Questo protocollo descrive l'uso di una strategia di scambio tampone microfluidica basata inerziale per purificare cellule ingegnerizzate micro / nanoparticelle con efficiente esaurimento delle particelle non legate.
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Articolo metodologico
Scambio Buffer Microfluidic per senza interferenze micro / nanoparticelle cellulare Ingegneria
In questo articolo
Sommario
Abstract
cellule Engineering con micro-ingrediente attivo-caricato / nanoparticelle (NP) sta diventando un metodo sempre più popolare per migliorare le proprietà terapeutiche nativi, abilitare l'imaging bio e controllare il fenotipo delle cellule. Un problema critico ancora affrontato in modo inadeguato è il numero di particelle che rimangono non legato dopo l'etichettatura delle cellule che non può essere facilmente rimosso per centrifugazione convenzionale. Questo porta ad un aumento della bio rumore delle immagini di sfondo e può impartire effetti trasformativi sulle cellule non bersaglio adiacenti. In questo protocollo, presentiamo una strategia inerziale microfluidica a base di buffer di scambio definito come Dean flusso Frazionamento (DFF) per separare in modo efficiente cellule marcate da NP liberi in un modo elevato throughput. Il Microdevice spirale sviluppato facilita raccolta continua (> il recupero delle cellule del 90%) delle cellule purificate (THP-1 e MSC) sospese in nuova soluzione tampone, oltre a raggiungere> 95% esaurimento di colorante fluorescente non legato o NP dye-caricato (silica o PLGA). Questo single-step, la strategia di purificazione delle cellule size-based permette un throughput di elaborazione ad alta cella (10 6 cellule / min) ed è molto utile per la purificazione delle cellule di grandi volumi di micro / cellule nanoparticelle progettato per realizzare applicazioni cliniche senza interferenze.
Introduzione
Ingegneria delle cellule da agenti caricato micro / nanoparticelle (NP) è un metodo di integrazione libera e versatile semplice, genomica per migliorare la capacità bioimmagini e aumentare / integrare le sue proprietà terapeutiche nativi nella medicina rigenerativa. 1-3 modificazioni cellulari si ottengono l'etichettatura del membrana plasmatica o nel citoplasma con un eccesso di concentrazione di NP agente-caricato di saturare i siti di legame. Tuttavia, un grave inconveniente di questo metodo è la quantità significative di particelle non legate rimangono in soluzione dopo i processi di etichettatura delle cellule, che possono potenzialmente confonder....
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Protocollo
1. Le nanoparticelle (NP) Etichettatura delle cellule staminali mesenchimali e monociti
- Le cellule staminali mesenchimali Cultura (MSC) in terreno di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e antibiotici per ≥80% di confluenza prima di etichettatura. Analogamente, la cultura cellule THP-1 (ATCC) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplementato con 10% FBS ad una densità di ~ 10 6 cellule / ml.
- NP carico di silice (~ 500 micron), con soluzione colorante calceina (200 micron) con agitazione durante la notte. Realizzare PLGA-calceina AM (CAM) utilizzando un protocollo descritto in prece....
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Risultati
Dopo l'etichettatura delle cellule con bio di imaging NP agente-caricato durante la notte, le cellule marcate (contenente particelle libere) vengono raccolte e purificate dal DFF spirale Microdevice per rimuovere NP liberi in un unico processo passo (Figura 1A). Il 2-ingresso, microchannel spirale 2-presa è stato progettato da un software di ingegneria e microfabbricazione usando SU-8 fotosensibile. Il wafer di silicio modellato viene quindi utilizzato come modello p.......
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Discussione
La tecnologia di purificazione delle cellule DFF qui descritta consente la separazione rapida e continua di cellule marcate in maniera elevata produttività. Questo approccio separazione è ideale per grandi volumi campione o campione di trasformazione alta concentrazione cellulare, ed è meglio di filtrazione su membrana a base convenzionale che è soggetta a intasamento dopo un uso prolungato. Analogamente, separazione magnetica affinità basata richiede ulteriori operazioni di etichettatura cellule che sono laboriosi e co.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il gentile dono di cellule THP-1 da parte del Dr. Mark Chong e l'assistenza nella microfabbricazione da parte del Dr. Yuejun Kang e del Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) sono stati molto apprezzati. Questo progetto è stato finanziato dalla NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. è stato sostenuto dalla borsa di studio post-dottorato della Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Linee cellulari & Media | |||
| Cellule staminali mesenchimali (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 cellule monocitarie (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Reagents & Materiali | |||
| 0,01% poli-L-lisina (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Siringa da 3 ml Siringa | da | 302113 | Siringa Luer-Lock |
| da 60 ml Siringa da 60 ml Siringa | 309653 | 60 ml Luer-Lock | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calceina, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanolo | Fisher Chemical | #P/7507/17 | di grado HPLC 2,5 L |
| Lonza | 17-516Q/12 | ||
| Vetrini per microscopio semplici | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 x 25 x 1 mm3 |
| Polidimetilsilossano (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Nastro adesivo | 3M | 21200702044 | 18 mm x 25 m |
| NP di silice (∼ 200 μ m) | Sigma-Aldrich | 748161 | Dimensione dei pori 4 nm |
| Puntale per siringa JEC Technology | 7018302 | 23 G 0,013 x 0,25 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | 0,02 x 0,06" 100 |
| Poly (D,L-lattide-co-glicolide) (PLGA; 50:50) | Sigma-Aldrich | P2191 | |
| Equipment | |||
| Punzone per biopsia | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1,50 mm |
| Essiccatore | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| Telecamera ad alta velocità | Phantom | V9.1 | |
| Microscopio a contrasto di fase invertito | Nikon | Eclipse Ti | |
| Pulitore al plasma | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Pompa a siringa | Chemyx | CX Fusion 200 |
Riferimenti
- Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells' status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33(2014).
- Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
- Naumova, A. V., Modo, M., ....
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Ristampe e permessi
