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Articolo metodologico

In vitro e in modelli in vivo per studiare transizione corneale endoteliale-mesenchimale

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DOI:

10.3791/54329

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20 agosto 2016

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1Department of Ophthalmology, Far Eastern Memorial Hospital, 2Institute of Clinical Medicine, National Taiwan University, 3Department of Ophthalmology, National Taiwan University Hospital, 4College of Medicine, National Taiwan University

In questo articolo

Sommario

Una cultura primarie di cellule endoteliali corneali bovini è stato utilizzato per studiare il meccanismo di transizione corneale endoteliale-mesenchimale. Inoltre, un corneale endotelio modello cryoinjury ratto è stato utilizzato per dimostrare corneale endoteliale transizione-mesenchimali in vivo.

Abstract

Le cellule endoteliali corneali (CEC) svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento della chiarezza corneale attraverso il pompaggio attivo. Una riduzione della conta CEC può portare a edema corneale e diminuzione dell'acuità visiva. Tuttavia, i CEC umani sono inclini a compromettere il potenziale proliferativo. Inoltre, la stimolazione della crescita cellulare è spesso complicata dalla graduale transizione endoteliale-mesenchimale (EnMT). Pertanto, la comprensione del meccanismo dell'EnMT è necessaria per facilitare la rigenerazione di CEC con funzione competente. In questo studio, abbiamo preparato una coltura primaria di CEC bovine staccando le CEC con la membrana di Descemet dal bottone corneale e abbiamo dimostrato che le CEC bovine mostravano il processo EnMT, incluso il cambiamento fenotipico, la traslocazione nucleare della β-catenina e i regolatori EMT lumaca e lumaca, nella coltura in vitro. Inoltre, abbiamo utilizzato un modello di criolesione dell'endotelio corneale di ratto per dimostrare il processo EnMT in vivo. Nel complesso, la coltura primaria in vitro di CEC bovine e modelli in vivo di criolesione dell'endotelio corneale di ratto offre piattaforme utili per studiare il meccanismo di EnMT.

Introduzione

Le cellule endoteliali corneali (CEC) svolgono un ruolo vitale nel mantenere la chiarezza corneale e quindi l'acuità visiva regolando lo stato di idratazione dello stroma corneale attraverso il pompaggio attivo1. A causa del limitato potenziale proliferativo delle CEC umane, il numero di cellule diminuisce con l'età e la riparazione delle ferite endoteliali corneali a seguito di una lesione è solitamente ottenuta attraverso l'ingrandimento e la migrazione cellulare, piuttosto che la mitosi cellulare2. Quando la conta CEC scende al di sotto di una soglia di circa 500 cellule/mm2, lo stato di disidratazione dello stroma corneale non può essere mantenuto, portando a cheratopatia bollosa e compromissione della vista3,4.

Il limitato potenziale proliferativo delle CEC umane è stato attribuito a diversi fattori, tra cui la ridotta espressione del fattore di crescita epidermico e del suo recettore nelle cellule che invecchiano5, il TGFβ2 antiproliferativo nell'umore acqueo6 e l'inibizione del contatto2,7. Sebbene alcuni fattori di crescita, come il fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF), possano aumentare la proliferazione in un endotelio corneale umano in coltura, l'efficienza della coltura rimane limitata8,9. Inoltre, le CEC possono subire un cambiamento fenotipico durante l'espansione ex vivo, simile alla transizione epiteliale-mesenchimale (EMT)10-13. La transizione endoteliale-mesenchimale (EnMT) è caratterizzata da destabilizzazione della giunzione cellulare, perdita di polarità apicale-basale, riarrangiamento citoscheletrico, espressione di actina della muscolatura liscia alfa e secrezione di collagene di tipoI 14. Tutte queste caratteristiche possono abrogare la normale funzione delle CEC, ostacolando l'uso di CEC coltivate ex vivo nell'ingegneria tissutale. Inoltre, l'EnMT è stata associata alla patogenesi di diverse malattie endoteliali corneali, tra cui la distrofia corneale endoteliale di Fuchs e la formazione della membrana retrocorneale15,16. Pertanto, la comprensione del meccanismo dell'EnMT può aiutare a manipolare il processo EnMT e facilitare la rigenerazione dei CEC per consentire una funzione competente.

In questo studio, abbiamo descritto un metodo per isolare le CEC bovine dal bottone corneale. Nella coltura primaria in vitro, è stato osservato il processo EnMT, che include un cambiamento fenotipico, la traslocazione nucleare della β-catenina e i regolatori EMT lumaca e lumaca. Abbiamo inoltre descritto un metodo per dimostrare l'EnMT in vivo utilizzando un modello di criolesione dell'endotelio corneale di ratto. Utilizzando questi 2 modelli, abbiamo dimostrato che marimastat, un inibitore della metalloproteinasi della matrice (MMP) ad ampio spettro, può sopprimere il processo EnMT. I protocolli descritti facilitano l'analisi dettagliata del meccanismo EnMT e lo sviluppo di strategie per manipolare il processo EnMT per ulteriori applicazioni cliniche.

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Protocollo

Tutte le procedure seguite in questo studio accordato con l'Associazione per la Ricerca e la Visione e Oftalmologia Dichiarazione per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research e sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali del National Taiwan University Hospital.

1. Isolamento, coltura primaria Preparazione e Immunocolorazione bovina CEC

  1. Acquisire gli occhi bovino fresco da un mattatoio locale.
  2. Disinfettare gli occhi in un 10% w / v soluzione di iodio-povidone per 3 min. Lavare con una soluzione tampone fosfato (PBS).
  3. Raccogliere il pulsante corneale con un bisturi e forbici in condizioni sterili. Membrana Peel della Descemet con una pinza sotto un microscopio da dissezione (si noti che in questo studio, gli occhi bovini sono stati enucleati da un mattatoio locale, pertanto, la prima procedura di studio era la disinfezione degli occhi preenucleated in laboratorio).
  4. Incubare la membrana di Descemet in 1 ml di provaPSIN a 37 ° C per 30 min. Raccogliere i PEC bovine per centrifugazione a 112 g per 5 min. Risospendere le cellule in 1 ml di integrazioni media epiteliale ormonale (SHEM) contenente volumi uguali di HEPES-buffered medio di Dulbecco Modified Eagle e medie F12 di Ham, integrato con 5% di siero fetale bovino, 0,5% dimetilsolfossido, 2 ng / ml di epidermico umano fattore di crescita, 5 mg / ml di insulina, 5 mg / ml di transferrina, 5 ng / ml di selenio, 1 nmol / l di tossina colerica, 50 mg / ml di gentamicina, e 1,25 mg / ml di amfotericina B.
  5. Seme le cellule (circa 1 x 10 5 cellule per occhio) in un piatto di 6 centimetri. loro cultura nel SHEM. Incubare il piatto a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2 in aria. Modificare il terreno di coltura ogni 3 giorni.
  6. Quando le cellule raggiungono confluenza, lavarli in PBS e incubare in 1 ml di tripsina a 37 ° C per 5 min. li Raccogliere per centrifugazione a 112 xg per 5 min. Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di SHEM.
    1. Contare le cellule in un emocitometro. Seme le cellule su vetrini di copertura ad una densità di 1 x 10 4 per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti, e la cultura nelle cellule del SHEM. Per indagare l'effetto EnMT di soppressione di Marimastat, incubare le cellule in SHEM con 10 micron di Marimastat aggiunti nel terreno di coltura, e cambiare il terreno di coltura ogni 3 giorni.
  7. Fissare le cellule in un punto di tempo indicato con 250 ml di paraformaldeide al 4%, pH 7,4, per 30 min a temperatura ambiente. Permeabilize con 250 ml di 0,5% Triton X-100 per 5 min. Blocco con 10% di sieroalbumina bovina per 30 min.
  8. Incubare le cellule con anticorpi primari contro attivo beta-catenina (ABC), lumaca, e lumaca notte a 4 ° C. La diluizione degli anticorpi primari utilizzati è di 1: 200. Gli anticorpi sono diluiti in diluente anticorpale composto di 10 mM PBS, 1% w / v di BSA e 0,09% w / v di sodio azide.
  9. Lavare le cellule due volte con PBS per 15 min, e incubare lam con l'anticorpo Alexa Fluor-coniugato secondario (1: 100 nel diluente) a temperatura ambiente per 1 ora.
  10. Controcolorare nucleo della cellula coprendo le cellule con 2 ug / ml di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo, lavare le cellule due volte con PBS per 15 min, e montarli con anti-sbiadimento soluzione di montaggio.
  11. Ottenere immagini di immunofluorescenza alle lunghezze d'onda di eccitazione di 405 e 488 nm utilizzando un scansione laser microscopio confocale con 20X ingrandimento dell'obiettivo.

Modello 2. Rat endotelio corneale Cryoinjury e Intracameral Iniezione

  1. Anestetizzare 12 settimane di età ratti maschi Sprague-Dawley con iniezioni intramuscolari di 2% xilazina (5,6 mg / kg) e tiletamina più zolazepam (18 mg / kg). Delicatamente pizzicare la pelle degli animali per confermare il corretto anestesia in assenza di contrazioni della pelle.
  2. Instillare una goccia di 0,5% proparacaina cloridrato per l'occhio destro di ogni ratto per ridurre al minimo dolore agli occhi e lo sbattere delle palpebre. Infonderetetraciclina unguento per l'occhio sinistro per prevenire la secchezza della cornea.
  3. Raffreddare una sonda in acciaio inossidabile (diametro = 3 mm) in azoto liquido. Applicare la sonda in acciaio inossidabile per la cornea centrale dell'occhio destro per 30 sec. Spesso infondere PBS all'occhio destro durante la procedura per prevenire la secchezza della cornea.
  4. Instillare 0,1% e dello 0,3% atropina gentamicina solfato subito dopo cryoinjury e una volta al giorno per alleviare il dolore oculare derivante da ciliare spasmo e per prevenire l'infezione.
    1. Dopo la procedura, mantenere i ratti calda usando una lampada di calore, e osservare il loro recupero ogni 15 min dopo l'anestesia fino a quando non riprendere il controllo del motore. Inoltre, applicare tetraciclina pomata per l'occhio destro per prevenire la secchezza della cornea durante il periodo di recupero.
  5. Ripetere la cryoinjury corneale per 3 giorni consecutivi.
  6. Per fornire Marimastat o bFGF nella camera anteriore degli occhi ratto, anestetizzare i topi come descritto in precedenza. Instillare una gocciadel 0,5% proparacaina cloridrato in l'occhio destro per ridurre al minimo dolore agli occhi e lo sbattere delle palpebre.
  7. Irrigare la superficie oculare con PBS sterile. Eseguire paracentesi camera anteriore sotto un microscopio operatorio inserendo un ago 30 G attaccato ad una siringa da 1 ml a cornea chiara paralimbal in un piano sopra e parallela alla dell'iride.
  8. Girare l'ago smusso, e un po 'deprimono la ferita corneale per drenare un po' di umore acqueo e ridurre la pressione intraoculare. Iniettare 0,02 ml del farmaco intracamerally. comprimere delicatamente il tratto ago con una punta di cotone durante il ritiro dell'ago.
  9. Fotografare l'occhio esterno in un punto di tempo indicato sotto il microscopio operatorio.

3. La raccolta Rat bottone corneale e Immunocolorazione

  1. Per eutanasia i topi, metterli in una camera di eutanasia e di infondere il 100% di CO 2 ad un tasso di riempimento del 10-30% del volume della camera per minuto. Mantenere CO 2 di infusione per unulteriore minuto dopo la mancanza di respiro e colore degli occhi sbiaditi.
  2. Penetrare l'occhio ratto a limbus con una lama affilata. Tagliare le cornee con le forbici corneali lungo il limbus. Appiattire le cornee di una diapositiva. Fai incisioni radiali supplementari se le cornee rannicchiarsi.
  3. Fissare le cornee con 250 ml di paraformaldeide al 4%, pH 7,4, per 30 min a temperatura ambiente. Permeabilize con 250 ml di 0,5% Triton X-100 per 5 min, e bloccare con il 10% di sieroalbumina bovina per 30 min.
  4. Incubare le cornee con anticorpi primari contro ABC notte a 4 ° C con una diluizione di 1: 200 nel diluente. Lavare le cornee due volte con PBS per 15 min, e incubare con l'anticorpo secondario (1: 100 nel diluente) a temperatura ambiente per 1 ora. Controcolorare nucleo della cellula coprendo le cellule con 2 ug / ml di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo, e lavare le cellule due volte con PBS per 15 min.
  5. Montare le cornee di anti-sbiadimento soluzione di montaggio. Obtain le immagini di immunofluorescenza alle lunghezze d'onda di eccitazione di 405 e 561 nm con un microscopio confocale a scansione laser a 20X di ingrandimento obiettivo.

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Risultati

Dopo l'isolamento di PEC bovina, le cellule sono state coltivate in vitro. La Figura 1 presenta le immagini contrasto di fase dei PEC bovina. La forma esagonale delle cellule a confluenza indicato che le cellule non sono stati contaminati da corneale fibroblasti stromali durante l'isolamento delle cellule. La Figura 2 illustra l'immunocolorazione che è stata eseguita utilizzando anticorpi contro ABC, lumaca, e in blocco in un punto d...

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Discussione

PEC sono noti per la loro propensione a subire EnMT durante la proliferazione cellulare. Sviluppare strategie per sopprimere il processo EnMT per scopi terapeutici, una conoscenza approfondita del meccanismo EnMT è necessario. Abbiamo descritto 2 modelli di indagare EnMT, vale a dire la CEC bovina nel modello di coltura in vitro e nel ratto corneale endoteliale modello cryoinjury. I nostri risultati hanno dimostrato il processo EnMT in entrambi i modelli. Inoltre, l'effetto di soppressione...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da dichiarare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il personale del Second Core Lab, Dipartimento di Ricerca Medica, Ospedale Universitario Nazionale di Taiwan per il loro supporto tecnico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
tripsinaThermoFisher Scientific12604-013
Dulbecco' s modificato Eagle medium e Ham's F12 mediumThermoFisher Scientific11330
siero fetale bovinoThermoFisher Scientific26140-079
dimetil solfossidoSigmaD2650
fattore di crescita epidermico umanoThermoFisher ScientificPHG0311
insulina, transferrina, selenio...ThermoFisher Scientific41400-045
tossina coleraSigmaC8052-1MG
gentamicinaThermoFisher Scientific15750-060
amfotericina BThermoFisher Scientific15290-026
paraformaldeideMicroscopia elettronicaScienze 111219
Triton X-100SigmaT8787 
albumina sierica bovinaSigmaA7906
marimastatSigmaM2699-25MG
anticorpo beta-catenina anti-attivoMillpore05-665
anticorpo anti-lumacaSanta cruzsc28199
anticorpo anti-lumacaSanta cruzsc15391
capra anti-topo IgG (H+L) secondario anticorpoThermoFisher ScientificA-11001per la colorazione dell'ABC delle CEC bovine
anticorpo IgG (H+L) di capraThermoFisher ScientificA-11003per la colorazione dell'ABC dell'endotelio corneale di ratto
anticorpo IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-11008per la colorazione di lumaca e lumaca di CEC bovine
diluente anticorpaleGenemed Biotecnologie10-0001
4',6-diamidino-2-fenilindoloThermoFisher ScientificD1306
mezzo di montaggioVector Laboratories MicroscopioH-1000
ZEISSLSM510
xilazina BayerN/A
tiletamina più zolazepamVirbacN/Afarmaco
veterinario proparacaina cloridrato soluzione oftalmicaAlconN/Afarmaco veterinario
0,1% atropinaWu-Fu Laboratories Co., LtdN/Afarmaco clinico 
0,3% gentamicina solfatoSinphar GruppoN/Afarmaco clinico 
fattore di crescita dei fibroblasti di baseThermoFisher ScientificPHG0024farmaco clinico 
capra confocale a scansione laser

Riferimenti

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