Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

Summary

Una metodologia high-throughput, la produzione di protoplasti di tabacco automatizzata e la trasformazione è descritto. Il sistema robotico consente l'espressione genica massicciamente parallelo e la scoperta nel sistema modello BY-2 che dovrebbe essere traducibile di colture non-modello.

Abstract

Negli ultimi dieci anni c'è stata una recrudescenza nell'uso dei protoplasti vegetali che vanno da specie modello per ritagliare le specie, per l'analisi di trasduzione del segnale, reti di regolazione trascrizionale, l'espressione genica, del genoma-editing, e Gene-silenziamento. Inoltre, sono stati compiuti progressi significativi nella rigenerazione di piante da protoplasti, che ha generato ancor più interesse per l'uso di tali sistemi per genomica vegetale. In questo lavoro, un protocollo è stato sviluppato per l'automazione di isolamento protoplasti e trasformazione da 2 (BY-2) coltura in sospensione tabacco un 'giallo brillante' utilizzando una piattaforma robotica. Le procedure di trasformazione sono stati convalidati usando un gene reporter proteina fluorescente arancione (OFP) (pporRFP) sotto il controllo del promotore cavolfiore mosaic virus 35S (35S). espressione OFP in protoplasti stata confermata mediante microscopia in epifluorescenza. Le analisi inclusi anche i metodi di efficienza di produzione di protoplasti utilizzando propidium ioduro. Infine, a basso costo enzimi per alimenti sono stati utilizzati per la procedura di isolamento di protoplasti, eludendo la necessità di enzimi di laboratorio di grado che sono un costo proibitivo in high-throughput automatizzato isolamento di protoplasti e di analisi. Basato sul protocollo sviluppato in questo lavoro, la procedura completa dall'isolamento protoplasti di trasformazione può essere effettuata in meno di 4 ore, senza alcun intervento da parte dell'operatore. Mentre il protocollo sviluppato in questo lavoro è stato convalidato con la coltura cellulare BY-2, le procedure ei metodi dovrebbero essere traducibile a qualsiasi / sistema di coltura in sospensione di protoplasti impianto, che dovrebbe consentire l'accelerazione della ricerca genomica nel grano.

Introduction

Negli ultimi anni vi è stato significativo impulso posto sulla progettazione delle colture transgeniche per superare le varie malattie ^1, dotare resistenza agli erbicidi ^2, conferiscono alla siccità e ^3,4 tolleranza al sale ^5, prevenire erbivori ^6, aumento della biomassa resa ^7, e diminuire recalcitrance parete cellulare ^8. Questa tendenza è stata aiutata dallo sviluppo di nuovi strumenti molecolari per la generazione di piante transgeniche, tra cui genoma di modifica utilizzando CRISPR e Talens ^9, e silenziamento genico attraverso dsRNA ^10, miRNA ^11, e siRNA....

Protocol

1. Istituzione di sospensione culture cellulari

1. Preparare liquido BY-2 supporti aggiungendo 4,43 g Linsmaier & Skoog supporti basali, 30 g di saccarosio, 200 mg KH ₂ PO _4, e 200 mg di 2,4-diclorofenossiacetico acido (2,4-D) a 900 ml di acqua distillata l'acqua e il pH a 5,8 con 0,1 M KOH. Dopo la regolazione del pH, regolare il volume finale a 1000 ml con acqua distillata e autoclave. I supporti possono essere memorizzati fino a 2 settimane a 4 ° C.
2. Seminare un pallone da 250 ml Erlenmeyer con 100 ml di liquido BY-2 media e un pezzo unico di BY-2 callo (> 1 cm di diametro) coltivati ​​in solidi supporti BY-2 (liquido BY-....

Results

In questo studio, il tasso di raddoppio BY-2 varia dai 14-18 hr dipendente dalla temperatura alla quale sono stati incubati le culture, coerente con le precedenti relazioni di media durata del ciclo cellulare delle 15 ore. Con questo tasso raddoppio, 1: 100 inoculo di partenza è stato usato per iniziare culture, portando a culture con un volume imballato cellulare (PCV) del 50% in 5-7 giorni. Nel protocollo attuale, in cui le culture sono state coltivate in 200 ml di mezzi di comunicazio.......

Discussion

Il protocollo sopra descritto è stato convalidato con successo per l'isolamento di protoplasti, l'enumerazione e la trasformazione utilizzando il tabacco coltura cellulare sospensione BY-2; Tuttavia, il protocollo potrebbe facilmente essere esteso a qualsiasi coltura in sospensione pianta. Allo stato attuale, l'isolamento di protoplasti e trasformazione è stato raggiunto in numerose piante, tra cui il mais (Zea mays) ^10, carota (Daucus carota) ^32, il pioppo (Populu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orbitor RS Microplate mover	Thermo Scientific
Bravo Liquid Handler	Agilent
Synergy H1 Lettore multimodale	BioTek
MultiFlo FX Dispenser multimodale	BioTek
Teleshake	Inheco	3800048
CPAC Ultraflat Riscaldatore/raffreddatore	Inheco	Software di automazione 7000190
	Olympus
Zyla Fotocamera per microscopio a 3 tocchi	Andor
ET-CY3/TRITC Set di filtri	Chroma Technology Corp	49004
Rohament CL	AB Enzymes	flacone per campioni	a basso costo cellulasi
Rohapect UF	AB Enzymes	flacone per campioni	a basso costo pectinasi
Rohapect 10L	AB Enzymes		pectinasi/arabinasi a basso costo
Linsmaier & Skoog Basal Medium	Phytotechnology Laboratories	L689
Acido 2,4-diclorofenossiacetico	Phytotechnology Laboratories	D295
ioduro di propidio	Sigma Aldrich	P4170
Poli(glicole etilenico) 4000	Sigma Aldrich	95904-250G-F	Precedentemente Fluka PEG
Ioduro di propidio	Fisher Scientific	25535-16-4	Acros Organics
CaCl2	Sigma Aldrich	C7902-1KG
Acetato di sodio	Fisher Scientific	BP333-500
Mannitolo	Sigma Aldrich	M1902-1KG
Saccarosio	Fisher Scientific	S5-3
KH2PO4	Fisher Scientific	AC424205000
KOH	Sigma Aldrich	P1767
Gelzan CM	Sigma Aldrich	G1910-250G
Piastra a 6 pozzetti	Thermo Scientific	103184
Piastra a 96 pozzetti da 1,2 ml	Thermo Scientific	AB-0564
Piastra inferiore ottica a 96 pozzetti	Thermo Scientific	165305
Finntip 1000 Punte	per pipette a foro largoThermo Scientific	9405 163
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
KCl	Sigma Aldrich	P4504-1KG
MES	Fisher Scientific	AC17259-5000
MgCl2	Fisher Scientific	M33-500