Calcio Imaging in<em&gt; Drosophila</em&gt; All&#39;attivazione Egg

Sommario

Questo articolo descrive un adattabile ex vivo protocollo per la visualizzazione Ca ²⁺ durante l'attivazione uovo in Drosophila.

Abstract

L'attivazione dell'uovo è un processo universale che include una serie di eventi per consentire all'ovulo fecondato di completare la meiosi e avviare lo sviluppo embrionale. Un aspetto dell'attivazione dell'uovo, conservato in tutti gli organismi esaminati, è un cambiamento nella concentrazione intracellulare di calcio (Ca²⁺) spesso definito "onda di Ca²⁺". Mentre la velocità e il numero di oscillazioni dell'onda di Ca²⁺ varia tra le specie, il cambiamento nel Ca²⁺ intracellulare è fondamentale per determinare eventi essenziali per lo sviluppo embrionale. Questi cambiamenti includono la ripresa del ciclo cellulare, la regolazione dell'mRNA, l'esocitosi dei granuli corticali e il riarrangiamento del citoscheletro.

Nell'uovo maturo di Drosophila, l'attivazione avviene nell'ovidotto femminile prima della fecondazione, avviando una serie di eventi dipendenti dal Ca²⁺. Qui presentiamo un protocollo per l'imaging dell'onda di Ca²⁺ in Drosophila. Questo approccio fornisce un sistema di modelli manipolabile per interrogare il meccanismo dell'onda di Ca²⁺ e i cambiamenti a valle ad essa associati.

Introduzione

Un cambiamento di Ca ²⁺ intracellulare di concentramento di uovo (ovocita) di attivazione è un componente conservato di tutti gli organismi studiati ^1,2. Questo evento avvia una vasta gamma di Ca ²⁺ -dipendente processi, compresa ripresa del ciclo cellulare e la traduzione di mRNA memorizzati. A causa di questo requisito di Ca ^2+, visualizzando i cambiamenti transitori intracellulare di Ca ²⁺ concentrazioni è stato di interesse di riferimento.

Storicamente, organismi modello sono stati selezionati per lo studio di attivazione uovo in base alle dimensioni e alla disponibilità delle loro uova. Vari approcci di visualizzazione sono stati utilizzati per seguire e quantificare i cambiamenti in intracellulare di Ca ²⁺ concentrazioni in questi sistemi, tra cui: la aequorina fotoproteina in Medaka pesce ^3; Ca ²⁺ coloranti fluorescenti sensibili come Fura-2 in riccio di mare e criceto ^4,5; e calcio verde-1-destrano in Xenopus ^6.

La generazione e miglioramento degli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) ha trasformato la capacità di visualizzare Ca ²⁺ dinamica in vivo ^7. Questi costrutti genetici sono espressi in tessuti specifici e limitano la necessità di una preparazione di tessuto invasive ^8.

GCaMPs sono un verde proteina fluorescente (GFP) classe basata su di GECIS che sono stati molto efficaci a causa della loro elevata Ca ²⁺ affinità, il rapporto e la capacità di rapporto segnale-rumore per essere personalizzati ^9-11. In presenza di Ca ^2+, il complesso GCaMP subisce una serie di cambiamenti conformazionali, iniziando con il legame di Ca ²⁺ a calmodulina, che si traduce in una maggiore intensità fluorescente del componente GFP ^9.

GCaMPs sono stati ampiamente utilizzati nel campo della ricerca sui neuroni Drosophila di visualizzare cambiamenti nel calcio intracellulare ^12. Le appli recentisu tecnologia GCaMP di visualizzare Ca ²⁺ in uova di Drosophila mature ha rivelato un solo transitorio Ca ²⁺ onda all'attivazione uovo ^13,14. L'onda Ca ²⁺ può essere visualizzato a basso ingrandimento durante l'ovulazione in vivo ¹³ o a maggiore ingrandimento utilizzando un test ex vivo di attivazione ^13,14. Nel test ex vivo, singoli ovociti maturi sono isolati dalle ovaie e attivate con una soluzione ipotonica, indicati come buffer di attivazione, che ha dimostrato di ricapitolare gli eventi vivo attivazione ^15-17.

Questo test ex vivo consente una facile visualizzazione ad alta risoluzione del Ca ²⁺ onda in diverse condizioni sperimentali, tra cui interruzione farmacologica, manipolazioni fisiche e mutanti genetici. Questo articolo illustra la preparazione di uova di Drosophila maturi per ex vivo di attivazione e THe successivamente microscopio usato per visualizzare l'onda Ca ²⁺ tramite GCaMP. Questo approccio può essere utilizzato per testare l'apertura e controllo dell'onda Ca ²⁺ e per sondare risultati valle.

Protocollo

Nota: Eseguire tutte le misure a temperatura ambiente, se non diversamente indicato.

1. Preparazione per la dissezione

Nota: I passi qui descritti sono conformi E. Gavi, Princeton University e Weil et. al. ^18. Effettuare le seguenti operazioni due giorni prima di imaging.

1. Prendere una fiala mosca contenente circa 10 ml di cibo solido e aggiungere una piccola quantità di lievito secco per un angolo, meno di 1 g è sufficiente.
   Nota: Per informazioni su fiale mosca o cibo vedere 'Drosophila Manutenzione' ^19.
2. Aggiungere 1 - 3 gocce d'acqua per idratare il lievito.
3. Impostare la fiala parte ad un angolo di 45 ° e consentire 3 - 5 min per il lievito per prendere l'acqua.
4. Mentre il lievito sta assorbendo l'acqua, scegliere una bottiglia di mosche che esprimono UASt- MYR GCaMP5 ²⁰ guidata da vasca-VP16GAL4 (denominato GCaMP5) che hanno recentemente emerse (un myristoymodulo lata del GCaMP5 è stata scelta per fornire un elevato rapporto segnale rumore attraverso legare il GECI alla membrana nell'uovo).
5. Anestetizzare le mosche in bottiglia con gas CO _2. Assicurarsi di tenere la bottiglia capovolta in modo da non perdere le mosche nel cibo umido.
6. Suggerimento le mosche anestetizzati su un batuffolo di CO ₂ e di tipo 10 - 15 femmine e 5 maschi con un pennello sotto un microscopio da dissezione. Nota: E 'standard per includere i maschi per fornire le femmine sani per la dissezione.
7. Quando la fiala dal punto 1.3 è pronto, aggiungere le mosche selezionati al flaconcino. Fare attenzione a tenere la orizzontale flacone fino a quando le mosche diventano attivi.
8. Posizionare il flacone a 25 ° C per circa 36 ore.
9. Riportare le restanti mosche dal CO ₂ pad per la bottiglia o scarti.

2. dissezione Drosophila ovaie

Nota: I passi qui descritti sono conformi Weil et. al. ^18.

1. Dopo 36 ore, anestetizzare le mosche dal flaconcino yeasted con CO _2.
2. Una volta che le mosche all'interno della fiala vengono anestetizzati loro punta sul pad CO ₂ per essere filtrate con un pennello sotto un microscopio da dissezione.
3. Selezionare una femmina.
4. Isolare le due ovaie dalla femmina. Per un pieno protocollo dettagliato vedere Weil et. al. ^18. In sintesi:
   1. Mettere una piccola goccia di olio Halocarbon ossigenato (serie 95) su un No. 1.5, 22 x 40 mm coprioggetto.
   2. Afferrare la femmina con una pinza a anterior dell'addome.
   3. Tenendo la femmina sotto il microscopio da dissezione, utilizzare il secondo set di pinze per rimuovere delicatamente la parte posteriore del femminile.
   4. Pulire il tessuto posteriore, dalla seconda pinza.
   5. Premere sulla cavità addominale con la seconda pinza da anteriore a posteriore dell'addome. I due ovaie opache devono attenersi ai forcipe al di fuori della femaLe.
   6. Toccare le ovaie nell'olio.
   7. Rimuovere qualsiasi tessuto dalle pinze pulendo fuori le pinze.
   8. Ripetere questi passaggi (2.4.1 - 2.4.7) per ottenere tre lamelle, ognuna ovaie contenenti da una mosca.

3. isolamento individuale uova mature

1. Sotto un microscopio da dissezione di serie con l'ingrandimento impostato 4X, il primo vetrino dal punto 2.4, separare le due ovaie strappando ovidotto.
2. Introdurre un paio di pinze chiuse al centro di un singolo ovaio, facendo attenzione a non forare qualsiasi camere d'uovo.
3. Inserire una sonda dissezione standard al centro della dell'ovaio accanto alle pinze chiuse.
4. trascinare delicatamente la sonda dissezione attraverso l'ovaio verso il polo posteriore, dove si trovano le uova mature (fase 14 camere d'uovo).
5. Ripetere i passi 3.1 - 3.4 2 - 5 volte a seconda delle dimensioni delle ovaie e numero di uova.
   Nota: L'aggiunta di CO ₂ normalmente provoca la deposizione di un singolo uovo che apparirà più grande con appendici dorsali sollevate dalle uova pre-depositato. Questo uovo deve essere eliminata per l'imaging in quanto è già stato attivato all'interno della femmina.
   Nota: le uova mature sono suscettibili di separare facilmente dal tessuto connettivo ovarico.
6. Se non ci sono le uova mature sono visibili al di fuori delle ovaie, continua dolcemente prendere in giro con la sonda dissezione.
7. Una volta che le uova mature sono visibili sul vetrino di fuori delle ovaie, manovrare 3 - 5 in una linea al centro del vetrino.
   Nota: Per ottenere risultati ottimali, eseguire la sonda delicatamente lungo il lato delle uova.
   Nota: Evitare di tirare su le appendici dorsali come questo può danneggiare l'uovo.
   Nota: A seconda del futuro di imaging di set-up, allineare le uova di circa 200 micron a parte perpendicolare al vetrino per la massima area di esposizione.
8. Una volta allineata, rimuovere il resto del tessuto ovarico trascinandola lontano dalle uova allineate usando l'forceps.
9. Rimuovere l'olio in eccesso tamponando con l'angolo di pulire un medico. Fare attenzione a non toccare le uova mature con il medico wipe uova mature che vengono contattati verranno persi.
10. Disegnare un mirino sul vetrino con un pennarello per semplificare l'individuazione del campione sotto il microscopio.
11. Impostare il vetrino in un luogo sicuro e lasciare le camere di uova preparate sul vetrino di riposare per 5 - 10 minuti. Questo permette l'uovo di stabilirsi nell'olio. I campioni possono essere utilizzati fino a 1 ora dopo la dissezione.
12. Ripetere i passaggi 3,1-3,11 per il resto i coprioggetti con ovaie su di loro.

4. Preparazione per l'imaging

1. Portare buffer di attivazione preparati ¹⁵ a temperatura ambiente.
   Nota: tampone attivazione è un buffer ipotonico: 3.3 mM NaH ₂ PO _4, 16.6 mM KH ₂ PO _4, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% di polietilenglicole 8000, 2 mM CaCl _2, portata a pH 6,4 con 1: 5 rapporto di NaOH: KOH.Per ulteriori informazioni, vedere Mahowald 1983 ^15. Aliquote di buffer di attivazione può essere conservato a -20 ° C per mesi e a 4 ° C fino a 2 settimane.
2. trasportare con cura vetrini preparati, buffer di attivazione e pipette di vetro per l'impianto di imaging.
   Nota: Un grande campo, confocale, disco rotante o microscopio foglio di luce possono essere utilizzati. Si consiglia di utilizzare un microscopio invertito. I nostri risultati rappresentativi sono stati ottenuti utilizzando un microscopio confocale.
3. Un obiettivo adatto per l'imaging dell'intero uovo maturo dovrebbe essere scelto (qui: 20X 0.7 NA).
4. Montare il primo vetrino preparato sul palco microscopio. Fare attenzione a non rompere i coprioggetti sul palco.
5. selezionare Qualitativamente un campo visivo con una camera di uovo maturo per l'attivazione. Non immagine forato camere uovo o con blebbing nella membrana.
   Nota: Per i passaggi 4.6 - 4.7, comandi software variano a seconda del microscopio e produttore.
6. Set para immaginimetri per l'eccitazione di serie GFP (488 nm) ed emissione (500-580 nm). Anche impostare una visualizzazione brillante campo, al fine di visualizzare e orientare l'uovo maturo e olio di sfollati.
7. Selezionare la più bassa Z-piano in cui le uova mature sono visibili e impostare un Z-stack completo da prendere per 40 micron a circa 2 micron per passo. Impostare i parametri in modo non vi è alcun ritardo tra l'acquisizione Z-stack. Impostare la serie temporale per catturare per circa 30 min.

L'attivazione 5. Imaging Ex Vivo Egg

1. Inizia la cattura delle immagini.
2. Attendere 1 - 2 pieni Z-stack da acquisire. Ciò dimostra l'uovo maturo prima dell'attivazione.
3. Prelevare circa 300 ml di tampone di attivazione in una pipetta di vetro.
4. Posizionamento la punta della pipetta di vetro contenente tampone di attivazione ad un angolo di 45 ° al di sopra del vetrino, spostare lentamente la pipetta nel percorso del raggio fino a quando non si trova direttamente sopra l'uovo maturo viene esposta. La pipetta di vetro dovrebbeessere di 1 - 2 cm sopra l'olio.
5. Aggiungere 1 - 2 gocce di tampone di attivazione in meno di 5 secondi dalla pipetta di vetro. Questo dovrebbe sostituire l'olio. Evitare di aggiungere buffer di attivazione eccesso o toccare l'uovo con la pipetta di vetro in quanto può causare lo spostamento della uovo maturo. Fare attenzione a non toccare il vetrino con la pipetta come questo può causare un cambiamento nel piano o bolle d'aria focali per formare in olio di immersione tra l'obiettivo e il vetrino.
6. Mentre l'aggiunta di buffer di attivazione durante l'acquisizione dell'immagine, controlla il canale in campo chiaro per garantire che l'olio è stato spostato dal buffer di attivazione.
   Nota: Innanzitutto, verrà visualizzato come un ombra di pipetta rompendo il percorso del fascio ma anche provocare la comparsa di piccole goccioline di olio. Alcune gocce di olio possono rimanere associati con l'uovo maturo che interesserà i risultati sperimentali e la qualità delle immagini.
7. Se l'olio non si sposti dalla aggiunta iniziale di ripetizione buffer di passaggi di attivazione 5.4 - 5.6.
8. Una volta che l'olio è spostato con successo, consentire la serie temporale di eseguire fino al completamento.
   Nota: a causa di gonfiore di ovociti in attivazione, alcuni camere d'uovo si sposteranno drammaticamente fuori del piano focale o campo visivo dopo l'aggiunta di tampone di attivazione. In questa situazione, interrompere l'acquisizione e montare il successivo coprioggetto.
9. Dopo la sequenza di immagini è stata completata l'acquisizione, il salvataggio dei dati.

6. post-acquisizione Image Processing

1. Aprire il set di dati tramite Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), o il software di elaborazione delle immagini equivalente, e selezionare i file rilevanti per l'analisi.
2. Per costruire una proiezione dei dati acquisiti selezionare: Immagine> Stack> Z-progetto.
3. Selezionare un inizio Z-slice e una fermata Z-slice, in genere l'intera sezione. Selezionare un tipo di proiezione, di solito impostato su 'Max intensita'. Casella di spunta 'All Time Frames' per applicare le impostazioni selezionate per l'intera serie.
4. Sepiù di un canale fluorescente è stato ripreso, utilizzare lo strumento dei canali per consentire il movimento tra i colori, fare un composito, o fare la scala di grigio dell'immagine. Seleziona Immagine> Colori> Canali strumento.
5. Per regolare la luminosità e il contrasto selezionare Immagine> Regola> Luminosità / Contrasto.
6. Per esportare una singola immagine, spostare cursore scala temporale al fotogramma rilevante e selezionare File> Salva con nome> Jpeg, o qualsiasi formato preferito.
7. Scegliere una posizione e il titolo per il file esportato, quindi salvare.
   Nota La frequenza di fotogrammi dal software di imaging sarà tenuto a dare un timestamp sull'immagine.
8. Per esportare la serie temporale come un film selezionare: File> Salva con nome> AVI, quindi selezionare il frame rate (~ 7 fotogrammi al secondo).
9. Scegliere una posizione e il titolo per il file esportato, quindi salvare.
10. Per salvare il file in formato rettificato Fiji, selezionare File> Salva.

Risultati

Qui abbiamo dimostrato come preparare le uova di Drosophila mature per l'attivazione ex vivo. Le uova che esprimono un consentirà di imaging GECI di Ca ²⁺ dinamiche all'attivazione uovo e l'inizio dello sviluppo embrionale (Figura 1). Va notato che in base alla GCaMP utilizzato, in particolare la presenza di un gruppo miristoile, i risultati possono avere leggere differenze qualitative ^{13 14.} Abbiamo anche dimostrato un ruolo per actina funzionale durante l'attivazione uovo con l'aggiunta di un inibitore di polimerizzazione, citocalasina D, al buffer di attivazione (Figura 2) ^14.

Un requisito per il citoscheletro all'attivazione uovo si conserva. In C. elegans, dopo la fecondazione, i componenti del citoscheletro vengono riorganizzati per preparare l'embrione unicellulare per la prima divisione asimmetrica ^21,22. In riccio di mare, interruzione di cytoskeletal riorganizzazione seguente attivazione è mostrato di influenzare il ciclo cellulare, impedendo la formazione dell'anello contrattile ^23. Il ruolo di actina nel mediare un'onda di Ca ²⁺ e la sua funzione a valle di attivazione uovo in Drosophila deve essere ancora pienamente chiarito.

In Drosophila, co-visualizzazione del Ca ²⁺ onda e citoscheletro actina può essere ottenuto da questo test attivazione ex vivo. Serie temporali di più canali possono essere acquisite e dinamica del intracellulare di Ca ²⁺ può essere abbinato con i cambiamenti nell'organizzazione actina nell'ovocita (Figura 3).

Figura 1:. A Single Ca ²⁺ Saluto in serie Drosophila uovo di attivazione Tempo di ex vivo maturo Drosophila uovo esprimere UASt- myrGCaMP5 dopo l'unaddition di tampone di attivazione (AH). L'aumento Ca ²⁺ citoplasmatico origine al polo posteriore (B) e si propaga (BF) con una velocità media di circa 1,5 micron / sec. Initiation dell'onda è tipicamente osservata entro 3 min della aggiunta di tampone di attivazione. Dopo l'attivazione, i livelli intracellulari di calcio del uovo maturo torna a livelli pre-attivazione (G, H). Vedere film supplementare 1 (tempo totale 33 min). Barre di scala = 50 micron. Proiezione MAX = 40 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Aggiunta di Citocalasina D per l'attivazione del buffer perturba Ca²⁺ onda di propagazione. Serie temporali di ex vivo maturo Drosophila uovo esprimere UASt- myrGCaMP5 seguente aggiunta di tampone di attivazione contenente 10 mg / ml citocalasina D concentrazione finale (AH). Mentre il Ca ²⁺ onda viene avviata al polo posteriore (A), viene compromessa e non raggiunge anteriore dell'uovo (F) (frecce bianche indicano il fronte dell'onda). Nessun ulteriore state osservate Ca ²⁺ modifiche oltre 30 min). Vedere film supplementare 2 (tempo totale di 30 minuti). Barre di scala = 50 micron. Proiezione MAX = 40 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Co-visualizzazione di actina e Ca ²⁺ in EAttivazione gg in serie Drosophila. Tempo di ex vivo maturo Drosophila uovo esprimere UASt- myrGCaMP5 (Ciano) e UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) in seguito all'aggiunta di buffer di attivazione (AH). Il Ca ²⁺ onda inizia dal polo posteriore e recupera come in figura 1. Actina sembra cambiare nel tempo, frecce bianche (A vs H). La mancanza di rilevamento del segnale Ca ²⁺ nel centro dell'uovo matura è dovuto al movimento del campione durante l'acquisizione dell'immagine. Barre di scala = 50 micron. Proiezione MAX = 40 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il primo passo critico di questo protocollo è isolare gli ovuli maturi senza danni. Ciò può essere ottenuto manovrando delicatamente le uova con la sonda di dissezione. La pratica permetterà di eseguire questa manipolazione senza danneggiare le uova. Un secondo passo cruciale è evitare la perdita del campione quando il tampone di attivazione viene applicato all'uovo maturo in olio. L'applicazione del tampone di attivazione deve essere effettuata lentamente e senza contatto con il vetrino. Questo passaggio può essere impegnativo se la configurazione del microscopio non consente un facile accesso al campione. Si consiglia di spostare le parti ascellari del microscopio, come un'incubatrice a temperatura.

È possibile apportare modifiche a questo protocollo per visualizzare altri fattori marcati in fluorescenza, invece del Ca²⁺ all'attivazione dell'uovo. Più in generale, le diverse fasi di sviluppo della Drosophila o i risultati dell'aggiunta di un tampone diverso potrebbero essere analizzati utilizzando questo protocollo.

Potrebbe essere necessaria la risoluzione dei problemi se le impostazioni del microscopio non sono ottimali per visualizzare il segnale dal campione. Ciò può essere ottenuto aumentando o diminuendo la potenza del laser, modificando il raggio di acquisizione e regolando i parametri Z-stack. Un altro problema potrebbe essere rappresentato dal fatto che le uova si spostano costantemente fuori dal campo visivo dopo l'aggiunta del buffer di attivazione. Se ciò accade regolarmente, lasciare che le uova mature si depositino sui vetrini coprioggetti per un periodo di tempo più lungo, da 15 a 20 minuti. Fare attenzione che l'uso di un olio a viscosità più elevata altererà lo spostamento dell'olio tramite il tampone di attivazione.

Questa tecnica qui presentata è limitata dalla distanza di lavoro dell'obiettivo, dalla disidratazione degli ovuli maturi e dalla capacità di sezionare gli ovuli maturi senza danni. Tuttavia, rispetto ai metodi di imaging in vivo in cui l'ovocita maturo passa attraverso la femmina adulta e viene depositato ¹³, il nostro metodo consente una maggiore risoluzione spaziale, la possibilità di manipolare fisicamente l'ovulo maturo prima dell'attivazione e la capacità di testare il ruolo dell'attivazione dell'ovulo senza fecondazione.

Ci sono molte potenziali applicazioni future di questa tecnica, tra cui il test di costrutti reporter per componenti cellulari all'attivazione dell'uovo e la visualizzazione dell'onda Ca²⁺ in sfondi mutanti ^14,24. Insieme a strumenti sperimentali e genetici, il saggio di attivazione dell'uovo ex vivo qui presentato consente lo studio dell'innesco, della propagazione e degli effetti a valle dell'onda di Ca²⁺ universalmente conservata.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lievito attivo secco	Fleischman' s	# 2192
Microscopio da dissezione	Leica	MZ6	Vari funzioneranno
Lampada	Mircotec Fibra ottica	MF0-90	Vari funzioneranno
Salviette mediche	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Pennarello	Stabilo	841/46	OHPen universale, nero - disponibile nella maggior parte delle cartolerie. Larghezza superfine 0,4 mm
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)
Vetrino coprioggetti n. 1,5, 22 x 50 mm	Internazionale- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T
Olio alocarbonico, serie 95	Halocarbon Products Corp.	Distributore in Europa:
Solvadis (GMBH)
Oil 10 S	VWR Chemicals	24627.188	Può essere utilizzato al posto dell'olio alocarbonico, serie 95
Pinze	Fine Science Tools	11252-00	Sebbene questi strumenti debbano essere puliti, l'uso di un'autoclave non è necessario, l'etanolo sarebbe sufficiente.
	Sonda Fine Science Tools	10140-01
Pipetta in vetro	Fisherbrand,	FB50251	Pasteur Pipettes, vetro, senza tappo, lunghezza 150 mm
Fiala	Regina Industries	P1014	GPPS  80 mm x 25 mm