Correlativo luce e microscopia elettronica Utilizzando Quantum Dot nanoparticelle

Summary

Viene descritto un metodo in base al quale le nanoparticelle di punti quantici (QD) possono essere utilizzate per studi immunocitochimici correlati di tessuto patologico umano incorporato in resina epossidica. Utilizziamo QD coniugati con frammenti di anticorpi commerciali che vengono visualizzati mediante microscopia ottica a fluorescenza a campo largo e microscopia elettronica a trasmissione.

Abstract

Un metodo è descritto quale quantum dot (QD) nanoparticelle possono essere utilizzati per studi correlativi immunocitochimiche di tessuto patologia umana utilizzando widefield microscopia a fluorescenza luce e microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Per dimostrare il protocollo che abbiamo immunolabeled sezioni epossidiche ultrasottili di tumore somatostatinoma umano utilizzando un anticorpo primario per la somatostatina, seguito da un anticorpo secondario biotinilato e visualizzazione con streptavidina coniugata 585 nm cadmio-selenio (CdSe) punti quantici (QD). Le sezioni sono montati su una griglia esemplare TEM poi posto su un vetrino per osservazione da widefield microscopio ottico a fluorescenza. La microscopia ottica rivela 585 nm etichettatura QD come una fluorescenza arancio vivo formando un pattern granulare all'interno del citoplasma delle cellule tumorali. A bassa di mid-range di ingrandimento al microscopio ottico lo schema di etichettatura è facilmente riconoscibile e il livello di etichettatura non specifico o di sfondo valutata. Questo è criticopasso per successiva interpretazione del pattern immunomarcatura da TEM e valutazione del contesto morfologica. La stessa sezione è poi cancellato asciutto e visto da TEM. sonde QD sono visti da allegare al materiale amorfo contenute nei singoli granuli secretori. Le immagini vengono acquisite dalla stessa regione di interesse (ROI) visto al microscopio ottico per l'analisi correlativa. Corrispondente immagini da ogni modalità può poi essere miscelati per sovrapporre i dati di fluorescenza sulla TEM ultrastruttura della regione corrispondente.

Introduction

Light- Correlativo e microscopia elettronica (CLEM) è un approccio efficace per l'analisi di eventi dinamici transitori ^1, eventi rari ^{2, 3} e complessi sistemi ^4. Ci sono molti permutazioni tecniche differenti disponibili ⁵ a seconda della domanda che si pone tuttavia un requisito comune è che la stessa struttura in un singolo campione ⁶ è ripreso dalla modalità multiple microscopia. Il nostro approccio particolare CLEM stato sviluppato per lo studio del tessuto patologia umana archiviazione e il caso qui utilizzato è stato ben caratterizzati e pubblicato in precedenza ^7. L'obiettivo era innanz....

Protocol

1. Tissue dissezione e la fissazione

1. Tissue Dissection
   1. Sezionare pezzi di tessuto da un tumore campione o biopsia del tessuto asportato chirurgicamente.
      Nota: Il tessuto utilizzato in questo studio è stato regolarmente fissato in formalina, ma tessuto fresco è anche adatto. Abbiamo scelto una zona confermata e riportato da un anatomo-patologo per contenere somatostatinoma del tumore dopo routine di colorazione istologica ed immunoistochimica anti-somatostatina (non mostrate).
   2. Utilizzare pezzi di tessuto non più grandi di circa 1,0 mm ^3.
2. Cacodylate Buffer Preparazione....

Results

Il campione somatostatinoma tumorali utilizzati per questo studio comprendeva le cellule tumorali che formano strutture duttali mescolato con il tessuto dello stoma collagene. Al microscopio ottico a fluorescenza, le cellule tumorali singole che conteneva abbondanti granuli secretori hanno mostrato l'etichettatura positiva per l'ormone della somatostatina. Nuclei apparso fori scuri con marcatura non specifica minima rilevabile (Figura 1). A bassi ingrandimenti, variabilm.......

Discussion

Questo studio ha dimostrato la potenziale utilità di QD come sonde universali per gli studi CLEM. I 585 nm nanoparticelle QD utilizzati hanno mostrato fluorescenza brillante e stabile se visti al microscopio ottico widefield e sono stati prontamente osservati da TEM. Un precedente studio da uno dei presenti autori hanno dimostrato QD anche essere adatto a super-risoluzione microscopia ottica ^7. La loro fotostabilità era particolarmente utile per periodi estesi e visualizzazione esposizioni di imaging lunghi. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cacodilato di sodio	Proscitech	C0205	Sostanza chimica nociva
Tetrossido di osmio	Proscitech	C010	Utilizzare solo in cappa aspirante
Acetato di uranile	Univar-Ajax	569	Sostanza chimica pericolosa
Etanolo 100%	Fronine	JJ008
Acetone 100%	Fronine	JJ006
ERL 4221	Proscitech	C056
DER 732	Proscitech	C047
NSA	Proscitech	C059
DMAE	Proscitech	C050
Sodio metaperiodato	Analar BDH	10259
anticorpo anti-somatostatina	Dako	A0566
Diluente anticorpale	Dako	S3022
Qdot 585 Coniugato di streptavidina	Invitrogen	Q10113MP
Capra biotinilata anticorpo IgG anti-coniglio	Sigma	B7389-1ML
Glutaraldeide 50%	EMS	16320
Siero di capra normale	Invitrogen	PCN5000
PBS "Dulbecco A"	Ossoide
BSAc (10%)	Aurion	900.022
Parafilm	Pechiney PP	M
Strisce indicatrici di pH (pH 2,0 - 9,0)	Merck	1.09584.0001
Microstampi	Proscitech	RL063
Coltello diamantato	Diatomee	Ultra 45
Microscopio elettronico a trasmissione	FEI	Morgagni 268D
Microscopio ottico a fluorescenza	Carl Zeiss	Axioscope A1
Griglie 300 mesh nichel (barra sottile)	Agar Scientific	G2740N
Ultramicrotome	RMC	Powertome
TEM software di controllo della fotocamera	Imaging System	AnalySIS	Versione 3.0
Software di elaborazione immagini	Adobe Systems Photoshop	CS2