Laser di Thulium ad onda continua per la cottura delle cellule coltivate per indagare gli effetti termici cellulari

Sommario

Viene introdotto un setup sperimentale originale per le celle di riscaldamento in un piatto di coltura utilizzando radiazioni laser a onda continua da 1,94 μm. Utilizzando questo metodo, le risposte biologiche delle cellule epiteliali del pigmento retinico (RPE) dopo diverse esposizioni termiche possono essere studiate.

Abstract

Viene introdotto un metodo originale per riscaldare le cellule coltivate usando un laser di thulium a onda continua da 1,94 μm per la valutazione biologica. La radiazione laser di tiulio è fortemente assorbita dall'acqua e le cellule nella parte inferiore del piatto di coltura vengono riscaldate attraverso la diffusione termica. Una fibra laser con un diametro di 365 μm è impostata circa 12 cm al di sopra del piatto di coltura, senza alcuna ottica, in modo tale che il diametro del fascio laser sia quasi equivalente al diametro interno del piatto di coltura (30 mm). Tenendo una quantità consistente di campioni di coltura in ogni esperimento, è possibile irradiare le cellule con un aumento di temperatura altamente riproducibile.

Per calibrare l'aumento della temperatura e la sua distribuzione in un piatto di coltura cellulare per ogni impostazione di potenza, la temperatura è stata misurata durante 10 s di irradiazione in posizioni diverse e a livello cellulare. La distribuzione della temperatura è stata rappresentata utilizzando un software grafico matematicoProgramma, e il suo modello attraverso il piatto della cultura era in forma gaussiana. Dopo l'irradiazione laser, potrebbero essere eseguiti diversi esperimenti biologici per valutare le risposte delle cellule dipendenti dalla temperatura. In questo manoscritto viene introdotta la colorazione della vitalità ( cioè distinguere le cellule vive, apoptotiche e morte) per aiutare a determinare le temperature di soglia per l'apoptosi cellulare e la morte dopo diversi punti nel tempo.

I vantaggi di questo metodo sono la precisione della temperatura e del tempo di riscaldamento, nonché la sua elevata efficienza nelle celle di riscaldamento in un intero impianto di coltura. Inoltre, consente di studiare con un'ampia varietà di temperature e durate, che possono essere ben controllate da un sistema operativo computerizzato.

Introduzione

La comprensione delle risposte biologiche delle cellule dipendenti dalla temperatura è di grande importanza per i trattamenti di ipertermia con successo. La fotocoagulazione laser retinica con un laser termico, utilizzata in oftalmologia, è uno dei trattamenti laser più rinomati della medicina. La luce visibile, per lo più da lunghezze d'onda di verde a giallo, viene usata nel trattamento laser retinico. La luce è altamente assorbita dal melanina nelle cellule epiteliali del pigmento retinico (RPE), che costituiscono il monostrato cellulare più esterno della retina. Interessanti interessi tra medici e ricercatori in irraggiamento termico molto lieve (fotocoagulazione sub-visibile) come nuova strategia terapeutica per diversi tipi di disturbi della retina ^{1 , 2} . A seguito di questa tendenza, il nostro interesse è quello di sottoporre letti a calore le cellule RPE sotto controllo preciso della temperatura, una tecnica chiamata terapia fototermica controllata dalla temperatura (TC-PTT).

Opto recenteLa tecnologia acustica del nostro istituto ha consentito di misurare in tempo reale gli aumenti di temperatura nei siti irradiati nella retina. Ciò consente di controllare l'aumento della temperatura durante l'irradiazione ³ . Tuttavia, poiché l'ipertermia sub-letale sulla retina, causata dalla riscaldamento delle cellule RPE sotto-letali, non è stata precedentemente considerata a causa dell'impossibilità di misurare e controllare la temperatura, le risposte delle cellule RPE dipendenti dalla temperatura dalle cellule RPE dopo l'irradiazione laser termico Sono stati studiati molto poco fino ad oggi. Inoltre, non solo la differenza di temperatura non è stata discussa in dettaglio, ma anche la differenza nel comportamento delle cellule delle cellule sopravvissute dopo irradiazione sub-letale e letale. Pertanto, per raccogliere prove scientifiche sui trattamenti basati su TC-PTT, ci proponiamo di chiarire le risposte biologiche delle cellule RPE dipendenti dalla temperatura e dai loro meccanismi utilizzando strutture sperimentali in vitro .

Per tIl suo scopo è stabilire un impianto di riscaldamento a cellule che soddisfi le seguenti condizioni: 1) possibilità di aumenti di temperatura veloci, 2) tempo e temperatura precisi e 3) un numero relativamente elevato di cellule esaminate per esperimenti biologici . Per quanto riguarda il metodo di riscaldamento, un laser clinico, come un laser Nd.YAG raddoppiato a frequenza (532 nm), è purtroppo inadatto per il riscaldamento della coltura cellulare. Questo è dovuto al numero fortemente ridotto di melanosomi nelle cellule RPE coltivate. L'assorbimento della luce laser potrebbe essere inomogeneo e l'aumento della temperatura a livello cellulare è variabile tra gli esperimenti, anche quando irradiato con la stessa potenza radiante. Numerosi studi precedenti hanno riportato l'uso di carta nera sotto il fondo del piatto durante l'irradiazione ⁴ o l'uso di melanosomi aggiuntivi che sono fagocitizzati dalle cellule di coltura prima degli esperimenti ^{5 , 6} . Molti diGli studi biologici in vitro per la valutazione delle reazioni cellulari indotte da ipertermia sono state eseguite usando una piastra calda, un bagno d'acqua o un incubatore di CO ₂ con una regolazione della temperatura ⁷ . Questi metodi richiedono un lungo periodo di riscaldamento perché richiede un certo tempo ( cioè diversi minuti) per raggiungere la temperatura desiderata. Inoltre, utilizzando questi metodi, è difficile ottenere una storia termica dettagliata ( cioè la temperatura moltiplicata per il tempo) a livello cellulare. Inoltre, la temperatura tra le cellule in posizioni diverse in un piatto di coltura può variare a causa della diffusione a temperatura variabile. Nella maggior parte dei casi, queste informazioni di temperatura temporali e spaziali durante l'ipertermia non sono state prese in considerazione per le analisi biologiche, anche se la risposta biologica cellulare può essere criticamente influenzata dalla temperatura e dalla durata della temperatura aumentata.

Per superare questi problemi, un contaIl laser di thulium a nuous wave è stato usato qui per riscaldare le cellule. La radiazione laser di tiulio (λ = 1,94 μm) è fortemente assorbita dall'acqua ⁸ e le cellule al fondo del piatto di coltura sono stimolate termicamente solo attraverso la diffusione termica. La fibra laser con un diametro di 365 μm è fissata a circa 12 cm al di sopra del piatto di coltura, senza alcuna ottica fra. Il diametro del fascio laser diviene tale che è quasi equivalente al diametro interno del piatto di coltura (30 mm) alla superficie del mezzo di coltura. Con una quantità consistente di terreno di coltura è possibile irradiare le cellule con l'aumento della temperatura Di alta ripetibilità. Le impostazioni di potenza variabili consentono l'irraggiamento fino a 20 W e la temperatura media a livello cellulare può essere aumentata fino a ΔT ≈ 26 ° C per 10 s.

Modificando le condizioni di irraggiamento, è anche possibile modificare il profilo del fascio laser per variare la temperatura distribuitaIn un piatto di cultura. Ad esempio, è possibile indagare con una distribuzione di temperatura simile a Gaussian, come nell'attuale studio, o con una distribuzione omogenea della temperatura. Quest'ultimo può essere vantaggioso per indagare gli effetti delle risposte delle cellule dipendenti dalla temperatura più specificamente per gli aumenti di temperatura sub-letali, ma non per gli stress di morte cellulare o le reazioni di guarigione delle ferite.

Nel complesso, l'irradiazione laser del tiume può consentire l'individuazione di diversi fattori biologici, come l'espressione genico / proteica, la cinetica della morte cellulare, la proliferazione cellulare e lo sviluppo delle funzionalità delle cellule dopo diverse esposizioni termiche.

Protocollo

1. Cultura delle cellule RPE

1. Isolamento delle cellule RPE dagli occhi di maiale
   1. Ottieni gli occhi di maiale appena enucleati dal macello locale. Tenerli raffreddati (4 ° C) e in un ambiente buio.
   2. Rimuovere i tessuti extracellulari con forbici e immergere gli occhi in una soluzione antisettica per 5 min.
   3. Mettere gli occhi in salina sterilizzata tamponata con fosfato senza calcio e magnesio (PBS (-)) fino all'uso.
   4. Usando un bisturi, penetrare la sclera a circa 5 mm posteriormente al limbo corneale. Riprendere l'intera parte anteriore dell'occhio tagliandosi con le forbici in tutta la direzione, parallela al limbo corneale.
   5. Rimuovere la parte anteriore dell'occhio ( cioè la cornea e l'obiettivo) e la vetreria. Aggiungere 1 ml di PBS (-) e rimuovere delicatamente la retina neurale.
      NOTA: Questa "coppa dell'occhio", costituita dalla sclera, dal coroide e dalla RPE, è ora pronta.
   6. Aggiungere pre-riscaldato (37 ° C) 0,25% di trysina in PBS (-) alla coppa dell'occhio. Regolare il volume in modo che circa l'80% della coppa dell'occhio sia riempito con questa soluzione di tripsina.
   7. Incubare la coppa con la soluzione di tripsina in un incubatore di CO ₂ a 5% a 37 ° C per 10 min.
   8. Rimuovere la coppa dell'oculato dall'incubatore e sostituire la soluzione di trypsina allo 0,25% con una soluzione PBS (-) con 0,05% di tripossina + 0,2% di tetranodio di acido etilendiammetratoacetico (EDTA · 4N). Incubare la coppa dell'occhio nell'incubatore per 45 min.
      NOTA: Dopo 45 minuti, le cellule RPE saranno solo leggermente attaccate alla membrana di Bruch o già staccate e galleggianti nella soluzione tripsina-EDTA.
   9. Raccogliere le cellule RPE con pipetta gentile. Raccogliere le cellule e la soluzione in un tubo conico riempito con 10 ml di terreno di coltura (glutammina al DMEM elevata con L-glutamina), compreso 10% siero di porcellino, antibiotico / antimicotico e piruvato di sodio (1 mM).
      NOTA: Il siero può neutralizzare l'effetto della tripsina.
   10. Centrifuga laCella a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente.
   11. Rimuovere il surnatante e aggiungere 10 ml di terreno fresco. Centrifugare nuovamente nelle stesse condizioni per 5 min.
   12. Rimuovere il surnatante e aggiungere nuovo mezzo, in modo tale che la concentrazione delle cellule determini 5 x 10 ⁵ cellule / mL (determinata contando le cellule usando un emocitometro). Mescolare bene con pipetta gentile.
   13. Distribuire la sospensione cellulare nei piatti di coltura cellulare. Utilizzare 3 ml per piatto di coltura da 60 mm di diametro.
       NOTA: Questa coltura è chiamata passaggio zero (P0).
   14. Mantenere le cellule in un incubatore di CO ₂ a 5% a 37 ° C. Cambiare la metà del mezzo condizionato a fresco ogni secondo giorno.
   15. Subcultura (fase 1.2) se diventa confluente.
2. Subcultura della coltura cellulare RPE
   1. Rimuovere il mezzo di coltura e sciacquare le cellule due volte con PBS (-).
   2. Incubare le cellule con soluzione PBS (-) con 0,05% di tripsina + 0,2% di EDTANa 5% CO ₂ incubatore a 37 ° C per 5 min.
   3. Staccare le cellule RPE pipettando delicatamente e raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico riempito con 10 ml di terreno di coltura, compreso il siero di suini del 10%.
   4. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
   5. Rimuovere il surnatante e aggiungere nuovo mezzo di coltura, rendendo la concentrazione cellulare 5 x 10 ⁵ cellule / mL (determinata contando il numero di cellule con un emocitometro). Distribuire le celle in nuovi piatti di coltura da 60 mm, come descritto nel passaggio 1.1.13.
      NOTA: la coltura delle cellule è ora il passaggio 1 (P1).
   6. Una volta raggiunta la confluenza, subcultura la coltura P1 a P2, utilizzando la stessa procedura descritta nei passaggi 1.2.1-1.2.5. Dalla coltura P2, sementi le cellule su piatti più piccoli di coltura (diametro interno di 30 mm) invece di piatti di coltura di diametro di 60 mm.
   7. Per gli esperimenti, utilizzare le colture P2 o P3.

2. ThulIum irradiazione laser

1. Costruzione della stazione di irraggiamento
   1. Collegare un dispositivo laser di tiuma (1,94 μm, range di potenza: 0-20 W) ad una fibra di diametro del centro di 0,22-NA, 365 μm.
   2. Fissare meccanicamente la punta in fibra al braccio metallico fissato orizzontalmente al supporto metallico verticale della stazione di irraggiamento. Posizionare l'albero verticale in modo che la punta della fibra laser sia posta sopra la piastra calda su cui deve essere posizionato il piatto di coltura cellulare durante l'irraggiamento.
   3. Posizionare un foglio bianco sulla piastra calda e girare il fascio di mira (λ = 635 nm, max = 1 mW, diametro a livello carta ≈ 30 mm). Segnare la circonferenza del fascio di mira sul foglio bianco in modo che sia nota la posizione in cui il piatto di coltura deve essere posto durante l'irradiazione.
      NOTA: il piano z della punta della fibra può essere modificabile. Senza alcuna altra ottica di imaging, il diametro del punto laser sul piano di coltura delle cellule, posizionato 12 cm sotto la punta della fibra, iCirca 30 mm, quasi equivalente al diametro interno del piatto di coltura cellulare. Un disegno schematico della configurazione è mostrato in Figura 1 .

Figura 1: Immagine schematica della stazione di irradiazione laser di Thulium. Il piatto di coltura è posto sulla piastra riscaldante. Le cellule sono poste 12 cm sotto la punta della fibra del laser di tulium in modo che la dimensione del fascio sia quasi identica al diametro interno del piatto di coltura (circa 30 mm). La procedura di irradiazione laser è controllata da una routine controllata dal tempo della piattaforma di progettazione del sistema su misura. Prima di avviare il programma di irraggiamento, è necessario determinare l'impostazione di potenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Irradiazione laser della coltura cellulare

1. 1 h prima dell'irradiazione, sostituire completamente il mezzo di coltura con 1,2 ml di terreno fresco.
   NOTA: questo è uno STEP CRITICO e deve essere rispettato rigorosamente.
2. Posizionare la stazione di irraggiamento ( cioè la piastra calda e il post con cui fissare la fibra laser) su una panca pulita.
3. Rimuovere il piatto della coltura cellulare dall'incubatore e posizionarlo sulla posizione contrassegnata sulla piastra calda (passo 2.1.3).
4. Indossare occhiali protettivi. Accendere il laser del tium. Impostare la potenza desiderata sul dispositivo laser (regolabili da 0 a 20 W). Spegnere l'emissione.
5. Avviare una piattaforma di progettazione del sistema che controlla il protocollo di irradiazione laser e timing (file aggiuntivo).
6. Immediatamente dopo aver posizionato il piatto di coltura sulla piastra calda, fare clic sul "tempo di preriscaldamento" per avviare il timer per 140 s ("tempo di preriscaldamento 1"); Questo manterrà la temperatura media della coltura a 37 ° C prima dell'irradiazione.
   NOTA: dopo 140 secondi, un segnale acustico si accenderà e il timer successivo ("tempo di preriscaldamento 2") inizia automaticamente contando 8 s. Durante questo periodo di 8 s, l'esaminatore può aprire il piatto di coltura. Dopo 148 s di preriscaldamento, viene eseguita automaticamente un'irradiazione laser da 10 secondi sulla coltura cellulare. In caso di emergenza, dotare il dispositivo laser con un pulsante di arresto di forza per arrestare immediatamente il laser. Questo è un passaggio CRITICO e deve essere seguita rigorosamente. Un punto particolare di cautela riguarda l'apertura del coperchio del piatto appena prima dell'irradiazione, all'inizio del tempo di preriscaldamento di 8 sec. Apertura del coperchio può raffreddare rapidamente la superficie media.
7. Dopo l'irraggiamento, posizionare immediatamente la copertura sul piatto di coltura, lasciare il piatto di coltura sulla piastra calda per altri 7 secondi e riportarlo indietro nel 5% CO ₂ incubatore a 37 ° C.

Misurazione della distribuzione della temperatura alLivello cellulare (calibrazione della temperatura)

1. Realizzare piccoli fori (circa 300 μm di diametro) vicino al fondo su quattro lati (ogni 90 °) di un piatto di coltura di diametro di 30 mm (senza celle); Utilizzare la punta di un ago (20G) riscaldato con un bruciatore di Bunsen. Sigillare i fori con nastro di isolamento elettrico dall'esterno e fare un piccolo foro con un ago fine in modo che solo un termocoppino fine (200 μm di diametro) possa essere inserito attraverso questo foro in condizioni impermeabili.
2. All'esterno del fondo della piastra di coltura, disegnare 2 diametri perpendicolari e impostare il punto di attraversamento ( cioè il centro del lato inferiore) come coordinato zero (0). Segnare ogni 3 mm radialmente all'esterno il piatto ( cioè 0, 3, 6, 9, 12 e 15 mm) in ogni direzione lungo le linee ( figura 2 , punti blu); Il numero di punti dovrebbe essere complessivamente 21.
3. Riempire il piatto di coltura cellulare con 1,2 ml di nuovo substrato di coltura. Mettere la cultura dSu un piatto caldo a 37 ° C, inserire una termocoppia (200 μm di diametro) nel foro laterale e posizionare la punta sensibile in una posizione marcata da misurare.
4. Indossare occhiali protettivi. Accendere il laser di tiulio e impostare manualmente la potenza (tra 0 e 20 W, in incrementi 0,1 W) del laser.
   NOTA: per la calibrazione della temperatura, le misure con potenza in incrementi di 3 W dovrebbero essere sufficienti.
5. Accendere la piattaforma di progettazione del sistema e fare clic sul pulsante "Avvio Temp. Acquisizione" (file aggiuntivo) per avviare la misurazione della temperatura.
6. Eseguire la stessa procedura come al punto 2.2.6.
   NOTA: Il programma di controllo misura la temperatura della termocoppia inserita ogni 100 ms e mostra la progressione della temperatura durante l'irradiazione nella GUI.
7. Eseguire queste procedure per tutti e 21 i punti di misura e alle diverse impostazioni di potenza. Ripetere l'intera procedura tre volte per tutti i punti e per tutta la potenza settinGs per ottenere dati affidabili.
8. Esportare i dati della temperatura come dati csv, che possono eventualmente essere convertiti in un foglio di calcolo. Media la temperatura massima alla fine dell'irradiazione per le misurazioni triplicate in ogni punto. Media i valori dei punti sullo stesso cerchio (4 punti in totale, tranne il punto centrale).
9. Tracciare la temperatura media misurata ottenuta su un grafico, facendo l'asse x e l'aumento della temperatura (ΔT, ° C) come l'asse y, la distanza dal centro del piatto (mm). Utilizza la funzione di misura di un programma software matematico per adattare un modello Gaussian ai dati grezzi. Creare una distribuzione della temperatura di misura Gauss.

Figura 2: I punti per la calibrazione della temperatura in un piatto di cultura della cella. I dati sulla temperatura sono stati misurati al centro e al 5Punti radiali su 4 angoli diversi (puntini blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Valutazione biologica per le risposte delle cellule dopo differenti irradiazione termica

1. Valutazione della vitalità cellulare ( vale a dire, vivente, apoptotica e morta) dopo diverse impostazioni di potenza e determinazione della soglia di morte cellulare
   1. Nei punti indicati ( cioè 3, 24 e 48 ore dopo l'irraggiamento), lavare le cellule con PBS (-) e utilizzare un kit disponibile in commercio per valutare la vitalità delle cellule ( vale a dire, vitale, apoptotica, morta) protocollo.
   2. Preparare una soluzione di colorazione aggiungendo 5 μL di isotiocianato fluoresceina (FITC) -annexina V, 5 μL di homodimer III di etidio e 5 μL di Hoechst 33342 a 100 μl di 1x buffer di legame (tutti sono kitcomponenti). Preparare una soluzione di colorazione sufficiente per coprire le cellule. Incubare le cellule per 15 minuti.
   3. Lavare la coltura delle cellule con il buffer di legame due volte, sostituire il buffer di legame con PBS (-) e impostare la coltura sullo stadio di un microscopio a fluorescenza.
   4. Passare il percorso della luce all'obiettivo oculare, selezionare il filtro 4 ', 6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI), accendere la luce di illuminazione e trovare il piano mirato con l'obiettivo 4x.
   5. Cambiare il percorso della luce alla fotocamera, individuare l'immagine sullo schermo del computer nel software di imaging del microscopio e regolare la messa a fuoco.
   6. Utilizzare la funzione punto ( cioè la funzione per registrare più immagini sul piatto e creare una singola immagine grande) del software specifico del microscopio per ottenere l'immagine di fluorescenza dell'intero piatto di coltura cellulare. Utilizzare 3 diversi set di filtri - DAPI, FITC e tetrametilrodamina (TRITC) - Immagini Hoechst 33342-cellule positive (tutti i nuclei cellulari), FITC-annexin V-positiVe (cellule apoptotiche), e cellule III eterogene omodimide etidium (morte), rispettivamente.
   7. Misurare il raggio (mm) della regione morta (ethidium homodimer III-positiva) e il raggio esterno / interno della regione a forma di banda apoptotica (annexin V-positiva) nelle colture cellulari macchiate. Applicare questi raggi alla funzione gaussiana montata della distribuzione della temperatura per la corrispondente impostazione di potenza. Calcolare la temperatura esatta al bordo della regione morta o apoptotica per chiarire le temperature di soglia per la morte cellulare e il cambiamento apoptotico.

Risultati

Distribuzione della temperatura dopo diverse impostazioni di alimentazione

Tutti gli sviluppi della temperatura per ogni singolo irraggiamento sono stati monitorati nella taratura della temperatura. Da questi dati è stata ottenuta la temperatura massima del punto misurato e definita come T _max (° C). Come mostrato in Figura 3A , il programma è stato eseguito nel momento in cui il piatto di...

Discussione

Nel discutere le risposte cellulari biologiche correlate alla temperatura, non è solo la temperatura, ma anche la durata di tempo della temperatura aumentata, poiché la maggior parte dei processi biochimici dipende dal tempo. Particolarmente nel campo della ipertermia indotta dal laser in oculistica, a causa del breve periodo di tempo - da millisecondi a secondi - è difficile studiare gli effetti termici cellulari con un preciso controllo della temperatura. Pertanto, è desiderabile un'impostazione di irradiazione la...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti
Dulbecco" s Aquila modificata' s Glucosio medio - alto	Sigma-Aldrich	D5796-500ML	Aggiungere (2)-(4) prima dell'uso. Caldo a 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso.
Soluzione antibiotica antimicotica (100 volte)	Sigma-Aldrich	A5955-100ML	Contenente 10.000 unità di penicillina, 10 mg di streptomicina e 25 μ g Amfotericina B in 1mL. Aggiungere 5,5 mL in un flacone medio da 500 mL (1) prima dell'uso.
Piruvato di sodio (100 mM)	Sigma-Aldrich	S8636-100ML	Aggiungere 5,5 mL in un flacone medio da 500 mL (1) prima dell'uso (concentrazione finale: 1 mM)
Siero suino	Sigma-Aldrich	12736C-500ML	Aggiungere 50 mL in un bottolo medio da 500 mL (1) prima dell'uso (finale: 10%)
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Tripsina da pancreas suino	Sigma-Aldrich	T4799-25G
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma-Aldrich	ED-100G
Kit ELISA Quantikine VEGF umano	R& Kit	DVE00
Oxiselect	Cell Biolabs, Inc	STA-312
Kit di rilevamento di cellule apoptotiche/necrotiche/sane	PromoKine	PK-CA707-30018
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Attrezzature
Laser al tulio	Starmedtec GmbH	Prototipo	0-20 W
365 mm diametro nucleo fibra	COMPONENTI LASER Germania	CF01493-52
Termocoppia	Omega Engineering Inc	HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M
Piastra riscaldante	MEDAX
Lettore di micropiastre ( spettrofluorimetro)	Dispositivo molecolare	Omogeneizzatore cellulare Spectramax M4
	QIAGEN	TissueLyser LT
Microscopio a fluorescenza	Nikon	ECLIPSE Ti
programma software matematico	The Mathworks. Inc	MATLAB Release 2015b,
piattaforma di progettazione di sistemi,	National Instrument	Labview	Laboratory, Virtual Instrument Engineering Workbench

per il dosaggio del glutatione totale D System ,