento di PBMC totali, mentre mon...

Discussion

Sulla base delle note difficoltà di isolare e generando MDDCs dal sangue umano, il presente studio ha lo scopo di fornire un confronto completo dei due metodi consolidati per la generazione di MDDCs. Il primo metodo rispetto è un metodo tradizionale consolidata per generare MDDCs sfruttando la capacità dei monociti di aderire al vetro o plastica (metodo aderenza) ^21,22,27. Il metodo aderenza è veloce ed economica, e non richiede l'uso di attrezzature complesse. Tuttavia, alcuni svantaggi di questo process...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	Deve essere utilizzato presso RT
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Life Technologies	10010-023
ACK Tampone di lisi	Qualità Biologico	118-156-101
RPMI 1640 medium	Life Technologies	22400-089
Antibiotico-Antimicotico (100x)	Life Technologies	15240-062
Siero fetale bovino (FBS)	Life Technologies	16000-044
tampone RoboSep	StemCell	20104
EasySep Kit per l'arricchimento di monociti umani	StemCell	19059
TC20 Contatore di cellule automatizzato	Bio-Rad	145-0101
FITC-Dextran	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Colorazione blu di tripano (0,4%)	Life Technologies	15250-061
Synergy 2 lettore multimodale	Biotek	7131000
XTT Bioreagente sale di sodio (XTT)	Sigma Aldrich	X4626-100MG
Bioreagente dimetilsolfossido (DMS)	Sigma Aldrich	D8418-500ML
Tiazoil-blu tetrazolio bromuro (MTT)	Sigma Aldrich	m5655-500MG
Sodio Dodecil Solfato (SDS)	Bio-Rad	161-0302
Fenazina Metosolfato (DMSO)	Sigma Aldrich	P9626-1G
Siero Umano Inattivato (HI)	Chemicon	S1-100ML
Citometro a flusso Accuri C6 BD	Accuri	653119
FlowSight Amnis Citometro a flusso	EMD Millipore	100300