Un protocollo per la preparazione e caratterizzazione di lipofila doxorubicina pro-farmaco caricata 1,2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polietilene glicole) -2000] (DSPE-PEG) micelle è descritto.
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Articolo metodologico
Preparazione e caratterizzazione di lipofila doxorubicina micelle pro-farmaco
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le micelle sono state utilizzate con successo per la somministrazione di farmaci antitumorali. I polimeri anfifilici formano micelle strutturate nucleo-guscio in un ambiente acquoso attraverso l'autoassemblaggio. Il nucleo idrofobico delle micelle funziona come un serbatoio di farmaci e incapsula i farmaci idrofobici. Il guscio idrofilo impedisce l'aggregazione delle micelle e prolunga anche la loro circolazione sistemica in vivo. In questo protocollo, descriviamo un metodo per sintetizzare un pro-farmaco lipofilo doxorubicina, l'acido doxorubicina-palmitico (DOX-PA), che aumenterà il carico di farmaco nelle micelle. Un linker dell'idrazone sensibile al pH è stato utilizzato per coniugare la doxorubicina con il lipide, che facilita il rilascio di doxorubicina libera all'interno delle cellule tumorali. Il DOX-PA sintetizzato è stato purificato con una colonna di gel di silice utilizzando diclorometano/metanolo come eluente. Il DOX-PA purificato è stato analizzato con cromatografia su strato sottile (TLC) e 1spettroscopia di risonanza magnetica nucleare H (1H-NMR). È stato utilizzato un metodo di dispersione del film per preparare micelle DSPE-PEG caricate con DOX-PA. Inoltre, vengono descritti diversi metodi per caratterizzare le formulazioni micellari, tra cui la determinazione della concentrazione di DOX-PA e dell'efficienza di incapsulamento, la misurazione delle dimensioni e della distribuzione delle particelle e la valutazione delle attività antitumorali in vitro. Questo protocollo fornisce informazioni utili per quanto riguarda la preparazione e la caratterizzazione di micelle caricate con farmaci e quindi faciliterà la ricerca e lo sviluppo di nuovi nanofarmaci antitumorali basati sulla micella.
Introduzione
La chemioterapia è comunemente usato per trattare varie forme di cancro. La maggior parte, se non tutti, i farmaci chemioterapici hanno effetti collaterali tossici che possono variare da condizioni minori gestibili, come nausea e diarrea, a condizioni che minacciano la vita più. Poiché la maggior parte farmaci antitumorali sono tossici, l'esposizione non selettivo di questi farmaci al tessuto normale provoca inevitabilmente la tossicità. Pertanto, vi è una grande necessità di un approccio terapeutico che può trasportare selettivamente farmaci nelle cellule tumorali. Un'altra sfida con la somministrazione di farmaci antitumorali è la loro scarsa solubilità in acqua. Di solito, sono necessari agenti solubilizzanti per formulare questi farmaci scarsamente solubili. Tuttavia, la maggior parte agenti solubilizzanti, come dimetil solfossido (DMSO), Cremophor EL, e polisorbato 80 (Tween 80) possono causare tossicità epatica e renale, emolisi, reazioni di ipersensibilità acuta e neuropatie periferiche. 1 Perciò, formulazioni sicure e biocompatibili sono necessari per l'uso clinico di poverifarmaci antitumorali mente solubili. Nanovettori sono promettenti sistemi di drug delivery per affrontare le sfide di cui sopra. Questi nanovettori includono liposomi, nanoparticelle 2, 3 micelle, 4-7 coniugati polimero-farmaco, 8 e materiali inorganici. 9 Diversi prodotti nanomedicina (ad esempio, Doxil, Abraxane, e Genexol) sono stati approvati dalle agenzie di regolamentazione per il trattamento di pazienti affetti da cancro. 10
Micelle polimeriche sono promettenti vettori di consegna di droga nano-scala, che sono stati utilizzati con successo per la consegna dei farmaci antitumorali. 4-7,11,12 tipici micelle polimeriche sono preparati da polimeri anfifilici attraverso un processo di auto-assemblaggio. Il core-shell strutturati micelle polimeriche includono un guscio idrofilo e un nucleo idrofobico. Il guscio idrofilo può stabilizzare stericamente micelle e prolungare la loro circolazione nel flusso sanguigno. Il nucleo idrofobico può incapsulare in modo efficace idrofoba dtappeti. A causa delle piccole dimensioni delle micelle (tipicamente inferiori a 200 nm) e proprietà di lunga circolazione, micelle polimeriche sono creduti per conseguire targeting tumorale attraverso una maggiore permeabilità ed effetti di ritenzione (EPR) (tumore passiva targeting).
la stabilità della droga di carico è fondamentale per il tumore mira capacità di micelle. Per ottenere il targeting tumorale ottimale, micelle dovrebbero avere perdite di droga minimo prima di raggiungere il sito del tumore, ma rilasciare rapidamente il farmaco dopo aver inserito le cellule tumorali. Inoltre, la stabilità formulazione è anche un requisito essenziale per lo sviluppo dei prodotti, perché la stabilità formulazione determina la fattibilità di sviluppo del prodotto, così come la shelf-life di prodotti sviluppati. Recentemente, sono stati fatti molti sforzi per migliorare il carico di droga in vettori di consegna. Il lipofila approccio pro-farmaco è una strategia che è stata esplorata per migliorare carico di droga in nanoparticelle lipidiche ed emulsioni. 13,14 La conjugation dei lipidi con farmaci in grado di migliorare significativamente la loro lipofilia e migliorare il carico e la conservazione delle componenti lipofile di nanovettori.
Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di lipofila doxorubicina pro-farmaco micelle caricati. In primo luogo, la procedura di sintesi per doxorubicina lipofila pro-farmaco è descritta. Poi, viene introdotto un protocollo per la generazione di micelle con un metodo film dispersione. Questo metodo è stato utilizzato con successo nei nostri studi precedenti. 5 DSPE-PEG è stato scelto come materiale di supporto per la preparazione di micelle perché è stato usato con successo per la consegna micelle farmaco. 15,16 Infine, si descrivono diversi saggi in vitro utilizzati per caratterizzare micelle formulazioni e per valutare l'attività antitumorale.
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Protocollo
1. Sintesi di DOX-PA
- Pesare 390 mg di doxorubicina e 243 mg di acido palmitico idrazide, e versare in un pallone a fondo tondo.
- Aggiungere 150 ml di metanolo anidro al pallone con una siringa di vetro. Aggiungere 39 ml di acido trifluoroacetico (TFA) con una pipetta. Utilizzando un agitatore magnetico, agitare la miscela di reazione per 18 ore a RT al buio.
NOTA: Le quantità di materiali di reazione possono essere scalati verso l'alto o verso il basso per ottenere diverse quantità di DOX-PA. Il rapporto dei reagenti dovrebbe essere mantenuto nelle stesse proporzioni. Reazioni che utilizzano quantitativi DOX nell'intervallo 78 mg a 1.170 mg possono essere eseguite in un laboratorio chimico regolare. - Purificazione di DOX-PA usando una colonna di gel di silice. 17
- Rimuovere il solvente nella miscela di reazione con un evaporatore rotante. Aggiungere 3 g di gel di silice dopo il volume della miscela si riduce a circa 20 ml. Continuare evaporatore ruotante per produrre polveri secche e permettere tegli adsorbimento di prodotti sul gel di silice. Mantenere il campione sotto vuoto per altri 30 minuti dopo si formano le polveri secche.
- Confezione 50 g di gel di silice in una colonna diclorometano come solvente. Aggiungere con cautela il campione di gel di silice contenente prodotto adsorbito alla colonna.
- Eluire la colonna con una miscela di diclorometano e metanolo, aumentando gradualmente la percentuale di metanolo, aumentando così la polarità del solvente (Tabella 1).
- Raccogliere frazioni di eluente in provette (25 ml / tubo) e monitorare i progressi mediante cromatografia su strato sottile (TLC).
- Combinare tutte le frazioni contenenti puro DOX-PA e rimuovere il solvente usando un evaporatore rotante fino alla formazione di polvere secca. Ulteriori essiccare il prodotto sotto vuoto O / N.
- Analisi di DOX-PA da TLC.
- Tagliare una sezione di quattro centimetri x 8 cm della piastra TLC. soluzioni campione Spot 0,5 cm dal fondo del piatto con TLC capillari avvistamento utilizzando soddisfatteHANOL come solvente.
- Porre la piastra TLC in una camera di sviluppo contenente una miscela di diclorometano e metanolo (3/1, v / v). La profondità del solvente deve essere appena inferiore a 0,5 cm.
- Rimuovere la placca dalla camera di sviluppo quando il fronte del solvente raggiunge la parte superiore della piastra. Segnare la posizione del fronte del solvente con una matita e lasciare la piastra si asciughi. Porre la piastra TLC in una camera di colorazione contenente saturo vapori di iodio per visualizzare campioni.
- Analisi di DOX-PA con 1 H-nucleare spettroscopia di risonanza magnetica (1 H-NMR). 18
- Sciogliere 15 mg di DOX-PA in 1 ml di metil solfossido-d6 (DMSO) e trasferire il campione in un tubo NMR.
- Inserire il tubo NMR nel magnete dello strumento NMR. Misurare lo spettro protonico, selezionando DMSO come solvente. Rimuovere il tubo NMR dal magnete. Analizzare il risultato NMR 18.
2. Preparazione di DOX-PA Le micelle con il metodo Film-dispersione
- Sciogliere DSPE-PEG (40 mg) e DOX-PA (4 mg) con 2 ml di metanolo in una fiala di vetro da 10 ml.
- Rimuovere il solvente organico sotto vuoto utilizzando un evaporatore rotante fino forma una sottile pellicola nel flacone.
NOTA: In alternativa, evaporare i solventi organici sotto gas inerte (per esempio, argon o azoto) per formare una pellicola e mantenere la fiala in un essiccatore a vuoto per rimuovere ulteriormente solvente residuo. - Trasferimento 2 ml di tampone fosfato di Dulbecco (pH 7,4, DPBS) nella fiala di vetro.
- Posizionare il flacone in un bagno ad ultrasuoni per 3 minuti a temperatura ambiente per generare micelle.
NOTA: il potere ad ultrasuoni varia tra i diversi modelli di bagni ad ultrasuoni. Selezionare un'unità in grado di generare energia sufficiente ad ultrasuoni per disperdere la sottile pellicola di polimero / farmaco. La potenza di uscita del bagno a ultrasuoni utilizzati in questo protocollo è di 110 W. - Mantenere micelle a 4 ° C per una conservazione a breve termine e -20 ° C a lungostoccaggio -term.
NOTA: In alternativa, le micelle possono anche essere liofilizzati e ricostituiti con acqua prima dell'uso. Di solito, non crioprotettore o lyoprotectant è necessario per questa formulazione.
3. Caratterizzazione di DOX-PA Le micelle
- Determinazione della concentrazione DOX-PA in micelle e l'efficienza di incapsulamento farmaco
- Sciogliere DOX-PA sintetizzato nelle precedenti fasi di DMSO per preparare le soluzioni DOX-PA di cinque diverse concentrazioni: 1 mg / ml, 5 mg / ml, 20 mg / ml, 50 mg / ml, e 100 mg / ml. Misurare l'assorbimento delle soluzioni DOX-PA con un UV-VIS spettrometro a 490 nm. Generare una curva standard in base alle concentrazioni di farmaco DOX-PA e il loro assorbimento corrispondente a 490 nm.
- Diluire 25 ml di micelle di droga-caricato con 500 ml di DMSO. Misurare l'assorbimento a 490 nm con uno spettrofotometro UV-VIS. Calcolare le concentrazioni di farmaco con la curva standard generata in 3.1.1.
- Calcolare efficienza incapsulamento utilizzando la seguente equazione:
Encapsulation Drug Efficienza (%) = (quantità di farmaci in micelle) / (quantità di farmaco aggiunto) × 100%
- Caratterizzazione della dimensione delle particelle con dispersione della luce dinamica (DLS)
- Diluire micelle con DPBS (pH 7,4) ad una concentrazione finale DSPE-PEG di 1 mg / ml. Analizzare un campione 2 ml con un analizzatore di dimensione delle particelle per ottenere le dimensioni e polidispersità indice Z-medio (PDI).
- Valutazione in vitro dell'attività antitumorale
NOTA: utilizzare appropriati tecnica sterile ed operare all'interno di un armadio biosicurezza.- Rimuovere il terreno di coltura cellulare da un pallone di coltura cellulare (ad esempio, T25) contenente DU-145 cellule cancerose della prostata umana e lavare le cellule con 2 ml di DPBS (pH 7,4).
- Aspirare DPBS, aggiungere 1 ml di soluzione di tripsina (0,25%), e incubare per 2 minuti a 37 ° C per staccare le cellule.
- Aggiungere 10 ml di terreno di coltura cellulare (RPMI 1640 + 10% siero fetale bovino + 1% Antibiotico-antimicotica), quando la maggior parte delle cellule si staccano dal pallone. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare le cellule a 1.000 xg per 5 min.
- Risospendere il pellet cellulare con 5 ml di mezzo di coltura cellulare e rimuovere un campione per contare il numero di cellule con un emocitometro. Diluire le cellule con mezzo di coltura cellulare ad una densità di 50.000 cellule / ml. Aggiungere sospensioni diluito di cellule in una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti (100 ul / pozzetto). Incubare le cellule in un incubatore di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO 2) per 18 ore per permettere l'adesione cellulare.
- Diluire DOX dimetilsolfossido soluzione (DMSO) e la soluzione DOX-PA DMSO con terreno di coltura cellulare per ottenere concentrazioni finali di droga di 0,1 mM, 0,5 mM, 2 mM, 5 mM e 10 mM, rispettivamente. Mantenere concentrazione DMSO finale in tutti i campioni superiori allo 0,5%. Diluire DOX-PA micelle con terreno di coltura cellulare per ottenere finale co di drogancentrations di 0,1 mM, 0,5 mM, 2 mM, 5 mM e 10 mM, rispettivamente. Utilizzare il mezzo di coltura cellulare in bianco un controllo.
- Rimuovere la piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti dal termostato e sostituire il mezzo di coltura cellulare con 100 ml di mezzo contenente diversi agenti di trattamento previste al punto 3.3.5 (n = 4 per ciascun gruppo). Incubare le cellule nella coltura cellulare incubatore (37 ° C, 5% CO 2) per un ulteriore 72 hr.
- Aspirare il mezzo e aggiungere 100 ml di mezzo contenente 0,5 mg / ml di 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT).
- Incubare le cellule in incubatore di coltura cellulare per ulteriori 2 ore. Rimuovere con attenzione il supporto e aggiungere 100 ml di DMSO per sciogliere i cristalli formazano.
- Misurare assorbanza con lo spettrofotometro per micropiastre alla lunghezza d'onda di 570 nm e una lunghezza d'onda di riferimento di 670 nm.
- Calcolare la vitalità cellulare utilizzando la seguente equazione:
vitalità cellulare (%) = (A Test / Un controllo) × 100%
NOTA: Confrontare la vitalità cellulare tra i diversi gruppi utilizzando una analisi della varianza ad una via (ANOVA) test statistico. Calcolare il IC50 sulla base di vitalità cellulare contro dati di concentrazione di droga.
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Risultati
La Figura 1 mostra lo schema di sintesi di DOX-PA. DOX-PA è stato sintetizzato dalla coniugazione di acido palmitico con doxorubicina attraverso un legame idrazone sensibile al pH. Un leggero eccesso di idrazide dell'acido palmitico è stato utilizzato per agevolare il completamento della reazione. Questo metodo di reazione ha un rendimento molto elevato e solo una piccola quantità di doxorubicina rimasto dopo una reazione 18 ore (Figura 2). La resa è...
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Discussione
In questo lavoro, si descrive un metodo pellicola dispersione rapida semplice per la preparazione di micelle. Questo metodo utilizza le proprietà auto-assemblaggio di un polimero amfifilico (ad esempio, DSPE-PEG) per formare core-shell micelle strutturati in un ambiente acquoso. Questo metodo di preparazione micelle ha diversi vantaggi. 1. Si tratta di un semplice processo di formulazione, che evita l'uso di fasi dimensioni riduzione complicate (come estrusione o omogeneizzazione) comunemente utilizzati nel...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni: sovvenzione NIH-SC3, sovvenzione NSF-PREM, sovvenzione per la ricerca della facoltà dell'Università di Hampton. Ringraziamo la signora Michele A. Cochran del Virginia Institute of Marine Science (VIMS) per l'uso dell'analizzatore granulometrico. Vorremmo anche ringraziare la signora Corinne R. Ramaley per aver esaminato il manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
| Doxorubicina | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
| Acido palmitico idrazide | TCI AMERICA | P000425G | >98,0% |
| organiche ACROS | metanolo | 610981000 | |
| cloruro di metilene anidro | FISHER | D151-4 | 99,90% |
| Metilsolfossido-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | NMR solvente |
| Acido trifluoroacetico | ACROS Organics | AC293811000 | 99,50% |
| gel di silice | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
| Baker Flex TLC Piastre | FISHER | ||
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DU 145 Cellule di cancro alla prostata | ATCC | HTB-81 | |
| MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
| RPMI 1640 Medium | MEDIATECH INC | 10041CV | |
| Antibiotico-Antimicotico | TECNOLOGIE PER LA VITA  | 15240062 | 100x soluzione madre |
| Siero fetale bovino | LIFE TECHNOLOGIES | ||
| Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare | Varian, Inc | 300 NMR | |
| Bü chi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Evaporatore rotante |
| Bagno ad ultrasuoni | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | ||
| spettrometro UV-VIS Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
| Zetasizer Nano ZS90 | con analizzatore di dimensioni delle particelle | Malvern Instruments | |
| Rio - Rad | Benchmark Plus | ||
| incubatore per colture cellulari | Napco | CO2 6000 | |
| cabina di sicurezza biologica | Nuaire | ||
| SigmaPlot | Software Systat, Inc. | Software analitico | |
| Piastra per colture cellulari a 96 pozzetti | Becton Dickinson | 353072 | |
| tripsina 0,25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |
Riferimenti
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