Una cultura primarie di cellule endoteliali corneali bovini è stato utilizzato per studiare il meccanismo di transizione corneale endoteliale-mesenchimale. Inoltre, un corneale endotelio modello cryoinjury ratto è stato utilizzato per dimostrare corneale endoteliale transizione-mesenchimali in vivo.
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Articolo metodologico
In vitro e in modelli in vivo per studiare transizione corneale endoteliale-mesenchimale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule endoteliali corneali (CEC) svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento della chiarezza corneale attraverso il pompaggio attivo. Una riduzione della conta CEC può portare a edema corneale e diminuzione dell'acuità visiva. Tuttavia, i CEC umani sono inclini a compromettere il potenziale proliferativo. Inoltre, la stimolazione della crescita cellulare è spesso complicata dalla graduale transizione endoteliale-mesenchimale (EnMT). Pertanto, la comprensione del meccanismo dell'EnMT è necessaria per facilitare la rigenerazione di CEC con funzione competente. In questo studio, abbiamo preparato una coltura primaria di CEC bovine staccando le CEC con la membrana di Descemet dal bottone corneale e abbiamo dimostrato che le CEC bovine mostravano il processo EnMT, incluso il cambiamento fenotipico, la traslocazione nucleare della β-catenina e i regolatori EMT lumaca e lumaca, nella coltura in vitro. Inoltre, abbiamo utilizzato un modello di criolesione dell'endotelio corneale di ratto per dimostrare il processo EnMT in vivo. Nel complesso, la coltura primaria in vitro di CEC bovine e modelli in vivo di criolesione dell'endotelio corneale di ratto offre piattaforme utili per studiare il meccanismo di EnMT.
Introduzione
Le cellule endoteliali corneali (CEC) svolgono un ruolo vitale nel mantenere la chiarezza corneale e quindi l'acuità visiva regolando lo stato di idratazione dello stroma corneale attraverso il pompaggio attivo1. A causa del limitato potenziale proliferativo delle CEC umane, il numero di cellule diminuisce con l'età e la riparazione delle ferite endoteliali corneali a seguito di una lesione è solitamente ottenuta attraverso l'ingrandimento e la migrazione cellulare, piuttosto che la mitosi cellulare2. Quando la conta CEC scende al di sotto di una soglia di circa 500 cellule/mm2, lo stato di disidratazione dello stroma corneale non può ....
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Protocollo
Tutte le procedure seguite in questo studio accordato con l'Associazione per la Ricerca e la Visione e Oftalmologia Dichiarazione per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research e sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali del National Taiwan University Hospital.
1. Isolamento, coltura primaria Preparazione e Immunocolorazione bovina CEC
- Acquisire gli occhi bovino fresco da un mattatoio locale.
- Disinfettare gli occhi in un 10% w / v soluzione di iodio-povidone per 3 min. Lavare con una soluzione tampone fosfato (PBS).
- Raccogliere il pulsante corneale con un bisturi e forbici in con....
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Risultati
Dopo l'isolamento di PEC bovina, le cellule sono state coltivate in vitro. La Figura 1 presenta le immagini contrasto di fase dei PEC bovina. La forma esagonale delle cellule a confluenza indicato che le cellule non sono stati contaminati da corneale fibroblasti stromali durante l'isolamento delle cellule. La Figura 2 illustra l'immunocolorazione che è stata eseguita utilizzando anticorpi contro ABC, lumaca, e in blocco in un punto d.......
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Discussione
PEC sono noti per la loro propensione a subire EnMT durante la proliferazione cellulare. Sviluppare strategie per sopprimere il processo EnMT per scopi terapeutici, una conoscenza approfondita del meccanismo EnMT è necessario. Abbiamo descritto 2 modelli di indagare EnMT, vale a dire la CEC bovina nel modello di coltura in vitro e nel ratto corneale endoteliale modello cryoinjury. I nostri risultati hanno dimostrato il processo EnMT in entrambi i modelli. Inoltre, l'effetto di soppressione.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il personale del Second Core Lab, Dipartimento di Ricerca Medica, Ospedale Universitario Nazionale di Taiwan per il loro supporto tecnico.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| tripsina | ThermoFisher Scientific | 12604-013 | |
| Dulbecco' s modificato Eagle medium e Ham's F12 medium | ThermoFisher Scientific | 11330 | |
| siero fetale bovino | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | |
| dimetil solfossido | Sigma | D2650 | |
| fattore di crescita epidermico umano | ThermoFisher Scientific | PHG0311 | |
| insulina, transferrina, selenio... | ThermoFisher Scientific | 41400-045 | |
| tossina colera | Sigma | C8052-1MG | |
| gentamicina | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| amfotericina B | ThermoFisher Scientific | 15290-026 | |
| paraformaldeide | Microscopia elettronica | Scienze 111219 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| albumina sierica bovina | Sigma | A7906 | |
| marimastat | Sigma | M2699-25MG | |
| anticorpo beta-catenina anti-attivo | Millpore | 05-665 | |
| anticorpo anti-lumaca | Santa cruz | sc28199 | |
| anticorpo anti-lumaca | Santa cruz | sc15391 | |
| capra anti-topo IgG (H+L) secondario anticorpo | ThermoFisher Scientific | A-11001 | per la colorazione dell'ABC delle CEC bovine |
| anticorpo IgG (H+L) di capra | ThermoFisher Scientific | A-11003 | per la colorazione dell'ABC dell'endotelio corneale di ratto |
| anticorpo IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11008 | per la colorazione di lumaca e lumaca di CEC bovine |
| diluente anticorpale | Genemed Biotecnologie | 10-0001 | |
| 4',6-diamidino-2-fenilindolo | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| mezzo di montaggio | Vector Laboratories Microscopio | H-1000 | |
| ZEISS | LSM510 | ||
| xilazina | Bayer | N/A | |
| tiletamina più zolazepam | Virbac | N/A | farmaco |
| veterinario proparacaina cloridrato soluzione oftalmica | Alcon | N/A | farmaco veterinario |
| 0,1% atropina | Wu-Fu Laboratories Co., Ltd | N/A | farmaco clinico |
| 0,3% gentamicina solfato | Sinphar Gruppo | N/A | farmaco clinico |
| fattore di crescita dei fibroblasti di base | ThermoFisher Scientific | PHG0024 | farmaco clinico |
Riferimenti
- Maurice, D. M. The location of the fluid pump in the cornea. J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).
- Joyce, N. Proliferative capacity of the corneal endothelium. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (3), 359-389 (2003).
- Morishige, N., Sonoda, K. H.
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Ristampe e permessi
