Caratterizzazione delle derivate da monociti cellule dendritiche umane di Citometria a Flusso Imaging: un confronto tra due protocolli di isolamento dei monociti

Le cellule dendritiche (DC) sono mediatori essenziali del sistema immunitario innato e adattativo. La loro funzione di indurre risposte immunitarie primari e facilitare lo sviluppo della memoria immunologica. Queste cellule sono i principali responsabili per la cattura l'antigene, la migrazione e la stimolazione delle cellule T e sono quindi indicati per le cellule presentanti l'antigene come professionali (APC) ¹ .Manipulation delle DC potrebbe essere utilizzato in una vasta gamma di settori di ricerca e in ambito clinico per il trattamento di diverse malattie infiammatorie come l'HIV ^6,7, il cancro, le malattie autoimmuni ^{8 9,} e le risposte allergiche ^10. DC sono anche utilizzati per la ricerca abuso di sostanze al fine di risolvere i meccanismi sconosciuti e percorsi, come quelli associati con la dipendenza da alcol ^11-14, tossicodipendenza ^13,15, e la combinazione di infezione da HIV e abuso di sostanze ^16-19. Questi studi in corso e studi di ricerca future In campo dell'immunologia fare in vitro generazione delle DC estremamente importante per la ricerca. Tuttavia, vi sono diverse difficoltà legate isolare cellule dendritiche dal sangue umano come costituiscono solo lo 0,1 - 1% delle cellule totali mononucleari del sangue ^20.

Ad oggi, alcune delle tecniche comunemente per la generazione di cellule dendritiche in vitro costituito da plastica o vetro aderenza dei monociti ^21,22, densità centrifugazione in gradiente ^23, specifica separazione basato marcatore come cellula magnetica attivato smistamento ^22, fluorescente cellule attivate classificare ^24, selezione positiva dei monociti CD14 + utilizzando nanoparticelle magnetiche rivestite destrano ^25, e un rapido isolamento dei monociti altamente purificati mediante selezione cellulare negativa completamente automatizzato ^26. Tuttavia, il miglior metodo di scelta rimane controverso. Pertanto, per migliorare le tecniche di generazione di DC, vari metodi sono stati sviluppati in cuila purezza di queste cellule può essere notevolmente aumentata di differenziazione da cellule CD34 + progenitrici purificati e monociti isolati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) ^27. Come accennato prima, un metodo ampiamente utilizzato e popolare per la generazione di monociti derivati da cellule dendritiche (MDDCs) è quello di esplorare la capacità dei monociti di aderire al vetro o plastica (metodo di aderenza) ^21,22,27. Il metodo aderenza è un metodo rapido e semplice che non richiede l'uso di attrezzature complesse. Tuttavia, alcuni svantaggi di questo processo includono contaminazione linfociti, scarsa flessibilità, e monociti manipolazione transitoria ^28. Un metodo alternativo al metodo aderenza è l'isolamento magnetico di monociti da PBMC totali, in particolare con l'uso di un kit monociti arricchimento umano, che è progettato per isolare monociti da PBMC da selezione negativa ^26. Durante questa procedura, le cellule indesiderate sono mirati per la rimozione con tetramericcomplessi di anticorpi e particelle magnetiche rivestite destrano. Il vantaggio di questo metodo di isolamento è che le cellule marcate indesiderate vengono separati usando un magnete mentre le cellule bersaglio possono essere liberamente versato fuori in un nuovo tubo senza bisogno di colonne. Ad oggi, con la disponibilità di specifici anticorpi monoclonali che possono etichettare popolazioni cellulari unici, la tecnica di separazione magnetica è diventata non semplicemente un ulteriore metodo, ma una necessità per l'isolamento di cellule rare nel campo della immunologia. Per esempio, tecniche come la cellula magnetica ordinamento con disponibili in commercio paramagnetiche MACS-nanoparticelle hanno facilitato lo sviluppo di nuovi approcci per la ricerca e applicazioni cliniche ^22,29. Inoltre, studi recenti ricerche che confrontano generazione DC dai metodi monociti aderenza e la tecnologia MACS hanno dimostrato una maggiore purezza DC e la vitalità usando MACS monociti ^22,30 separati.

I regali studioun confronto tra due metodi per la generazione di cellule dendritiche umane da monociti isolati da PBMC: 1) isolamento monociti da aderenza e 2) isolamento dei monociti di selezione negativa utilizzando un kit commerciale monociti arricchimento umano. Questo studio fornisce la prova per dimostrare che la procedura di selezione separazione magnetica negativa per isolare monociti genera il più alto rendimento dei monociti senza differenze significative nei monociti vitalità se confrontato con monociti isolati con il metodo di aderenza. A sua volta, dopo sette giorni, i monociti isolati da separazione magnetica differenziate in MDDCs con significativamente più alta capacità proliferativa e una maggiore quantità di cellule che esprimono doppio positivo (+ CD11c / CD14 +) fenotipo senza influenzare MDDC vitalità. Nel complesso, questo studio si differenzia dai precedenti studi citati sopra in quanto dimostra la capacità di entrambe le tecniche per generare simultaneamente monociti che sono in grado di proliferare e differenziarsi in CD11c +MDDCs (> 70%) dopo sette giorni di coltura senza compromettere la loro vitalità. Inoltre, l'attuale approccio fornisce per la prima volta la caratterizzazione di differenti CD11c / CD14 popolazioni MDDCs dal flusso di imaging citometria.

In sintesi, poiché DC giocano un ruolo centrale riguardante la ricerca nel campo della immunologia, diversi parametri devono essere presi in considerazione quando si considera come sono derivate e quali metodi sono utilizzati per isolare e cultura li in vitro. Pertanto, questo studio mira a fornire approfondimenti su due diversi metodi di isolamento dei monociti e di come questi metodi influenzano in modo differenziale monociti vitalità e la resa alla fine colpisce la vitalità delle cellule dendritiche, la proliferazione, e fenotipo. Questi risultati contribuiranno notevolmente al campo della immunologia e forniranno un protocollo dettagliato di DC isolamento, purificazione e caratterizzazione.

studi del sangue umano complessivi sono stati esaminati e approvati dal Institutional Review Board (IRB) di FIU, protocollo IRB approvazione # IRB-13-0440. leukopaks umani sono stati acquistati dalla banca del sangue comunità in Miami, FL.

1. Isolamento di PBMC da Tecnica gradiente di densità standard

1. Eseguire una diluizione 1: 1 di sangue con soluzione salina 1x-tampone fosfato in un pallone T75.
2. Pipettare 15 ml di soluzione gradiente di densità in 50 ml provette da centrifuga e accuratamente strato (25 - 30 ml / provetta) del sangue diluito su tutto questo gradiente.
3. Centrifugare per 20 minuti a 1200 xg con accelerazione e decelerazione 1 0.
4. Dopo la centrifugazione, raccogliere lo strato di interfaccia (globuli bianchi) in un nuovo 50 ml provetta da centrifuga e lavare le cellule due volte in PBS (3 min a 1.080 xg). Gettare il surnatante ogni volta.
5. Trattare le cellule con ammonio-cloruro di potassio-lisi (ACK) tampone (per la lisi dei globuli rossi). Aggiungere 10 ml di tampone e incubate per 15 min a 4 ° C.
6. Lavare le cellule due volte con PBS, centrifugare per 3 min a 1.080 xg ed eliminare il surnatante ogni volta.
7. Salvare il pellet, che conterrà i PBMC.
8. Procedere con metodo di purificazione dei monociti di scelta.

2. Purificazione monociti secondo il metodo Aderenza

1. Preparare completa mezzo di coltura cellulare contenente L-glutammina (300 mg / ml) ed addizionato con penicillina (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) e 10% siero fetale bovino.
2. Lasciare PBMC di aderire per circa 2 ore dalla loro coltura in una beuta T75 ad una concentrazione di 5 x 10 ⁷ cellule per 10 ml di mezzo completo a 37 ° C e 5% CO ₂ in un incubatore umidificato.
3. Dopo l'incubazione, rimuovere le cellule galleggianti non aderenti dal pallone di coltura e lavare delicatamente cellule aderenti due volte con PBS.
4. Incubare cellule aderenti in mezzo completo di coltura cellulare integrato con 2 microlitri / ml di granulociti-MACR umanaophage fattore stimolante le colonie (GM-CSF) e l'interleuchina 4 (IL-4) conservato a uno stock concentrazione di 10 mg / ml.
5. Modificare la metà del mezzo e ricostituire le citochine ogni 48 ore.
6. Lasciare 5 - 7 giorni per la differenziazione dei monociti in MDDCs.

3. monociti Purificazione mediante metodo di separazione magnetica

1. Raccogliere PBMC di tecnica gradiente di densità standard, versare in una provetta di polistirene da 5 ml e risospendere in tampone PBS ad una concentrazione di cellule / ml.
2. Aggiungere cocktail monociti arricchimento umano per mezzo di 50 ml / ml cellule, mescolare bene e incubare a 4 ° C per 10 min.
3. Dopo l'incubazione, aggiungere particelle magnetiche che utilizzano 50 ml / ml cellule, mescolare bene e incubare a 4 ° C per 5 min.
4. Portare sospensione cellulare fino ad un volume totale di 2,5 ml aggiungendo tampone PBS, mescolare bene pipettando su e giù 2 - 3 volte.
5. Posizionare il tubo di polistirene senza un tappo nel dispositivo magnetico e mettere da parte a temperatura ambiente per 2.5 minuti.
6. Dopo l'incubazione e in un unico movimento continuo, prendere il magnete e versare la frazione dei monociti purificata desiderato in un tubo da 50 ml centrifugazione pulito.
7. Incubare cellule aderenti in mezzo completo di coltura cellulare integrato con 2 ml / ml di granulociti-macrofagi fattore stimolante le colonie (GM-CSF) umana e l'interleuchina 4 (IL-4) conservato a uno stock concentrazione di 10 mg / ml.
8. Ogni 48 ore, cambia la metà del mezzo, spin down a 1.080 xg per 5 minuti e risospendere pellet con nuovi media (CRPMI) e citochine.
9. Lasciare 5 - 7 giorni per la differenziazione dei monociti in MDDCs.

4. Trypan Blue Esclusione vitalità Assay

Nota: Utilizzare questa tecnica per ottenere la resa delle cellule e la vitalità di PBMC, monociti, e MDDCs.

1. Celle di raccolta che utilizzano standard di tripsina-EDTA ed eseguire lavaggi dei fiaschi e il pellet cellulare in PBS. A seconda delle dimensioni del pellet, risospendere in 5 a 10 ml di PBS per dissolvere il pellet.
2. In un tubo micro-centrifuga, eseguire una diluizione 1: 1 di trypan reagente blu con pellet cellulare diluito.
3. Da questo mix, aliquote 10 ml in una cella contando scivolo e leggere i risultati utilizzando un contatore di cellule automatizzato secondo il protocollo del produttore. Se un contatore di cellule automatizzato non è disponibile, una conta cellulare simile è possibile utilizzando un emocitometro o un contatore manuale.

5. MTT Assay

1. Cellule piastra a una concentrazione di 4 x 10 ^4/100 ml di completo supporto in ciascun pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Consentire 24 ore per le cellule per regolare alla cultura.
2. Incubare ed effettuare letture a 0 rispettivamente (giorno 0), 36 (giorno 3) e 84 ore (giorno 7).
3. Al termine della incubazione desiderato, rimuovere i supporti e sostituire con 100 microlitri di PBS solo.
4. Preparare 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio soluzione bromuro (MTT) (5 mg / ml) aggiungendo 10 ml di Dimethyl solfossido (DMSO) per 1 g di sodio dodecil solfato (SDS).
5. Aggiungere 10 ml (5 mg / ml) di soluzione MTT ad ogni pozzetto ed incubare a 37 ° C per 2 ore aggiuntive.
6. Dopo l'incubazione, rimuovere surnatanti che contengono PBS e la miscela di MTT non convertito (soluzione di colore giallo-colore).
7. Aggiungere 100 ml di soluzione di SDS-DMSO ad ogni pozzetto e incubare per un'ora supplementare.
8. Leggere l'assorbanza a 540 nm usando un lettore di micropiastre.

6. cellulari di superficie colorazione Analisi per Imaging citometria a flusso

1. Dopo 7 giorni di differenziazione da monociti purificati, dispensare 1x10 ⁶ aliquote cellulari delle cellule dendritiche derivate da monociti nel numero appropriato di provette da 1,5 ml.
2. Inizia la colorazione della superficie cellulare da parte delle cellule bloccando con 50 ml di calore inattivati ​​(HI) siero umano, incubare a 4 ° C per 10 min.
3. Dopo l'incubazione, le cellule centrifugare a 720 xg per 5 minuti, scartare il surnatante.
4. Alla cella pellet, aggiungere rispettivi anticorpi coniugati a fluorocromi (es, anti-CD11c o anti-CD14) e incubare a 4 ° C per 20 minuti al riparo dalla luce. In tubi separati, preparare singoli fluorocromi macchiato di campioni / ml) in quanto sono necessari per la compensazione.
5. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte in 1 ml di tampone PBS e centrifugare per volta a 720 xg per 5 min.
6. Mantenere le cellule al riparo dalla luce, ri-sospendere in tampone PBS alla concentrazione di cellule / 100 microlitri per citometria a flusso.
7. Al fine di cancello cellule vitali, aggiungere 1 ml di DAPI ad ogni provetta prima di acquisire le cellule sul singolo flusso di imaging cellulare citometria strumento secondo le istruzioni del produttore.

7. Analisi statistica

1. Ingresso tutti i dati in un foglio di calcolo.
2. Confrontare i risultati con t-test dello studente e / o ANOVA a seconda dei casi.
3. Considerare differenze statisticamente significativo se p <0.05.

Monociti Resa dalla separazione magnetica è superiore rispetto a monociti Resa secondo il metodo Aderenza

I dati presentati in Figura 1 mostra PBMC e conta delle cellule monociti dal metodo di esclusione del trypan blue alla data di isolamento delle PBMC e separazione dei monociti. In media, monociti isolati con il metodo aderenza rappresentato circa il 6,2 per cento di PBMC totali, mentre monociti isolati da separazione magnetica hanno rappresentato per un massimo di 25 per cento di PBMC. L'analisi statistica ha rivelato che la percentuale di monociti apportati dalle separazione magnetica erano significativamente più elevato (≥ 4 volte). I dati sono espressi come media ± SD di tre esperimenti indipendenti. L'analisi statistica usando t di Student-test ha mostrato una differenza significativa della resa dei monociti quando si confrontano i due metodi (p ≤ 0,0005).

Dopo l'isolamento monociti dai due diverse tecniche sopra descritte, saggi di vitalità sono state effettuate per assicurare che i metodi usati non erano citotossica e riguardano la vitalità delle cellule. I dati presentati in Figura 2 mostra la media della percentuale di monociti isolati vitali con entrambi i metodi adesione o per separazione magnetica. Le cellule vitali sono stati contati utilizzando il metodo di esclusione del trypan blue fino al giorno di isolamento. Confrontando cento vitalità dei monociti tra i due metodi di isolamento rivelato che la differenza tra i due gruppi non era statisticamente significativa. Inoltre, la media della percentuale di monociti isolati vitali aderendo era 91.75% ± 1,66 e la media della percentuale di monociti vitali isolato mediante magnseparazione etico era 87,4% ± 2,75. Questi dati vitalità sono stati valutati da almeno tre esperimenti indipendenti. La significatività statistica è stata determinata utilizzando test t.

Cellule derivate da monociti isolati dalla separazione magnetica mostrano un aumento significativo nella proliferazione cellulare Rispetto a cellule derivate da monociti acquisite dal metodo Aderenza

MTT è stato usato come un saggio colorimetrico per misurare la proliferazione cellulare. Nelle cellule viventi, il colore giallo tetrazolo MTT è ridotto a formazano viola, facilmente misurata con uno spettrofotometro. I dati presentati in Figura 3 dimostrano che entrambi i processi di isolamento monociti portano ad una maggiore proliferazione cellulare per un periodo di 7 giorni come misurato da un aumento di assorbanza al giorno 0 (metodo aderenza: 0.22 ± 0.02 vs. metodo magnetica: 0.38 ± 0.02), Giorno Metodo 3 (aderenza: 0.28 ± 0.02, il metodo magnetico: Metodo di 0.55 ± 0.05) e il giorno 7 (aderenza: 0,36 ± 0,01, magnetico = 0.66 ± 0.006). Tuttavia, a differenza del test XTT (dati non mostrati), il saggio MTT rivelato un aumento significativo proliferazione cellulare di MDDCs da monociti isolati mediante separazione magnetica rispetto al MDDCs da monociti acquisite dal metodo aderenza al giorno 0 (p = 0,003), giorno 3 (p = 0,006), e il giorno 7 (p = 0,002). La proliferazione cellulare è risultata essere significativamente differente tra i giorni 0 e 3 (p = 0,003), e tra i giorni 0 e 7 (p <0.001) in un gruppo di MDDCs da monociti purificato mediante separazione magnetica. Inoltre, è stata osservata una differenza significativa nella proliferazione cellulare tra il giorno 0 e al giorno 7 in MDDCs da monociti purificato per adesione (p = 0,008). saggio MTT è stato condotto utilizzando MDDCs acquisiti da tre diversi esperimenti. La significatività statistica è stata determinata utilizzando ANOVA e test t, p ≤ 0,05 wcome considerati significativi, e valori di p sono noti sul grafico a meno che non è stata trovata alcuna significatività statistica.

Caratterizzazione di MDDCs da CD11c e CD14 delle cellule della superficie di colorazione

Dopo coltura monociti per sette giorni con IL-4 e GM-CSF, MDDCs ottenuti da monociti isolati con metodi di aderenza e di isolamento magnetica sono stati caratterizzati in Figura 4. La caratterizzazione rivelato partire singolo CD14 + / CD11c- fenotipo o popolazione puramente monocitica in entrambi i metodi, aderenza = 1% ± 1.0 vs magnetico = 1% ± 0,0 e alta totale CD11c + fenotipo, l'aderenza = 72% ± 11 contro magnetico = 79% ± 19. Tuttavia, quando il CD14 totale + popolazione è stato analizzato ulteriormente, c'era un alto rendimento di cellule doppio positive per CD11c e CD14 in entrambi i metodi con separazione magnetica dando un maggior numero di CD11c e CD14 doppio positivopopolazione se confrontato con il metodo di adesione, l'adesione = 49% ± 7 contro magnetico = 73% ± 15. Anche se, ci fosse una maggiore resa di MDDCs con doppio fenotipo positivo tramite separazione magnetica, il CD11c positivo e CD14 popolazione negativa di MDDCs è stato più elevato nel metodo aderenza; aderenza = 23% ± 7 contro magnetico = 6% ± 7. Nella figura 4B, l'intensità media di fluorescenza (MFI) di ogni singolo marcatore è stato esaminato nella popolazione gated e ha mostrato ad alta intensità di CD14 in CD14 + popolazione equivalente in entrambi CD11c e CD14 nel doppio della popolazione positivo e ad alta intensità di CD11c in CD11c + e la popolazione CD14-. In sintesi, anche se l'isolamento magnetico fornisce una più elevata percentuale di CD11c + / CD14 + cellule, che può essere di scena differenziata MDDCs prime che non hanno ancora abbandonato il marcatore monociti (CD14), il metodo di adesione conferisce una maggiore percentuale di CD11c + / CD14-, che può essere una fase avanzata differenziata MDDC popolazione. in Additione, colorazione DAPI è stata eseguita per confermare i risultati di vitalità e di garantire la caratterizzazione è stata effettuata su MDDCs dal vivo. La percentuale di DAPI negativo / cellule vive (aderenza = 76 ± 7 contro magnetico = 67 ± 1) non sono significativamente differenti tra i due metodi che confermano entrambi i metodi non influenzano la vitalità delle MDDCs dopo sette giorni di coltura.

Figura 1. monociti Resa dalla separazione magnetica è superiore rispetto a monociti Resa con il metodo aderenza. Circa il 6,2% dei monociti sono stati isolati dal PBMC utilizzando il metodo di aderenza mentre ~ 25% dei monociti sono stati ottenuti utilizzando il metodo di separazione magnetica. I dati sono espressi come media ± SD di tre esperimenti indipendenti. t-test statistico analisi utilizzando studente ha mostrato una differenza significativa della resa dei monociti quando si confrontano i due metodi(p = 0. 00005). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Isolamento monociti da aderenza e separazione magnetica non influenzano Monociti Viability. La media della percentuale di monociti isolati vitali aderendo era 91.75% ± 1,66 e la media della percentuale di monociti isolati vitali per separazione magnetica era 87,4% ± 2.75. I dati sono espressi come media ± SD percentuale di cellule vitali di almeno tre esperimenti indipendenti. Nessuna differenza significativa è stata osservata nella vitalità cellulare quando si confrontano entrambi i metodi di purificazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. cellule derivate da monociti isolati dalla separazione magnetica mostrano un aumento significativo nella proliferazione cellulare Rispetto a cellule derivate da monociti acquisita con il metodo aderenza. È stato osservato un significativo aumento di assorbanza per entrambi i metodi, sia a giorno 3 e il giorno 7 quando si confrontano i valori contro i suoi rispettivi controlli di giorno 0. inoltre, ANOVA e test t anche mostrato una significativa differenza di assorbanza di MTT assorbimento quando si confrontano i due metodi (p ≤ 0,05). I dati sono espressi come media ± SD di tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. Caratterizzazione di MDDCs di CD11c e CD14 colorazione delle cellule di superficie. Grafico A) Bar che rappresentano le diverse popolazioni (% gated di singole cellule). In primo luogo, le cellule (vive) DAPI- sono stati gated dall importo totale singole cellule. Poi, CD14 + / CD11c-, CD11c +, CD11c + / CD14 + e CD11c + / CD14- sono stati gated da DAPI- (vivo) della popolazione. CD11c + popolazione è la somma dei due regioni CD11c + / CD14 + e CD11c + / CD14-. B) i grafici rappresentativi che mostrano l'intensità media di fluorescenza (MFI) valori sia per CD11c e CD14 in ogni sottopopolazione di cellule. C) trame Rappresentante dispersione di cellule etichettate con CD11c-APC e CD14-APCcy7 gated su DAPI negativo (vivo) popolazione di cellule per entrambi i metodi magnetici e di aderenza. Rappresentante galleria di immagini di singole cellule (selezionato in blu nei grafici a dispersione) appartenenti a ciascun sotto-popolazione di cellule, CD11c + / CD14- (gated in arancione), CD11c + / CD14 + (gatedin rosso), e CD14 + (gated in viola). Nella galleria di immagini di singole cellule, il colore rosso rappresenta CD11c etichettato con APC e il colore giallo rappresenta CD14 marcato con APCcy7. Nei grafici a dispersione, i colori scelti per porta le popolazioni sono casuali e non sono correlati alle immagini cellulari attuali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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