Scambio Buffer Microfluidic per senza interferenze micro / nanoparticelle cellulare Ingegneria

Summary

Questo protocollo descrive l'uso di una strategia di scambio tampone microfluidica basata inerziale per purificare cellule ingegnerizzate micro / nanoparticelle con efficiente esaurimento delle particelle non legate.

Abstract

cellule Engineering con micro-ingrediente attivo-caricato / nanoparticelle (NP) sta diventando un metodo sempre più popolare per migliorare le proprietà terapeutiche nativi, abilitare l'imaging bio e controllare il fenotipo delle cellule. Un problema critico ancora affrontato in modo inadeguato è il numero di particelle che rimangono non legato dopo l'etichettatura delle cellule che non può essere facilmente rimosso per centrifugazione convenzionale. Questo porta ad un aumento della bio rumore delle immagini di sfondo e può impartire effetti trasformativi sulle cellule non bersaglio adiacenti. In questo protocollo, presentiamo una strategia inerziale microfluidica a base di buffer di scambio definito come Dean flusso Frazionamento (DFF) per separare in modo efficiente cellule marcate da NP liberi in un modo elevato throughput. Il Microdevice spirale sviluppato facilita raccolta continua (> il recupero delle cellule del 90%) delle cellule purificate (THP-1 e MSC) sospese in nuova soluzione tampone, oltre a raggiungere> 95% esaurimento di colorante fluorescente non legato o NP dye-caricato (silica o PLGA). Questo single-step, la strategia di purificazione delle cellule size-based permette un throughput di elaborazione ad alta cella (10 ⁶ cellule / min) ed è molto utile per la purificazione delle cellule di grandi volumi di micro / cellule nanoparticelle progettato per realizzare applicazioni cliniche senza interferenze.

Introduction

Ingegneria delle cellule da agenti caricato micro / nanoparticelle (NP) è un metodo di integrazione libera e versatile semplice, genomica per migliorare la capacità bioimmagini e aumentare / integrare le sue proprietà terapeutiche nativi nella medicina rigenerativa. ^1-3 modificazioni cellulari si ottengono l'etichettatura del membrana plasmatica o nel citoplasma con un eccesso di concentrazione di NP agente-caricato di saturare i siti di legame. Tuttavia, un grave inconveniente di questo metodo è la quantità significative di particelle non legate rimangono in soluzione dopo i processi di etichettatura delle cellule, che possono potenzialmente confonder....

Protocol

1. Le nanoparticelle (NP) Etichettatura delle cellule staminali mesenchimali e monociti

1. Le cellule staminali mesenchimali Cultura (MSC) in terreno di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e antibiotici per ≥80% di confluenza prima di etichettatura. Analogamente, la cultura cellule THP-1 (ATCC) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplementato con 10% FBS ad una densità di ~ 10 ⁶ cellule / ml.
2. NP carico di silice (~ 500 micron), con soluzione colorante calceina (200 micron) con agitazione durante la notte. Realizzare PLGA-calceina AM (CAM) utilizzando un protocollo descritto in prece....

Results

Dopo l'etichettatura delle cellule con bio di imaging NP agente-caricato durante la notte, le cellule marcate (contenente particelle libere) vengono raccolte e purificate dal DFF spirale Microdevice per rimuovere NP liberi in un unico processo passo (Figura 1A). Il 2-ingresso, microchannel spirale 2-presa è stato progettato da un software di ingegneria e microfabbricazione usando SU-8 fotosensibile. Il wafer di silicio modellato viene quindi utilizzato come modello per s.......

Discussion

La tecnologia di purificazione delle cellule DFF qui descritta consente la separazione rapida e continua di cellule marcate in maniera elevata produttività. Questo approccio separazione è ideale per grandi volumi campione o campione di trasformazione alta concentrazione cellulare, ed è meglio di filtrazione su membrana a base convenzionale che è soggetta a intasamento dopo un uso prolungato. Analogamente, separazione magnetica affinità basata richiede ulteriori operazioni di etichettatura cellule che sono laboriosi e co.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Linee cellulari & Media
Cellule staminali mesenchimali (MSC)	Lonza	PT-2501
Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM)	Lonza	12-614F
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	10270-106
THP-1 cellule monocitarie (THP-1)	ATCC	TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media	Lonza	12-702F
Reagents & Materiali
0,01% poli-L-lisina (PLL)	Sigma-Aldrich	P8920
Siringa da 3 ml Siringa	da	302113	Siringa Luer-Lock
da 60 ml Siringa da 60 ml Siringa	309653		60 ml Luer-Lock
Albumina sierica bovina (BSA)	Biowest	P6154-100GR
Calceina, AM (CAM)	Life Technologies	C1430
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Isopropanolo	Fisher Chemical	#P/7507/17	di grado HPLC 2,5 L
	Lonza	17-516Q/12
Vetrini per microscopio semplici	Fisher Scientific	FIS#12-550D	75 x 25 x 1 mm3
Polidimetilsilossano (PDMS)	Dow Corning	SYLGARD® 184
Nastro adesivo	3M	21200702044	18 mm x 25 m
NP di silice (∼ 200 μ m)	Sigma-Aldrich	748161	Dimensione dei pori 4 nm
Puntale per siringa JEC Technology		7018302	23 G 0,013 x 0,25
Tripsina-EDTA (0,25%)	Life Technologies	25200-056
Tygon Tubing	Spectra-Teknik	06419-01	0,02 x 0,06" 100
Poly (D,L-lattide-co-glicolide) (PLGA; 50:50)	Sigma-Aldrich	P2191
Equipment
Punzone per biopsia	Harris Uni-Core	69036-15	1,50 mm
Essiccatore	Scienceware	111/4 IN OD
Telecamera ad alta velocità	Phantom	V9.1
Microscopio a contrasto di fase invertito	Nikon	Eclipse Ti
Pulitore al plasma	Harrick Plasma	PDC-002
Pompa a siringa	Chemyx	CX Fusion 200