Articolo metodologico

Fabbricazione di invertito colloidale cristallo poli (glicole etilenico) Scaffold: una piattaforma Cell Culture tridimensionale per il fegato Tissue Engineering

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DOI:

10.3791/54331

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27 agosto 2016

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1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato per la fabbricazione di una piattaforma di coltura di epatociti tridimensionale emergente, l'impalcatura di cristalli colloidali invertiti e le tecniche concomitanti per valutare il comportamento degli epatociti. I pori controllabili in base alle dimensioni, l'interconnettività e la capacità di coniugare le proteine della matrice extracellulare all'impalcatura di poli(glicole etilenico) (PEG) migliorano le prestazioni delle cellule Huh-7.5.

Abstract

La capacità di mantenere la funzione degli epatociti in vitro, allo scopo di testare citotossicità xenobiotici ', studiando virus e sviluppare farmaci mirati al fegato, richiede una piattaforma in cui le cellule ricevono adeguati segnali biochimici e meccanici. sistemi recenti ingegneria dei tessuti del fegato hanno impiegato tridimensionali (3D) impalcature composte da idrogeli sintetici o naturali, data la loro ritenzione idrica e la loro capacità di fornire gli stimoli meccanici necessari da parte delle cellule. C'è stato un crescente interesse nella scaffold invertito cristallo colloidale (ICC), uno sviluppo recente, che consente un'elevata organizzazione spaziale, omotipica e interazioni cellula heterotypic, così come matrice di interazione cellula-extracellulare (ECM). Qui, descriviamo un protocollo per fabbricare patibolo ICC utilizzando poli (glicole etilenico) diacrilato (PEGDA) e il metodo di lisciviazione delle particelle. Brevemente, un reticolo è costituito da particelle di microsfere, dopo di che un pre-polymesi aggiunge soluzione r, correttamente polimerizzato, e le particelle vengono poi rimosso o dilavati, utilizzando un solvente organico (ad esempio, tetraidrofurano). La dissoluzione dei risultati reticolari in un ponteggio altamente porosa con dimensione dei pori controllati e interconnectivities che permettono media per raggiungere le cellule più facilmente. Questa struttura unica permette elevata area superficiale per le cellule di aderire come pure facile comunicazione tra i pori, e la capacità di rivestire il ICC scaffold PEGDA con proteine ​​mostra anche un effetto marcato sulla prestazioni della cella. Analizziamo la morfologia del patibolo, così come la cella di epatocarcinoma comportamento (Huh-7.5) in termini di fattibilità e la funzione di esplorare l'effetto della struttura ICC e rivestimenti ECM. Nel complesso, questo documento fornisce un protocollo dettagliato di una impalcatura emergente che ha ampie applicazioni in ingegneria dei tessuti, in particolare l'ingegneria dei tessuti del fegato.

Introduzione

Il fegato è un organo altamente vascolarizzato con una moltitudine di funzioni, tra cui la disintossicazione del sangue, metabolismo di xenobiotici, e la produzione di proteine ​​del siero. tessuto epatico ha un complesso microstruttura tridimensionale (3D), composto da più tipi di cellule, canalicoli biliari, sinusoidi, e zone di diversa composizione biomatrice e concentrazioni di ossigeno differenti. Data questa struttura elaborata, è stato difficile creare un modello di fegato corretta in vitro 1. Tuttavia, vi è una crescente domanda di funzionale in modelli in vitro di hosting epatociti umani come piattaforme per la tossicità test anti-droga 2 e studiare malattie associate con il fegato 3.

Piattaforme di ingegneria tissutale epatica corrente hanno semplificato la complessità del fegato isolando uno, o concentrandosi su alcuni, dei parametri del fegato, cioè co-coltura delle cellule 4, composizione biochimica della zonaL microambienti 5, dinamica del flusso 6,7 e la configurazione del Biomatrice 8. Configurazione della biomatrice può essere suddiviso in parametri quali materiali impalcatura, la composizione di matrice extracellulare (ECM) proteine, matrice di rigidezza nonché la progettazione e la struttura del ponteggio. C'è stato un aumento negli studi di ingegneria dei tessuti utilizzando idrogel sintetici, in particolare poli (glicole etilenico) (PEG) idrogel 9, data la possibilità di regolare le proprietà meccaniche, bioattività, e velocità di degradazione del idrogel. Per quanto riguarda la ricerca di fegato legati, l'idrogel biocompatibile è stata applicata per lo studio infezione da virus della malattia epatica 3. Come un design della piattaforma degli epatociti, numerosi studi hanno utilizzato epatociti panino culture 10,11 e l'incapsulamento delle cellule all'interno di un idrogel 12,13 per fornire l'ambiente 3D e cellula-ECM e l'interazione cellula-cellula, che sono essenziali per imitare nel microambiente vivo. However, queste piattaforme non possiedono un alto grado di controllo e organizzazione spaziale, portando a proprietà non uniformi attraverso l'impalcatura 14.

Il colloidale cristallo invertita (ICC) 14 patibolo è un'impalcatura 3D altamente organizzato per coltura cellulare che è stato introdotto nei primi anni 2000. struttura unica del ponteggio può essere attribuito al semplice processo di fabbricazione utilizzando un cristallo colloidale, un reticolo ordinata di particelle colloidali di diametro variabile. In breve, per riassumere il processo, le particelle sono disposti in modo ordinato e ricotta usando il calore in modo da formare un reticolo. La lisciviazione del lattice, da un solvente organico, in polimerizzati risultati idrogel in cavità sferiche esagonale confezionati 15 con elevata area superficiale. Questa impalcatura altamente ordinato è già stato fatto con entrambi i materiali sintetici e naturali, incluso ma non limitato a poli (acrilammide) 16-21, poli (lattico-co-glicolico acido) 15,22-30, Poli (glicole etilenico) 31,32, poli (2-idrossietil metacrilato) 21,33-35, e chitosano 36-39. Impalcature ICC in materiali non sottomarina tendono a promuovere sferoidi cellulari all'interno delle cavità 14,23,40. Tipi di cellule multiple hanno dimostrato di proliferare successo, differenziare e funzione all'interno di questa configurazione, compresi condrociti 41, cellule stromali del midollo osseo 42, e cellule staminali 43,44. Per quanto riguarda epatociti, gli studi sono stati condotti con impalcature ICC fatte di Na 2 SiO 3 e poli (acrilammide), ma non PEG. Con semplici strategie bioconjugation (vale a dire, l'accoppiamento ammina attraverso EDC / NHS), ponteggi PEG basati su ECM proteine-coniugati possono essere fabbricate, che può rivelarsi siti di legame più cellulari per essere un più vivo come l'ambiente e migliorare la funzione epatica.

In questo manoscritto e il video associato, dettagliamo la fabbricazione del ponteggio ICCutilizzando poli (glicole etilenico) diacrilato idrogel (PEGDA) e un reticolo di polistirolo microsfere, ottimizzato per epatocarcinoma (Huh-7.5) cultura. Dimostriamo le differenze tra i generalmente non adesivo nude ponteggi ICC PEGDA e il collagene rivestite PEGDA ICC impalcatura in termini di topologia patibolo e le prestazioni delle cellule. La vitalità cellulare e la funzione sono misurati qualitativamente e quantitativamente per valutare il comportamento delle cellule Huh-7.5.

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Protocollo

1. ICC Scaffold Fabrication (Figura 1)

  1. Preparare il polistirolo (PS) reticoli (diametro = 6 mm; 8-13 strati di perline).
    1. Per preparare lo stampo, tagliare le punte fuori da 0,2 ml microprovette prova di bollire a livello di 40 ml. Far aderire la parte superiore del taglio tubi a 24 x 60 mm 2 microscopio scivola in vetro di copertura con colla impermeabile.
    2. Mettere le sfere PS (diametro = 140 micron) contenuti all'interno di una sospensione acquosa in un flaconcino da 20 ml, con attenzione pipetta la sospensione acquosa, e aggiungere 18 ml di soluzione al 70% di etanolo nel flaconcino. Mettere la soluzione sfera in un bagno a ultrasuoni per allentare sfere aggregati. Ripetere questo passaggio di lavaggio più volte per rimuovere completamente acqua ei componenti idrosolubili.
    3. Dispensare 100 ml di etanolo negli stampi.
    4. Tagliare la parte superiore di una punta micropipetta 200 microlitri di 4 mm. Pipettare 25 microlitri delle sfere nello stampo due volte con 200 microlitri micropipetta per raggiungere unvolume totale di 50 microlitri di ogni stampo.
    5. Mettere gli stampi su un agitatore oscillante a 120 rpm durante la notte.
    6. Controllare la disposizione delle sfere in ogni stampo sotto un microscopio ottico. Se le sfere non sono ordinati esagonale, aggiungere 50 ml di etanolo al 70% e agitare manualmente nella direzione longitudinale e laterale per correggere la disposizione.
    7. Lasciare evaporare l'etanolo a temperatura ambiente (RT) per due notti. Posizionare lo stampo e complesso tallone in un forno a 130 ° C per 6 ore per temprare le perline PS.
  2. Preparazione nude e ECM rivestite impalcature PEGDA.
    1. Sintetizzare macromeri PEGDA utilizzando protocolli stabiliti 45,46 per acrylating macromeri PEG lineari (M w = 4,6 kDa).
    2. Preparare 50% (w / v) PEGDA in acqua deionizzata (DI) e consentire il macromero sciogliere correttamente per centrifugazione a 4.713 xg fino a completa dissoluzione.
      1. Per ECM coniugato ponteggi ICC, sciogliere un ulteriore10% (w / v) Acryloyl-PEG-NHS (M w = 3,4 kDa) nella soluzione PEGDA 50%.
    3. Preparare un 20% (w / v) stock soluzione di 2-idrossi-4 '- (2-idrossietossi) -2-methylpropiophenone (PI) in etanolo al 70%.
    4. Aggiungere 50 ml di 20% (w / v) PI magazzino per 1 ml di 50% (w / v) di PEGDA. Regolare la quantità necessaria di soluzione PI in base al peso molecolare di PEGDA.
    5. Vortex il composto in provetta da centrifuga per 1 min per raggiungere una soluzione omogenea.
    6. Sbucciare gli stampi dal vetrino (dal punto 1.1.7), rimuovere la colla dagli stampi, spingere i reticoli con cura utilizzando una spatola e mettere ciascuno di essi in una provetta da 1,5 ml. Pipettare 300 microlitri della soluzione PEGDA e centrifugare a 845 xg per 5 minuti per consentire la corretta PEGDA soluzione di infiltrazione nel reticolo.
    7. Rimuovere il reticolo dal tubo con una pinzetta e accuratamente asciugare soluzione PEGDA eccesso sui guanti. Posizionare il reticolo su un vetro pellicola rivestita di paraffina con il cir piattasuperficie lare rivolta verso l'alto.
    8. Esporre la soluzione PEGDA patibolo infiltrato a 365 nm raggi ultravioletti (UV) (10.84 mW / cm 2) per 5 minuti utilizzando una lampada UV spot.
    9. Posizionare reticoli cristallini PEGDA-polimerizzati in nuove fiale (circa 10 tralicci per flaconcino) e aggiungere 20 ml di tetraidrofurano (THF). Agitare i flaconi in un agitatore orbitale a 300 rpm. Cambiare THF almeno 3 volte con un intervallo di 1-2 ore.
      Nota: Non rimuovere completamente THF quando si cambia il THF per evitare bolle di entrare i ponteggi, che a sua volta può causare la rimozione incompleta di PS. Lasciare abbastanza soluzione per coprire i reticoli e aggiungere nuovi THF.
      Attenzione: THF è tossico. Indossare guanti, un camice da laboratorio e occhiali. Evitare l'inalazione operando sotto la cappa.
    10. Controllare se sfere PS sono sciolti da mettere l'acqua nella soluzione THF utilizzato e osservando il colore della soluzione. Ripetere il punto 1.2.9 se le sfere PS non sono adeguatamente sciolti.
      Nota: Il colore soluzione cambieràbianco se ci sono sfere PS rimanenti.
  3. Pulire i ponteggi nell'armadio biosicurezza (BSC).
    1. Per sterilizzare i ponteggi, preparare una provetta da centrifuga da 50 ml con 2 ml di etanolo al 70% per ponteggio e posizionare i ponteggi nel tubo con una spatola. Lasciare i ponteggi in ammollo in etanolo per 1 ora. Da questo punto in avanti, effettua tutte le procedure del BSC.
    2. Versare con cautela l'etanolo e sostituirlo con tampone fosfato (PBS) (2 ml per impalcature) e centrifugare a 524 xg per 3 minuti per rimuovere le bolle. Conservare in frigorifero e cambiare il PBS alcune volte con un intervallo di 1-2 ore.
      1. Per collagene di tipo I ponteggi rivestite, preparare un altro 50 ml tubo da centrifuga contenente collagene di tipo 1 di soluzione (1 ml per ponteggio), trasferire i ponteggi sterilizzati per questo tubo con una spatola, e centrifugare a 524 xg per 3 min. Agitare i ponteggi a 400 rpm su un agitatore orbitale per 30 min e mantenere il tubo nella attrezzao durante la notte.
      2. Lavare i ponteggi con PBS due volte prima di utilizzare immergendo i ponteggi in PBS fresco e poi aspirare il PBS.
        Nota: Altre proteine ​​ECM possono anche essere usati al posto di collagene tipo I, perché la chimica NHS richiede un gruppo amminico per formare il legame (Figura 2).

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Figura 1. Panoramica ICC fabbricazione. Impalcature ICC PEG-based sono fabbricati con tecniche di microfabbricazione con e senza ECM-funzionalizzazione. Ponteggi ICC ECM rivestite richiedono PEG-NHS nonché PEGDA (come indicato nella figura 2). Il reticolo PS ha un diametro di 6 mm e un'altezza di 8-13 strati tallone. PS, polistirolo; PEGDA, poli (glicole etilenico) diacrilato; UV, raggi ultravioletti; THF, tetraidrofurano; ECM, matrice extracellulare. Questo dato è stato modificato e utilizzato con il permesso di WiLey 47. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Struttura ICC Caratterizzazione

  1. Per analizzare la struttura ICC con o senza proteine ​​coniugate, utilizzare la microscopia elettronica a scansione (SEM) 47.
    1. Fissare i ponteggi con 4% paraformaldeide (PFA), serialmente li disidratano in 25, 50, 75, 95 e 100% etanolo soluzioni, e conservare a -80 ° C fino alla etanolo evapora completamente.
    2. campioni asciutti in un essiccatore di congelamento per 48 ore.
    3. Fissare il campione sul supporto del campione con del nastro di carbonio e mettere in un dispositivo a induzione polverizzazione.
    4. Dopo aspirapolvere automatico, ricoprirlo con un film di Pt di spessore 10 nm per sputtering per 60 sec a 20 mA.
    5. Ponteggi Immagine ICC utilizzando SEM a una tensione di 5 kV (Figura 3A, Figura 4A).
  2. Per misurare il poro ediametro interconnessione di cavità, analizzare micrografie SEM utilizzando immagine software di analisi 48 (ad esempio, ImageJ; la figura 3B, C).
  3. Per visualizzare il collagene coniugato al patibolo, senza cellule, etichetta fluorescente il collagene utilizzando anticorpi (1: 100) nei confronti del collagene di tipo I e di immagine con scansione laser confocale microscopia a 47 (CLSM; Figura 4B).

3. Huh-7.5 coltura cellulare e semina

  1. Culture Huh-7,5 cellule ad una densità di semina di 2-2,5 x 10 6 cellule / ml in piastre di coltura di cellule 100 mm con 10 ml Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 100 U / ml di Dulbecco la penicillina-streptomicina (terreni di coltura) a 37 ° C e 5% di CO 2. Modificare i media ogni tre giorni nel BSC fino a quando non hanno raggiunto il 75-80% di confluenza.
  2. Preparare i ponteggi per la semina delle cellule nel BSC.
    1. posizionare con cura il Scaffolds in un 24-pozzetti con la superficie piatta rivolta verso l'alto.
    2. Per lavare il patibolo, pipetta 2 ml di PBS a ciascun pozzetto contenente un ponteggio. Aspirare il PBS e pipetta 2 ml di PBS fresco in tutti i pozzetti.
    3. Aspirare il PBS e pipetta 2 ml di terreni di crescita (vedi punto 3.1) e lasciar riposare per 30 minuti. Aspirare i media e consentire l'impalcatura asciugare per 1 ora.
  3. Staccare confluenti Huh-7,5 cellule (dal punto 3.1) dalla piastra di coltura nel BSC utilizzando il metodo di digestione tripsina.
    1. supporti Aspirare dal piatto, aggiungere 4 ml di PBS per lavare cellule aderenti e quindi aspirare PBS.
    2. Pipetta 0.75-1 ml 0,25% tripsina e posto in un incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2 per 3 min.
    3. Rimuovere la piastra da incubatore e pipetta 5 ml mezzi per arrestare la reazione tripsina. mezzi Pipetta, cellule indipendenti, e la miscela di tripsina in un tubo da 15 ml.
    4. Centrifugare a 524 xg per 3 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di media.
  4. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e calcolare il volume della sospensione cellulare contenente cellule al numero di destinazione, N 0, per 25 microlitri (per l'esperimento di serie, N 0 è 1 x 10 6 cellule).
    Volume di sospensione cellulare = (numero di celle di destinazione) / (concentrazione di sospensione cellulare)
  5. Lentamente pipettare 25 ml di sospensione cellulare (contenente N 0 celle) direttamente sulla parte superiore di ogni impalcatura (dal punto 3.1.4). Posizionare la piastra 24 pozzetti in incubatrice.
  6. Dopo 12 ore, trasferire i ponteggi attenzione con l'uso di una spatola in un nuovo 24-pozzetti e pipetta 2 ml di supporti in ogni pozzetto. Posizionare la piastra 24 pozzetti in incubatrice.
  7. Modificare i media ogni 3 giorni o seconda quando il supporto viene raccolto per l'analisi di secrezione delle proteine ​​(vedi punto 5.1).

4. vitalità cellulare

  1. Per analizzare qualitativamente vitalità cellulare, utilizzare fluorescenti live / kit di colorazione morti per colorare le cellule e l'immagine usando CLSM.
    1. A seguito di istruzioni kit, preparare una soluzione con 4 mM calceina AM e 8 micron etidio omo-dimero-1 nei media (vedi punto 3.1.3).
      Nota: ottimizza a seconda del numero di cellule. Utilizzare il doppio della quantità di reagente se le cellule proliferano e doppio di numero (circa 2 milioni).
    2. Nel BSC, i media aspirare in ogni pozzetto con un'impalcatura (passo 3.7) e pipetta 500 ml di soluzione preparata. Incubare i campioni in un incubatore a 37 ° per 1 ora.
    3. Coprire le piastre in stagnola per proteggere i campioni dalla luce quando si rimuove la piastra fuori dell'incubatore. campioni di immagine utilizzando CLSM49.
  2. Per valutare quantitativamente vitalità cellulare, misurare l'attività enzimatica (in cellule vive) mediante saggi colorimetrici 50 (cioè, 2- (2-metossi-4-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolio (reagente monosodico-sale)).
    1. Creare una curva standard per la piattaforma ICC (cioè, un grafico di assorbanza (OD) versus determinato numero di cellulare).
      Nota: Cell semina non è efficiente al 100% in confronto ad altre piattaforme, poiché le cellule possono passare attraverso le cavità di ponteggi.
      1. Determinare i numeri di semina delle cellule, N 0 che verranno utilizzati per rendere la curva standard.
        Nota: scegliere una gamma che comprende il numero di cellule che si stima nell'esperimento. Ad esempio, se il numero di cellule iniziale è 5 x 10 5 cellule e vi è una stima ~ 3 volte maggiore entro l'ultimo giorno dell'esperimento, scegliere 2.5 x 10 5, 5 x 10 5, 1 x 10 6, e 2 x 10 6 cellule come N 0.
      2. Eseguire semina cellulare nelle impalcature ICC (una N 0 per ponteggio con un volume di semina di 25 mL) come descritto nei passaggi 3.1-3.6.
      3. Dopo 6 ore, trasferire i ponteggi ad un altro 24-pozzetti bene. Selezionare un tempo che permette l'adesione delle cellule, ma non la proliferazione cellulare.
      4. Eseguire il conteggio delle cellule sul patibolo ICC trasferito.
        1. Diluire 10X soluzione (MSR) monosodico sale reagente a 1x con i media del BSC e pipetta 500 microlitri soluzione 1x MSR in tutti i pozzetti con un'impalcatura. Incubare la piastra 24 pozzetti a 37 ° C per 1 ora.
        2. Da ogni bene, trasferire 100 ul in una piastra da 96 pozzetti bene. Come un vuoto, pipetta 100 ml di soluzione di reagente 1x monosodico sale fresco in diversi pozzetti sulla piastra a 96 pozzetti. rimuovere manualmente eventuali bolle attuale utilizzando un puntale a secco e coprono la piastra a 96 pozzetti in un foglio per proteggerlo dalla luce.
        3. Misurare OD a λ = 450 nm lettura utilizzando uno spettrofotometro. Sottrarre il diametro esterno in bianco da altri valori per trovare la OD accurata 51.
      5. Contare il numero di cellule (N L) rimanendo nel pozzo dopo il trasferimento del ponteggio (passo 4.2.1.3) con un emocitometro.
        Nota: utilizzare 300 ml di tripsina per trypsinize cellule.
      6. Calcolare il numero di cellule effettivo, N A.
        = effettiveiniziale - lasciato in bene
        N A = N 0 -N L
      7. Fai la curva standard riportando OD ottenuto nel passaggio 4.2.1.4.3 rispetto al numero di cellule effettivo (N A) e usare questo per stimare il numero di cellule negli esperimenti.
        Nota: Creare una nuova curva standard, se i parametri ICC (ad esempio, le dimensioni porogen, dimensioni del patibolo, proteine ​​ECM, ecc) vengono modificate.

Funzione 5. cellulare

  1. Analizzare la secrezione di proteine ​​da parte delle cellule Huh-7.5 (vale a dire, l'albumina, urea) da parte dei media raccolti (dal punto 3.7) da enzima saggio di immunoassorbimento (ELISA) 52.
    Nota: Diluire la carta, in funzione del numero di cellule seminate e la quantità di materiale raccolto. Per 5 x 10 5 cellule seminate in ICC, utilizzare un ~ rapporto 1: 25, prima di introdurlo ai pozzetti anticorpi preverniciata.
  2. Per analizzare qualitativamente la funzione delle cellule, immunostain specifiche proteine ​​intracellulari(Cioè, l'albumina), enzimi (cioè CYP450), componenti strutturali macchia (cioè, actina cellulare) così come i nuclei e immagine utilizzando CLSM 49.
    1. supporti Aspirare (dal punto 3.7) e pipetta 2 ml di PBS per lavare i ponteggi ICC cellulari carichi.
    2. Pipettare 1 ml di 4% PFA e incubare per 5 min a temperatura ambiente per il fissaggio.
    3. Lavare 3x con 2 ml di PBS.
    4. Permeabilize membrane incubando i ponteggi in 1 ml di 0,1% 4- (1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilene glicole (tensioattivo) per 30 min.
    5. Lavare 3x con 2 ml di PBS per rimuovere eventuali perdite proteine.
    6. Dispensare 500 microlitri 1% di albumina sierica bovina (BSA) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora per bloccare legame non specifico.
    7. Preparare anticorpo primario diluito (vale a dire, l'albumina, CYP450) soluzione.
      1. Pipettare 500 ml di soluzione di BSA 1% in una provetta da 15 ml e aggiungere 4,5 ml di 0,1% di soluzione di tensioattivo per preparare un 5 ml di 0,1% BSA soluzione totale.
      2. Pipettare 98 ml di soluzione di BSA allo 0,1% in una provetta da microcentrifuga 200 microlitri e 2 ml di anticorpo primario per produrre un 01:50 (anticorpo primario: 0,1% BSA) soluzione di anticorpo primario.
    8. Pipettare 40 microlitri della soluzione di anticorpo primario sull'impalcatura e coprire il substrato con parafilm. Avvolgere la piastra 24 e con un foglio di alluminio e conservare il piatto a 4 ° C durante la notte.
    9. Lavare 3x con 2 ml di PBS e agitare delicatamente la piastra in mezzo di lavaggio.
    10. Preparare diluito anticorpo secondario biotinilato (vale a dire, anti-topo anticorpi) stock soluzione.
      1. Pipettare soluzione BSA 198 microlitri 0,1% e 2 microlitri secondo anticorpo per produrre un 1: 100 (anticorpo secondario: 0,1% BSA) soluzione di anticorpo secondario.
      2. Preparare una soluzione madre 0,1% di rodamina o fluoresceina phalloidin marcato (a macchiare i filamenti di actina cellulari) nella soluzione di BSA 0,1%.
      3. Pipettare 25 ml di ogni soluzione in un tubo e mescolare well.
    11. Pipettare 50 ml di soluzione di anticorpo secondario magazzino sul patibolo. Coprire il patibolo con una pellicola di paraffina, avvolgere il piatto con un foglio di alluminio e conservare a temperatura ambiente per 2 ore.
    12. Lavare 3x con 2 ml di PBS.
    13. Pipettare 200 ml di 0,2% 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, una macchia di nucleo) soluzione sul patibolo e mantenere a temperatura ambiente per 2-3 minuti. Coprire la piastra con un foglio di alluminio.
    14. Lavare 2x con 2 ml di PBS.
    15. Utilizzando un contagocce, una goccia di mezzo di montaggio sul substrato.
    16. Attentamente mettere il ponteggio su un vetrino e immagine utilizzando CLSM 47.
  3. Valutare l'espressione genica mediante la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qPCR). Utilizzare i kit standard per la trascrittasi inversa PCR (RT-PCR) 53 e qPCR 54 secondo le istruzioni del produttore. Estrarre il RNA dalle cellule come descritto di seguito.
    1. Posizionare il patibolo (dal punto 3.7) in una provetta da 1,5 ml.
    2. Pipetta da 1 ml di una soluzione di estrazione di RNA nel tubo e conservare in un sonicatore per 5 minuti a temperatura ambiente.
    3. Pipettare 200 ml di cloroformio in ogni provetta e agitare vigorosamente la provetta in mano per 15-20 sec. Conservare le provette a temperatura ambiente per ~ 3 min fino a quando le fasi separate.
    4. Centrifugare il campione a 13.000 xg, 4 ° C per 15 minuti e rimuovere con attenzione i tubi in modo che le fasi non si mescolano.
    5. Pipettare attentamente 500-600 ml della fase acquosa superiore dal primo tubo in una seconda provetta.
    6. Aggiungere un volume equivalente (500-600 ml) di isopropanolo a questo secondo tubo.
    7. Capovolgere la provetta 3-5 volte e lasciare il tubo in piedi a temperatura ambiente per 10 min.
    8. Centrifugare il campione a 13.000 xg, a 4 ° C per 15 min.
      1. Se un pellet non è visibile nella parte inferiore della provetta, centrifugare ancora per 5 min.
        Nota: Se non vi è ancora alcuna pellet visibile, la quantità di RNA può essere insufficiente.
    9. iotubi nvert con il tappo aperto di scartare il surnatante e pipetta in 1 ml di etanolo al 70% diluito in acqua DEPC nel tubo.
    10. Leggermente vortice il tubo in modo che il pellet stacca dalla parete del tubo e poi lasciare che l'aria secca tubo.
    11. Aggiungere 50 ml di acqua DPEC per risospendere il pellet.
    12. Mantenere pipettaggio fino a quando si scioglie pellet.
    13. Mantenere per 10 min a 55 ° C per denaturare l'RNA a doppio filamento in RNA a singolo filamento.
    14. Leggermente drum dita sul fondo della provetta e centrifugare brevemente tubi (7.500 xg, 4 min, 4 ° C).
    15. Mantenere i tubi in ghiaccio fino a quando l'esecuzione della trascrittasi inversa 55 e real-time PCR, come descritto nel 56.

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Risultati

I risultati rappresentativi per la caratterizzazione strutturale del ponteggio CPI e il confronto di efficacia ogni ICC di condizione di ponteggio in coltura epatociti sono illustrati e spiegati di seguito. Le condizioni ICC scaffold utilizzati in questi risultati sono rivestimenti collagene 0 pg / ml (Bare), 20 mg / ml (collagene 20), 200 mg / ml (collagene 200), e 400 mg / ml (collagene 400) e l'iniziale huh-7.5 numero di semina cellulare è 1x10 6.

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Discussione

Ponteggi ingegneria dei tessuti sono in rapida evoluzione per fornire tutti i segnali fisici e biochimici necessari per rigenerare, mantenere o riparare tessuti per l'applicazione della sostituzione di organi, lo studio delle malattie, lo sviluppo di farmaci, e molti altri 57. In ingegneria dei tessuti del fegato, epatociti umani primari rapidamente perdono le loro funzioni metaboliche, una volta isolati dal corpo, creando un grande bisogno di ponteggi di ingegneria e sviluppo di piattaforme per mantenere...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il sostegno di un Research Foundation Fellowship nazionale (NRF -NRFF2011-01) e Programma di ricerca competitiva (NRF-CRP10-2012-07).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta PCR da 0,2 mlAxygen ScientificPCR-02D-CGorilla resistente all'ebollizione
Gorilla Glue, Inc.Dipende dal fornitore. Questo è stato acquistato da un negozio locale.
VetriniVWR631-1575Dimensioni: 24&volte; 60 mm2
Sfere di polistireneFisher ScientificTSS#4314ADiametro = 140 µ m; 3x104 particelle per millilitro e distribuzione dimensionale 1,4%
EtanoloMerck1.00983.1011assoluto per analisi EMSURE; Diluire al 70% con acqua Milli-Q
Bagno ad ultrasuoniElmaS10HForno per attrezzature
NaberthermN7/HAttrezzatura
200 & micro; l puntale per pipettaAxygen ScientificT-210-Y-R-S
Agitatore oscillanteVWR444-0142
Glicole polietilenico (PEG)Merck1.09727.0100Mw= 4 kDa; l'acrilazione dei monomeri PEG e la purificazione del precipitato risultante producono un macromero PEGDA con Mw = 4.6  kDa
CentrifugaBeckman Coulter392932Attrezzatura
acrilato-poli(glicole etilenico) - Succinimidil valeratoLaysan BioACRL-PEG-SVA-3400-1gMw = 3,4 kDa
2-idrossi-4'-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenoneSigma Aldrich410896
VortexVWR58816-123Attrezzatura
MicrocentrifugaEppendorf5404 000.413
Film di paraffinaParafilm M #PM996Mantenuto a 9" con un'intensità consentita di 10,84  mW/cm2
Bluewave 200 Faretto UVBlaze Technology 120008, 122300
Tetraidrofurano (THF)Merck107025
Agitatore orbitaleHeidolph543-123120-00-5
Collagene di tipo ISigma AldrichC3867-1VLDa ratto. 1x, senza CaCl2 MgCl2; pH = 7,2
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Gibco20012-02716% p/v aq. 10 x 10  ml
ParaformaldeideVWR43368.9M Attrezzatura
Freezone 4.5 liofilizzatoreLabconco7750020Attrezzatura
Sputter coaterJeol Ltd.JFC-1600
Attrezzatura Microscopio elettronico a scansioneJeol Ltd.JSM 5310
Anticorpi primari anti-topo contro il collagene di tipo IAbcamab6308
Anticorpo secondario anti-topo coniugato con Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21121
Piastra, coltura tissutale 24 pozzetti, fondo piatto (Nunclon) Bio-Rev PTE LTD3820-024
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)
2,5 g/L Glucosio con L-Gln		Lonza12-604F
Siero fetale bovino (FBS)GibcoA15-151
Penicillina-Streptomicina (P/S)Life Tchnologies15140-122 E
100 mm Piastre di coltura non trattate CorningSigma AldrichCLS430591
0,25% Tripsina-EDTAGibco25200-056Attrezzatura; 37  ° C, 5% di umidità
Forma Steri-Cycle CO2 IncubatoriThermofisher Scientific371
Hausser Bright-Line Phase HemacytometerThermofisher Scientific02-671-6
Kit di vitalità/citotossicità viva/morta per cellule di mammiferoLife TechnologiesL3224 
CCK-8 AssayDojindo LaboratoriesCK04-11Reagente al sale di monosodio (MSR)
Lettore di micropiastre Infinite 200 PRO Kit
AlbuminaAbcamab108788
Triton X-100Bio-Rad#1610407
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA2153-50G
Anticorpi primari anti-topo (contro CYP3A4, albumina)Santa Cruz Biotechnologysc-53850; sc-271605
DAPILife TechnologiesD3571
Alexa Fluor 555 marcato FalloidinaLife TechnologiesA34055
TrizolLife Technologies15596-026
CloroformioVWR22706.326
IsopropanoloFisher Scientific67-63-0
DPEC acquaThermofisher ScientificAM9916
Nanodrop Spettrofotometro 2000cThermofisher ScientificND-2000
iScript Trascrizione inversa Supermix Bio-Rad Laboratories1708840
SYBR selezionano Master Mix per CFXLife Technology4472937
Primer (da scegliere)
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal CyclerBio Rad LaboratoriesSOFT-CFX-31-PATCH 
Colla ELISA umano Tecan

Riferimenti

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