Imaging Azzerato embrionale e postnatale Cuori a risoluzione di una singola cella

Wasay M. Shaikh Qureshi; Lianjie Miao; David Shieh; Jingjing Li; Yangyang Lu; Saiyang Hu; Margarida Barroso; Joseph Mazurkiewicz; Mingfu Wu

doi:10.3791/54303

Articolo metodologico

Imaging Azzerato embrionale e postnatale Cuori a risoluzione di una singola cella

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DOI:

10.3791/54303

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7 ottobre 2016

Wasay M. Shaikh Qureshi¹ , Lianjie Miao¹ , David Shieh¹ , Jingjing Li¹ , Yangyang Lu¹ , Saiyang Hu¹ , Margarida Barroso¹ , Joseph Mazurkiewicz² , Mingfu Wu¹

¹Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, ²Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un protocollo per visualizzare volumetricamente cellule marcate con proteine fluorescenti in profondità all'interno di cuori embrionali e postnatali intatti. Utilizzando metodi di pulizia dei tessuti in combinazione con la colorazione dell'intera montatura, è possibile visualizzare in modo chiaro e accurato singole cellule marcate con proteine fluorescenti all'interno di un cuore embrionale o postnatale.

Abstract

Singolo tracing clonale e analisi a livello intero cuore può determinare il comportamento delle cellule progenitrici cardiache e differenziazione durante lo sviluppo cardiaco, e consentire lo studio delle basi cellulari e molecolari della morfogenesi cardiaca normale e anormale. Recenti tecnologie emergenti di retrospettive singole analisi clonali rendono lo studio della morfogenesi cardiaca a risoluzione singola cella fattibile. Tuttavia, l'opacità dei tessuti e la dispersione della luce del cuore come la profondità delle immagini è aumentata Hinder di imaging intero-cuore con una risoluzione di singola cellula. Per superare questi ostacoli, un sistema di compensazione intero embrione che può rendere il cuore altamente trasparente sia per l'illuminazione e la rilevazione devono essere sviluppati. Fortunatamente, negli ultimi anni, sono stati segnalati molti metodologie per sistemi di compensazione intero organismo, come la chiarezza, la Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, cubi, DBE, BABB e PACT. Questo laboratorio è interessato ai meccanismi cellulari e molecolari della cartaIAC morfogenesi. Recentemente, abbiamo stabilito singola linea cellulare tracciare tramite il ROSA26-Cre ^ERT2; sistema ROSA26-Confetti alle cellule di etichette scarsamente durante lo sviluppo cardiaco. Abbiamo adattato diverse metodologie embrio-clearing interi compresi Sca le e cubi (chiare, senza ostacoli cocktail di imaging cerebrale e analisi computazionale) per cancellare l'embrione in combinazione con tutto il monte colorazione di immagine singoli cloni all'interno del cuore. Il cuore è stato ripreso con successo ad una risoluzione di singola cellula. Abbiamo trovato che le Sca può cancellare il cuore embrionale, ma non può efficacemente eliminare cuore postnatale, mentre CUBIC può cancellare cuore postnatale, ma danneggia il cuore embrionale sciogliendo il tessuto. I metodi qui descritti permetteranno lo studio della funzione genica in una sola risoluzione clone durante morfogenesi cardiaca, che, a sua volta, può rivelare basi cellulari e molecolari dei difetti cardiaci congeniti.

Introduzione

Morfogenesi cardiaca è un evento sequenziale che richiede l'organizzazione spaziotemporale di quattro diversi tipi di cellule progenitrici cardiache in settori distinti del cuore, e richiede anche più reti di regolazione genetica di orchestrare questo processo per formare il ^1,2 cardiaca funzionale. Cardiac specificazione, differenziazione, patterning, e la maturazione della camera sono regolati da fattori di trascrizione cardiogeno ^3. Mutazione genetica o aberrazione posttranscriptional di questi fattori nelle cellule progenitrici cardiache possono provocare sia letalità embrionale o difetti cardiaci congeniti (CHD) ^4. Lo studio ....