Articolo metodologico

Rilevazione rapida molecolare e la differenziazione dei virus influenzali A e B

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DOI:

10.3791/54312

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30 gennaio 2017

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1Department of Laboratory Medicine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un test rapido, molecolare a base di Influenza A e B. Il saggio Influenza rileva ogni bersaglio entro 15 minuti utilizzando l'amplificazione isotermica con primer specifici per l'influenza seguita da rilevamento di target con sonde segnale molecolare. Il saggio e influenza A B è facile da usare e richiede minimi hands-on tempo per eseguire.

Abstract

L'influenza è una malattia respiratoria contagiosa causata da virus influenzali A e B negli esseri umani e provoca una notevole quantità di morbilità e mortalità ogni anno. L'influenza A e B saggio è stato il primo test molecolare rapida influenza CLIA-rinunciato a disposizione. Il test di influenza A e B funziona utilizzando l'amplificazione isotermica con primer specifici per l'influenza seguita da rilevamento di target con sonde segnale molecolare. Qui, le prestazioni della influenza A e B saggio su congelato, archiviati tampone nasofaringeo (NPS) campioni conservati in terreno di trasporto virale (VTM) sono stati confrontati con un test del pannello respiratoria.

Le prestazioni della A e B saggio Influenza stata valutata confrontando i risultati al metodo di riferimento del pannello respiratoria. La sensibilità per il virus dell'influenza A totale è stata del 67,5% (95% CI (CI), 56,6-78,5) e la specificità del 86,9% (CI, 71,0-100). Per il test virus dell'influenza B, la sensibilità e la specificità sono state 90,2% (CI, 68,5-100) E il 98,8% (CI, 68,5-100), rispettivamente.

Questo sistema ha il vantaggio di un tempo di prova significativamente più breve rispetto a qualsiasi altro test molecolare attualmente disponibili e la procedura semplice, priva di pipetta viene eseguito su un chiuso, sistema completamente integrato dimensioni ridotte. Nel complesso, l'influenza A e dosaggio B valutati in questo studio ha il potenziale per servire come test diagnostico point-of-care rapida influenza.

Introduzione

Infezioni da virus dell'influenza determinano una quantità significativa di morbilità e mortalità ogni anno 1, 2, 3. L'influenza non complicata è caratterizzata da sintomi costituzionali e respiratori quali febbre, mialgia, cefalea e tosse non produttiva 4, 5. Gli individui più anziani, bambini, pazienti immunocompromessi e pazienti con comorbilità sottostanti sono a più alto rischio di complicanze gravi come la polmonite, la miocardite, malattia del sistema nervoso centrale, o la morte 6, 7.

L'infezione influenzale è unico da altri virus respiratori in quel tempestiva somministrazione di terapia antivirale entro 48 ore dall'inizio dei sintomi può ridurre la gravità della malattia e la lunghezza 8. La rapida identificazione di influenza è stato anchedimostrato di ridurre l'uso di antibiotici inutili 9, 10. Inoltre, i pazienti ospedalizzati con infezioni influenzali devono essere collocati in locali isolati con opportune precauzioni per il controllo delle infezioni. Tuttavia, le malattie respiratorie causate da virus non influenzali possono essere difficili da distinguere da clinicamente l'influenza. Per questo motivo, i test diagnostici rapidi e precisi per l'influenza è molto importante per la gestione clinica del paziente.

Diversi test sono disponibili per il rilevamento e l'identificazione di virus influenzali. Test rapidi di rilevamento dell'influenza antigene (RIDTs) sono ampiamente utilizzati nella pratica clinica come test point-of-care perché sono semplici da usare e fornire i risultati entro 15 a 30 minuti 11, 12; tuttavia, la loro sensibilità variano ampiamente (10-80%) a seconda del produttore e la popolazione in fase di test, e il tipo di influenza e subtype 13, 14, 15. Saggi di fluorescenza diretta (DFA) forniscono sensibilità superiori rispetto RIDTs, ma il tempo di elaborazione è maggiore (~ 3 ore) e devono essere completati da tecnologi esperti 16, 17. Coltura virale è stato il gold standard per la diagnosi di influenza e ha migliorato la sensibilità su entrambi RIDTs e DFA 18. Tuttavia, l'influenza coltura virale può richiedere 2-14 d per completare, diminuendo la sua utilità nel favorire la gestione del paziente 19. Infine, nucleico test di amplificazione degli acidi (NAAT) hanno sostituito tecniche di coltura come il nuovo gold standard nella diagnostica di influenza. NAAT sono considerati avere la massima sensibilità per rilevare l'influenza in poche ore. Tuttavia, incidenza sensibile sono i test più costosi e richiedono attrezzature specializzate e tecnici di eseguire 5 , 20, 21, 22, 23, 24, 25.

Il test dell'influenza A e B qui descritto è il primo test di influenza CLIA-rinunciato molecolare rapida che è prontamente disponibile. Questo test funziona impiegando una reazione intaccare endonucleasi Amplification (NEAR) che utilizza l'amplificazione isotermica con primer specifici per l'influenza seguita da rilevamento di target con sonde segnale molecolare. Questo test differenzia dell'influenza A da B, richiede 2 min per impostare ed elaborare un campione, e richiede un totale di 15 minuti per completare.

Qui, vi presentiamo il protocollo per il saggio Influenza A & B. Inoltre, mettiamo a disposizione un insieme di dati di esempio impostare a confronto le prestazioni del virus dell'influenza A e B saggio sulla archiviato tampone nasofaringeo (NPS) campioni conservati in terreno di trasporto virale (VTM) con un kit pannello patogeno respiratorio.

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Protocollo

ETICA DICHIARAZIONE: L'utilizzo di avanzi di campioni clinici è approvato e segue le linee guida del Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Review Board.

1. Prima di eseguire il test

NOTA: L'influenza A e B test è approvato per campioni di tamponi nasofaringei e tamponi nasofaringei memorizzati nei mezzi di trasporto virale. I tamponi sono incluse nel kit e devono essere utilizzati per ottenere prestazioni ottimali. Tuttavia, rayon, schiuma, accorrevano tamponi o tamponi nasali poliestere può essere utilizzato anche per raccogliere campioni di tamponi nasali.

  1. Per raccogliere un campione di tampone nasale, inserire il tampone nella narice che ha il drenaggio più visibile o che è più congestionato. Con la rotazione dolce, spingere il tampone nella narice fino a incontrare resistenza e ruotare più volte contro la parete nasale prima di rimuovere lentamente dalla narice. Conservare i tamponi e trasportarli in fiale contenenti 3 ml di mezzi di trasporto virale (VTM).
    NOTA: Una grande attenzione al approprraccolta del campione iate deve essere preso come la raccolta dei campioni inadeguati può produrre risultati errati.
    NOTA: I campioni su tampone devono essere testati il ​​più presto possibile dopo la raccolta. Tuttavia, essi possono essere conservati a temperatura ambiente per un massimo di 2 ore o in frigorifero a 2-8 ° C per un massimo di 24 ore, se il test non è immediatamente disponibile. esemplari appena raccolti sono l'ideale per ottenere risultati ottimali. Un uso improprio del campione, la conservazione e / o il trasporto possono produrre risultati errati.
    NOTA: Come misura precauzionale, gli utenti che eseguono questo test dovrebbero trattare tutti i campioni come potenzialmente infettivi seguendo le precauzioni universali durante la manipolazione dei campioni.
  2. Portare tutti i campioni a temperatura ambiente prima del test.
    NOTA: Tutte le componenti di prova sono per un solo uso e non devono essere utilizzati per eseguire prove multiple. Non mescolare i componenti del kit con diverso numero di lotto. Non utilizzare i reagenti del kit oltre la data di scadenza.
  3. Portare il ricevitore del campione azzurro di Rootemperatura m prima del test. La base di test arancione può essere provato senza la necessità di riscaldare a temperatura ambiente.
  4. Lascia tutti i pezzi di prova nella confezione stagnola fino al momento dell'uso. Accendere lo strumento premendo il pulsante di accensione sul lato dello strumento. Inserire l'user-ID e premere 'OK'.

2. Esecuzione del test

  1. Per iniziare il processo di test, toccare 'Esegui test' sullo schermo dello strumento. Inserire l'ID del paziente utilizzando la tastiera su schermo o uno scanner di codici a barre e premere 'OK'. Aprire il coperchio e inserire la base di prova arancione nel supporto di base di test Orange.
  2. Verificare che il criterio corretto viene visualizzato sullo schermo e premere 'OK'. Inserire il ricevitore del campione azzurro nel supporto del ricevitore del campione azzurro.
    NOTA: Non aprire il ricevitore del campione prima di inserire nello strumento in modo da evitare il tampone di eluizione di raggiungere la corretta temperatura di funzionamento e può influire sulle prestazioni del test.
  3. Attendere che il ricevitore del campione si riscaldi. Quando richiesto dallo strumento, togliere la pellicola di sigillo e inserire il tampone del paziente da testare nel ricevitore campione.
    NOTA: Quando si rimuove la pellicola, posizionare due dita sul bordo del ricevitore di esempio per assicurare che rimanga al suo posto.
  4. Mescolare energicamente il tampone nel liquido per 10 secondi, premendo il capo tampone contro la parete del ricevitore campione come lo si miscela per aiutare a muovere il campione dal tampone. Premere 'OK' per procedere. Se i tamponi di test memorizzati nel mezzo di trasporto virale, VORTEX la VTM per 10 sec quindi aggiungere 200 ml al ricevitore campione.
  5. Premere la cartuccia di trasferimento bianco nel ricevitore del campione azzurro. Continuare a premere sul ricevitore campione fino la spia arancione aumenta.
  6. Sollevare e quindi collegare la cartuccia di trasferimento alla base di prova. Osservare l'indicatore arancione scendere una volta che il trasferimento della cartuccia è applicato correttamente. Chiudere il coperchio e non aprire fino a quando il "Controllo completo"Viene visualizzato un messaggio sullo schermo.

3. Controllo Qualità

  1. Toccare 'Run QC Test' sulla schermata principale. Selezionare il test di controllo di qualità per essere eseguito. Confermare il tipo di test in modo che corrisponda il campione di controllo di qualità destinato al testing toccando 'OK' e seguendo le istruzioni visualizzate per completare il test.

Interpretazione 4. Risultato

  1. Dopo l'esecuzione della prova è completa, osservare i risultati del test visualizzato sullo schermo con interpretazioni per la presenza di influenza A, B, sottotipi sconosciuti. Per ottenere risultati validi ripetere il test.

5. Manutenzione e pulizia

  1. Pulire lo strumento e la zona circostante panca ogni giorno con il 70% di etanolo o una soluzione di candeggina al 10%. Spruzzare la soluzione detergente su un panno umido, privo di lanugine per pulire. Non versare le soluzioni direttamente sullo strumento.

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Risultati

In questo studio, i campioni NPS archiviati sono stati raccolti da pazienti ricoverati con sintomi simil-influenzali al Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) nel corso di un focolaio di influenza tra il 15 Dicembre, 2012 e il 1 marzo 2013. I campioni NPS sono state presentate in 3 ml di VTM e testato come parte della pratica clinica di routine con un saggio molecolare che rileva un gruppo di virus respiratori (RP), tra cui l'influenza a, a-1, a-3, e B. Durante il periodo di stud...

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Discussione

I virus influenzali sono importanti cause mondiali di morbilità e mortalità. diagnosi rapida e accurata di influenza è una delle principali chiavi per la gestione di focolai di influenza durante la stagione delle vie respiratorie. Altri test antigene-based sono rapidi e facili da eseguire; Tuttavia, essi hanno bassi sensibilità 13. D'altra parte, i test molecolari tradizionali hanno migliorato la sensibilità, ma richiedono tecnici di laboratorio più esperti di eseguire e sono più costosi. Il ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il personale del Servizio di Microbiologia Clinica del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center per l'aiuto nella raccolta di campioni clinici. Questo studio è stato supportato in parte da un accordo di ricerca tra MSKCC e Alere Scarborough (SK2013-0262).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alere i InstrumentAlereNAT-000 (Globale), NAT-024 (US)
Alere i Influenza A & Kit di test B 24Alere425-000 (Globale), 425-024 (Stati Uniti)
Alere i Barcode ScannerAlereEQ001001
Alere Stampante universale Alere55115 (Globale), alereiprinter ( US)
200 µ L Pipetta
200 & Micro; l. puntali
Terreno di trasporto viraleRemelM4-RT
di precisioneper pipette monouso

Riferimenti

  1. Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. , Report No. 1057-5987 1-43 (2013).
  2. Poehling, K. A., et al. The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children. New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).
  3. Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).
  4. Agrawal, A. S., et al. Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection. Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).
  5. Ginocchio, C. C. Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens. Clinical Infectious Diseases. 52, suppl 4 312-325 (2011).
  6. Grohskopf, L. A., et al. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).
  7. Molinari, N. -A. M., et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs. Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).
  8. Aoki, F. Y., et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).
  9. Noyola, D. E., Demmler, G. J. Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections. The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).
  10. Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).
  11. Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay. J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).
  12. van Doorn, H. R., et al. Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam. J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).
  13. Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).
  14. Fiore, A. E., et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza --- recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).
  15. Harper, S. A., et al. Seasonal influenza in adults and children--diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).
  16. Hannoun, C., Tumova, B. Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe. European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).
  17. Leonardi, G. P. Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods. Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).
  18. Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).
  19. Lee, G. C., et al. Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses. Virol J. 7, 244(2010).
  20. Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).
  21. Bandt, D., et al. Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation. Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).
  22. Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).
  23. Teo, J., et al. VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology. Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).
  24. Babady, N. E., et al. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital. J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).
  25. Chidlow, G., et al. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).
  26. Bell, J. J., Selvarangan, R. Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium. J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).
  27. Nie, S., et al. Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B. Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).
  28. Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay. Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).

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