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Articolo metodologico

Correlativo luce e microscopia elettronica Utilizzando Quantum Dot nanoparticelle

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DOI:

10.3791/54307

⸱

7 agosto 2016

 , 
1South Western Sydney Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia, 2School of Medicine, Western Sydney University, 3Correlative Microscopy Group, Ingham Institute for Applied Medical Research, 4Electron Microscopy Laboratory, Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service, New South Wales Health Pathology, 5School of Medical Sciences, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia

In questo articolo

Sommario

Viene descritto un metodo in base al quale le nanoparticelle di punti quantici (QD) possono essere utilizzate per studi immunocitochimici correlati di tessuto patologico umano incorporato in resina epossidica. Utilizziamo QD coniugati con frammenti di anticorpi commerciali che vengono visualizzati mediante microscopia ottica a fluorescenza a campo largo e microscopia elettronica a trasmissione.

Abstract

Un metodo è descritto quale quantum dot (QD) nanoparticelle possono essere utilizzati per studi correlativi immunocitochimiche di tessuto patologia umana utilizzando widefield microscopia a fluorescenza luce e microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Per dimostrare il protocollo che abbiamo immunolabeled sezioni epossidiche ultrasottili di tumore somatostatinoma umano utilizzando un anticorpo primario per la somatostatina, seguito da un anticorpo secondario biotinilato e visualizzazione con streptavidina coniugata 585 nm cadmio-selenio (CdSe) punti quantici (QD). Le sezioni sono montati su una griglia esemplare TEM poi posto su un vetrino per osservazione da widefield microscopio ottico a fluorescenza. La microscopia ottica rivela 585 nm etichettatura QD come una fluorescenza arancio vivo formando un pattern granulare all'interno del citoplasma delle cellule tumorali. A bassa di mid-range di ingrandimento al microscopio ottico lo schema di etichettatura è facilmente riconoscibile e il livello di etichettatura non specifico o di sfondo valutata. Questo è criticopasso per successiva interpretazione del pattern immunomarcatura da TEM e valutazione del contesto morfologica. La stessa sezione è poi cancellato asciutto e visto da TEM. sonde QD sono visti da allegare al materiale amorfo contenute nei singoli granuli secretori. Le immagini vengono acquisite dalla stessa regione di interesse (ROI) visto al microscopio ottico per l'analisi correlativa. Corrispondente immagini da ogni modalità può poi essere miscelati per sovrapporre i dati di fluorescenza sulla TEM ultrastruttura della regione corrispondente.

Introduzione

Light- Correlativo e microscopia elettronica (CLEM) è un approccio efficace per l'analisi di eventi dinamici transitori 1, eventi rari 2, 3 e complessi sistemi 4. Ci sono molti permutazioni tecniche differenti disponibili 5 a seconda della domanda che si pone tuttavia un requisito comune è che la stessa struttura in un singolo campione 6 è ripreso dalla modalità multiple microscopia. Il nostro approccio particolare CLEM stato sviluppato per lo studio del tessuto patologia umana archiviazione e il caso qui utilizzato è stato ben caratterizzati e pubblicato in precedenza 7. L'obiettivo era innanzitutto, per massimizzare i dati analitici da un'unica biopsia o campioni chirurgici e dall'altro, di utilizzare microscopia ottica a fluorescenza per chiarire contesto del modello di etichettatura immunocitochimica visto a livello ultrastrutturale.

nanocristalli quantum dot (QDs) offrono il potenziale di un marcatore universale abl di sistemae da osservare da entrambi, luce microscopia a fluorescenza e microscopia elettronica 8, 9, 10. La loro struttura nucleo cristallino permette QD di diverse dimensioni per generare una vasta gamma di picchi di emissione di fluorescenza quando eccitato dalla luce a lunghezze d'onda lontano dalla loro spettri di emissione 11. Il loro peso atomico è sufficiente a produrre densità elettronica rilevabili mediante microscopia elettronica a trasmissione, microscopia a scansione elettronica a trasmissione (STEM) o emissione di campo microscopia elettronica a scansione. Sono particolarmente adatti per gli studi immunocitochimiche come anche i singoli QD possono essere osservati dando una sensibilità massima di un QD per molecola bersaglio 12. Inoltre, a seconda del QD utilizzato possono possedere una firma elementale individuale adatta per la mappatura.

campioni di patologia umana offrono vantaggi significativi per la ricerca biomedica traslazionale. campioni di tessuto chirurgica e la biopsia sono regolarmente presentate per biobanking e con appropetica riate distanze sono accessibili per studi di ricerca. Tessuto umano non ha problemi di rilevanza o di interpretazione che possono verificarsi in animali o in modelli in vitro di malattia. Tuttavia, la preparazione del campione dei campioni patologia spesso non è ottimale. Non ci può essere ritardo nel tessuto di essere immessi in fissativo, fissativo usato inadeguato quali formalina, piuttosto che glutaraldeide per TEM e campionamento inadeguato. metodi CLEM hanno il potenziale per ottimizzare le informazioni diagnostiche e prognostiche disponibili da un campione umano singolo. Tuttavia, alcuni approcci correlativi recente sviluppo come quelli che impiegano mini Generator ossigeno singoletto (miniSOG) non sono disponibili per l'uso in patologia a causa della necessità per l'etichetta da geneticamente codificato nella cella di interesse 13. Per questo motivo abbiamo esplorato l'utilità di etichettatura QD del tessuto TEM ordinariamente preparato per gli studi di immunocitochimica correlativi. QD applicato a resina epossidica acidato o sezioni resina acrilica da Licampioni di biopsia di tessuto e ghtly aldeide fissi offrono la possibilità di ottenere correlativa dati TEM microscopia a fluorescenza e da un singolo campione.

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Protocollo

1. Tissue dissezione e la fissazione

  1. Tissue Dissection
    1. Sezionare pezzi di tessuto da un tumore campione o biopsia del tessuto asportato chirurgicamente.
      Nota: Il tessuto utilizzato in questo studio è stato regolarmente fissato in formalina, ma tessuto fresco è anche adatto. Abbiamo scelto una zona confermata e riportato da un anatomo-patologo per contenere somatostatinoma del tumore dopo routine di colorazione istologica ed immunoistochimica anti-somatostatina (non mostrate).
    2. Utilizzare pezzi di tessuto non più grandi di circa 1,0 mm 3.
  2. Cacodylate Buffer Preparazione
    1. Preparare una soluzione tampone stock (1 M) aggiungendo 21,4 g di cacodilato di sodio (vedi Elenco Materials) e 3,0 ml di 1% di soluzione di cloruro di calcio a 90 ml di acqua distillata e poi rabbocco soluzione ad un volume finale di 100 ml. Agitare la soluzione e lasciar riposare durante la notte in modo che il reagente cristallino si dissolve completamente.
    2. Preparare una soluzione tampone di lavoro con l'aggiunta di 20 ml di soluzione madre a 170 ml di acqua e quindi il controllo del pH con le strisce indicatrici. Aggiustare il pH a 7,4 mediante aggiunta di 3 - 4 gocce di 3% HCl. Riempire la soluzione ad un volume finale di 200 ml con molarità finale di 0,1 M.
  3. Fissativo Preparazione e utilizzo
    1. Aggiungere una 10 ml fiala di soluzione di glutaraldeide al 50% a 20 ml di soluzione di sodio cacodilato magazzino (1 M). Rabboccare con acqua distillata a 190 ml. Controllare il pH e regolare a 7,4 aggiungendo 1 - 4 gocce di acido cloridrico 3% (HCl) se necessario.
    2. Riempire con acqua distillata per ottenere un volume finale di 200 ml.
    3. Immergere il tessuto in fissativo contenente 2,5% di glutaraldeide in 0,1 M tampone sodio cacodilato pH 7,4 per 24 ore a 4 ° C in una provetta di vetro. Eliminare fissativo inutilizzata dopo 1 settimana.

2. Elaborazione di tessuti e l'inclusione

  1. osmio Tetroidrossido di colorazione
    1. Dopo la fissazione è completa, immergere il tessuto in tampone cacodilato di sodio (0,1 M) per 20 minuti quindi ripetere per altri 20 min.
    2. Preparare una tetrossido di osmio acquosa al 2% (OsO 4) soluzione di lavoro aggiungendo 8,0 ml di una OsO 4 stock soluzione al 5% a 2,0 ml di soluzione di sodio cacodilato scorta (1 M) e 10,0 ml di acqua distillata per ottenere un volume finale di 20.0 ml.
    3. Rimuovere il buffer poi immergere il tessuto 2% OsO 4 a pH 7,4 per 4 ore a temperatura ambiente.
      ATTENZIONE! Prestare attenzione quando decantazione e la preparazione OsO 4 soluzioni, indossare dispositivi di protezione adeguati e lavorare in una cappa aspirante in ogni momento.
  2. Acetato di uranile colorazione
    1. Dopo osmication tessuto, rimuovere la soluzione OsO 4 e immergere il tessuto in acetato di sodio 2% per 10 min. Rimuovere 2% acetato di sodio poi immergere nel 2% acetato di uranile per 1 ora atemperatura ambiente.
  3. Disidratazione
    1. Disidratare tessuto attraverso alcoli graduati. Utilizzare etanolo al 50% per 10 minuti, 70% di etanolo per 10 min, 95% di etanolo per 10 minuti e due cambi di etanolo al 100% per 20 min ciascuno a temperatura ambiente.
    2. Eseguire due cambi di 100% di acetone per 30 minuti ciascuno.
  4. Resina di impregnazione e polimerizzazione
    1. Miscela di resina epossidica a bassa viscosità in una tazza polietilene monouso. Aggiungere 10,0 g di biossido di vinil cicloesene (ERL 4221) monomero epossidico, 6 g di diglicidil etere di glicole polipropilenico (DER 732) e 26,0 g di anidride succinica nonenyl (ANS). Mescolare accuratamente a mano con bastoni di legno per 2 minuti.
    2. Aggiungere quindici gocce di 2-dimethylaminoethanol acceleratore (DMAE) epossidica e mescolate ancora per 2 minuti. Fare attenzione a mescolare completamente i componenti ERL, DER e NSA prima di aggiungere l'acceleratore DMAE.
    3. Inizia resina di impregnazione del tessuto sostituendo 100% acetone 1: 1 resinaacetone per 1 ora, quindi sostituire con 6: 1 resina acetone per 3 ore, e, infine, resina 100% durante la notte.
    4. Trasferire il tessuto in resina fresca in 8 micromoulds mm. Cure a 70 ° C durante la notte. Resina dovrebbe essere difficile, ma non fragile dopo l'indurimento.

3. Ultramicrotomia

  1. Parametri coltello, il taglio e la sezione di spessore
    1. Inserire una lama di diamante semisottile nel ultramicrotomo e tagliare le sezioni di tessuto con uno spessore di 500 nm.
    2. Float sezioni sul bagno d'acqua dietro il filo della lama. Pick up sezioni su un vetrino e asciugare giù per 10 a 20 secondi utilizzando una piastra riscaldante a circa 110 ° C.
    3. Etch sezioni con una soluzione di sodio etossido per 20 secondi e poi lavare con etanolo al 100% di acqua distillata poi. Stain con il 2% di blu di metilene in 1% di borace per 20 sec sulla piastra, sciacquare con acqua corrente per 5 secondi e secco sulla piastra per 5 sec. poi Stain con 1,5% fucsina base sulla piastra per 5 secondi poi asciugare sulla piastra per 20 secondi.
    4. Esaminate dal campo chiaro microscopia ottica e confermare che le cellule tumorali e una regione di interesse (ROI) sono presenti nella sezione.
    5. Modificare il coltello diamante semisottile a un coltello di diamante ultrasottile e impostare il corretto angolo di taglio e coltello velocità consigliato dal produttore coltello.
    6. Tagliare sezioni ultrasottili a 90 nm di spessore. Osservare la colorazione oro delle sezioni in cui galleggiano sul bagnomaria.
    7. Allungare e appiattire le sezioni agitando vapori di cloroformio da 1 cm 2 pezzo di carta da filtro entro pochi millimetri di sezioni. Fare attenzione a non portare la carta imbevuta di cloroformio in contatto con la superficie dell'acqua.
  2. Ultrasottile Sezione griglia di montaggio
    1. Sollevare le sezioni ultrasottili dalla superficie dell'acqua con un 300-rete sottile barra griglia di nichel TEM che è stato immerso nella sezione Adhesive soluzione. Individuare le sezioni sul lato opaco della griglia. Le griglie hanno una superficie opaca o opaca su un lato e una superficie lucida o lucida sull'altro lato. Non è richiesta alcuna pellicola di supporto. Nota: E 'necessario gestire queste griglie con pinze anti-magnetici per evitare griglie attaccare alle pinze.
    2. Preparare l'adesivo sezione posizionando 20 cm di nastro adesivo trasparente in un flaconcino da 5 ml con 2,0 ml di acetone. Cap e agitare il flaconcino, lasciate riposare per 10 minuti poi rimuovere il nastro lasciando la soluzione adesiva.

4. immunomarcatura

  1. Antigen Unmasking
    1. Preparare 1 ml di soluzione di attacco fresco satura metaperiodato di sodio in acqua distillata ed utilizzare immediatamente. Inserire goccioline di soluzione di attacco su una superficie labfilm pulita.
    2. Posizionare griglie completamente a secco con sezioni giù gocce di soluzione di metaperiodato di sodio a temperatura ambiente per 30 min. Trasferire le griglie per distillata dro acquaplets per 60 sec di lavaggio.
  2. Incubazione e QD sonda etichettatura
    1. Eseguire tutte le incubazioni e l'etichettatura sulle goccioline di soluzione posti su una superficie pulita Parafilm.
    2. Posizionare la griglia su una gocciolina di 0,05 M glicina in PBS per 10 minuti per bloccare l'aldeide residua nella sezione. Rimuovere il blocco aldeide dalla brevemente tamponando il bordo della griglia.
    3. Posizionare la griglia su una goccia di siero normale di capra 1% (NGS) e 1% BSAC (10%) in PBS per 10 min. Preparare la soluzione di saturazione con l'aggiunta di 10 ml di NGS e 100 ml di BSAC a 890 ml di PBS per dare un volume finale di 1000 ml.
    4. Condizionare sezioni mettendo su una goccia di diluente per 10 min.
    5. Eseguire l'incubazione immunomarcatura usando anti-somatostatina anticorpo policlonale diluito 1:10 con diluente dare una concentrazione di 3,47 g / L. Nota: incubazione anticorpo è fatto mettendo griglie su goccioline per 1 ora a camera temperature in una camera umida.
    6. Rimuovere anticorpo dal punto 4.2.5 tamponando il bordo della griglia poi lavare sezioni sul diluente per 2 x 5 min.
    7. Incubare in anticorpo secondario (capra biotinilato anti-coniglio policlonale) diluito 1:10 per 1 ora a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario. Lavare in diluente per 2 x 5 min.
    8. Incubare in QD coniugati streptavidina (585 nm) diluito 1:10 per 1 ora a temperatura ambiente. Coprire con un foglio di alluminio per ridurre l'esposizione alla luce durante l'incubazione.
    9. Lavare le griglie in acqua dolce distillata per 2 minuti. Tamponare i bordi della griglia secca.

5. Fluorescenza Luce Microscopia

  1. Cubi sorgente luminosa e filtro
    1. Utilizzare diodi emettitori di illuminazione 365 nm di luce (LED) per la grande campo microscopia ottica in fluorescenza. Inserire un cubo filtro con le seguenti caratteristiche: (Ex G 365 nm, BS FT 395 e EM LP 420 nm).
      Nota: Questo cubo filtro will consentire gli spettri di emissione di tutti QD formati da visualizzare simultaneamente sotto la stessa lunghezza d'onda di eccitazione.
  2. Visualizzazione e Imaging Sezioni
    1. Posizionare la sezione griglia immunostained giù su un vetrino in una goccia d'acqua e coprire con un vetrino di vetro (numero di spessore 1,5). Utilizzare microscopia ottica per valutare il modello di etichettatura, il livello di qualsiasi etichettatura non specifico e di stabilire che i controlli negativi sono evidenti di etichettatura.
    2. Identificare il ROI in relazione a barre della griglia. griglie Finder possono essere utili per stabilire le coordinate di strutture di destinazione.
    3. Acquisire le immagini di etichettatura positivo sulla sezione utilizzando una fotocamera digitale a colori con l'impostazione della fotocamera al "colore automatico FL" e "Bilanciamento del bianco" fissato a 3200K. Usare la fotocamera in modalità "esposizione automatica" con un'impostazione "Gamma" tra il 0,45 e il 1,00 per ottimizzare l'aspetto delle immagini e "guadagno analogico" impostato a 1x.Fare clic sull'icona della fotocamera nella interfaccia grafica del software Zen 2 Lite a "Live", fuoco l'immagine poi cliccare su "Snap" per acquisire l'immagine alla Framestore.
    4. Salvare le immagini come file .tif per evitare la compressione e pixelation diventando evidente.
    5. Preparare una stampa che mostra la posizione della ROI in relazione alle barre griglia o altri punti di riferimento tessuto significativi. Queste stampe saranno utili per la successiva navigazione della sezione e ri-trovare ROI mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
    6. Rimuovere la griglia dalla diapositiva, lavare in acqua distillata e delicatamente tamponare i bordi a secco.
      Nota: non utilizzare l'illuminazione troppo intensa per acquisire immagini in fluorescenza. La fotostabilità di QD permette tempi di rilevamento fino ad alcuni secondi, ma fare attenzione a non prolungare esposizione come spegnimento del segnale di QD può verificarsi dopo circa 1 min in acqua. fotostabilità estesa o permanente si ottiene solo quando QD etichettato sezioni sono disidratati con toluene eincorporato sotto coprioggetto secondo le specifiche del produttore. Tuttavia, questo processo sarà quindi esclude la possibilità di esame correlativa della stessa sezione da TEM.

6. microscopia elettronica a trasmissione

  1. TEM Set Up e la visualizzazione
    1. Trasferire la griglia al TEM per l'esame con una tensione di accelerazione di 100 kV. Utilizzare basso ingrandimento di circa 1,400X per navigare intorno alla griglia e trovare ROI che correlano con i punti di vista microscopia ottica. Visualizza i gruppi di QD a ingrandimenti intorno 50,000X.
    2. Osservare i singoli QD a 70,000X ingrandimento o superiore. Osservare le QD come strutture cristalline irregolari con densità elettronica moderata.
  2. Imaging
    1. Utilizzare una macchina fotografica digitale per l'imaging TEM. Un sensore di pixel monocromatico 1.392 x 1.040 è adeguata.
    2. Acquisire le immagini facendo clic sull'icona "Camera" su "On" nel MICRoscope interfaccia grafica del software di imaging, quindi su "Off" per memorizzare l'immagine nella Framestore. Nota: queste operazioni saranno diverse a seconda del sistema in uso del microscopio. Utilizzare la fotocamera in modalità di esposizione automatica con un'impostazione "Gamma" 1.00.
    3. Salva le immagini come file .tif.

7. CLEM Imaging

  1. Individuazione di un ROI fluorescenza da TEM
    1. Utilizzare una stampa dall'immagine microscopio ottico per individuare corrispondente ROI da TEM. Tissue elementi architettonici come i vasi sanguigni e strutture luminali sono utili per la navigazione intorno alla sezione tramite TEM.
    2. Acquisire un'immagine corrispondente ROI TEM.
  2. CLEM Sovrapposizione immagine
    1. Assicurarsi che l'immagine TEM sia orientato correttamente l'immagine al microscopio ottico con e correggere l'ingrandimento di ogni modo che la stessa struttura visto in ciascuna modalità è la stessa dimensione.
    2. Orientemangiato il microscopio ottico e le immagini TEM e mostrano loro side-by-side o come overlay per evidenziare le caratteristiche ultrastrutturali di immunolabeled ROI.
    3. Creare un'immagine sovrapposizione con Photoshop CS2. Innanzitutto, ingrandire l'immagine di fluorescenza allo stesso ingrandimento come immagine bassa potenza TEM. Orientare entrambe le immagini e quindi incollare fianco a fianco su una tela.
    4. Appiattire l'immagine.
    5. Creare la sovrapposizione di fluorescenza da questa immagine composita. Clicca su "Selezione rettangolare Tool", selezionare l'immagine di fluorescenza e creare un livello duplicato da esso.
    6. Regolare il "Stile livello / Opzioni di fusione" a 30 - 40% di trasparenza.
    7. Fare clic sul "Move Tool" e trascinare il livello di fluorescenza sovrapporre l'immagine TEM corrispondente sopra. Allineare le immagini.
    8. Dopo aver raggiunto l'allineamento, "Appiattire" gli strati per produrre l'immagine di sovrapposizione finale.
    9. Utilizzare la "Selezione rettangolare Tool" per selezionare la nuova immagine di sovrapposizione di unND copiarlo in una nuova tela. Salva come un file .tiff.

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Risultati

Il campione somatostatinoma tumorali utilizzati per questo studio comprendeva le cellule tumorali che formano strutture duttali mescolato con il tessuto dello stoma collagene. Al microscopio ottico a fluorescenza, le cellule tumorali singole che conteneva abbondanti granuli secretori hanno mostrato l'etichettatura positiva per l'ormone della somatostatina. Nuclei apparso fori scuri con marcatura non specifica minima rilevabile (Figura 1). A bassi ingrandimenti, v...

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Discussione

Questo studio ha dimostrato la potenziale utilità di QD come sonde universali per gli studi CLEM. I 585 nm nanoparticelle QD utilizzati hanno mostrato fluorescenza brillante e stabile se visti al microscopio ottico widefield e sono stati prontamente osservati da TEM. Un precedente studio da uno dei presenti autori hanno dimostrato QD anche essere adatto a super-risoluzione microscopia ottica 7. La loro fotostabilità era particolarmente utile per periodi estesi e visualizzazione esposizioni di imaging lunghi. ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il supporto di Xiao Juan Wu (Laboratorio di Immunoistochimica) e del Dipartimento di Anatomia Patologica, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, Nuovo Galles del Sud, Australia.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cacodilato di sodioProscitechC0205Sostanza chimica nociva
Tetrossido di osmioProscitechC010Utilizzare solo in cappa aspirante
Acetato di uranileUnivar-Ajax569Sostanza chimica pericolosa
Etanolo 100%FronineJJ008
Acetone 100%FronineJJ006
ERL 4221ProscitechC056
DER 732ProscitechC047
NSAProscitechC059
DMAEProscitechC050
Sodio metaperiodatoAnalar BDH10259
anticorpo anti-somatostatinaDakoA0566
Diluente anticorpaleDakoS3022
Qdot 585 Coniugato di streptavidinaInvitrogenQ10113MP
Capra biotinilata anticorpo IgG anti-coniglioSigmaB7389-1ML
Glutaraldeide 50%EMS16320
Siero di capra normaleInvitrogenPCN5000
PBS "Dulbecco A"Ossoide 
BSAc (10%)Aurion900.022
ParafilmPechiney PPM
Strisce indicatrici di pH (pH 2,0 - 9,0)Merck1.09584.0001
MicrostampiProscitechRL063
Coltello diamantatoDiatomeeUltra 45
Microscopio elettronico a trasmissioneFEIMorgagni 268D
Microscopio ottico a fluorescenzaCarl ZeissAxioscope A1
Griglie 300 mesh nichel (barra sottile)Agar ScientificG2740N
UltramicrotomeRMCPowertome
TEM software di controllo della fotocameraImaging SystemAnalySISVersione 3.0
Software di elaborazione immaginiAdobe Systems PhotoshopCS2
BR0014G Soft incorporato

Riferimenti

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