Co-cultura del vivere Microbiome con Microengineered umana intestinale Villi in un Gut-on-a-chip microfluidico dispositivo

Sommario

Descriviamo un protocollo in vitro di co-coltura budello microbiome e villi intestinali per un periodo prolungato utilizzando un sistema umano intestino-on-a-chip microphysiological.

Abstract

Qui, descriviamo un protocollo per eseguire a lungo termine co-coltura di multi-specie intestino microbioma umano con villi intestinali microengineered in un dispositivo umano gut-on-a-chip microphysiological. Noi ricapitolare i intestinale interfaccia di tessuto lume-capillare in un dispositivo di microfluidica, dove deformazioni meccaniche fisiologiche e flusso di taglio fluido sono costantemente applicati per imitare la peristalsi. Nel microcanali lume, epiteliali intestinali Caco-2 cellule umane sono coltivate in modo da formare un epitelio villi 'germ-free' e rigenerare piccoli villi intestinali. cellule microbiche pre-coltivate vengono inoculati nel lato lume di stabilire un ecosistema host-microbo. Dopo che le cellule microbiche aderiscono alla superficie apicale dei villi, flusso di fluido e deformazioni meccaniche sono ripresi per produrre un microambiente stato stazionario in cui terreno fresco viene costantemente alimentato e batteri non legato (nonché scarti batteriche) sono continuamente rimossi. Dopo estesa co-coltura fgiorni o settimane rom, più microcolonie sono trovati per essere collocata in modo casuale tra i villi, ed entrambi microbica e cellule epiteliali rimangono vitali e funzionale per almeno una settimana in coltura. Il nostro protocollo co-coltura può essere adattato a fornire una piattaforma versatile per altri ecosistemi ospitanti-microbiome che si possono trovare in vari organi umani, che potrebbe agevolare studio in vitro del ruolo del microbioma umano nell'orchestrare la salute e la malattia.

Introduzione

L'intestino umano ospita una gamma incredibilmente diversificata di specie microbiche (<1.000 specie) e un numero enorme di cellule microbiche (10 volte di più rispetto alle cellule ospiti umane) e geni (100 volte più del genoma umano) ^1. Questi microbiomes umane giocano un ruolo chiave nel metabolismo di sostanze nutritive e xenobiotici, che regola le risposte immunitarie, e mantenere l'omeostasi intestinale ^2. Non sorprende che, date queste diverse funzioni, l'intestino microbiome commensale modula ampiamente salute e la malattia ^3. Così, la comprensione del ruolo del budello microbioma e host-microbo interazioni sono di....

Protocollo

1. Microfabbricazione di un dispositivo Gut-on-a-chip

Nota: L'intestino-on-a-chip è un dispositivo microfluidico fatta da, polimero siliconico gas-permeabile trasparente (polidimetilsilossano, PDMS), contenente due microcanali paralleli (1 mm larghezza lunghezza x 150 micron di altezza x 1 cm) separati da un flessibile poroso (10 micron di diametro dei pori, 25 micron di pori spaziatura a pori) PDMS membrana ^5,9. Realizzare il (Figura 1A, a sinistra) gut-on-a-chip seguendo le istruzioni fornite.

1. Microfabbricazione interno del ^5,9 Gut-on-a-chip.
   1. Preparare non essiccate, PDMS de....

Risultati

Per emulare il intestinale ecosistema host-microbioma umano in vitro, è necessarie per sviluppare un protocollo sperimentale per ricostituire la stabilità a lungo termine co-coltura di batteri intestinali e le cellule epiteliali intestinali umane in condizioni fisiologiche come la meccanica peristalsi-simili e flusso del fluido. Qui, utilizziamo un biomimetico Microdevice gut-on-a-chip (Figura 1A) per co-coltura cellule microbiche a diretto.......

Discussione

Capire interazioni ospite-microbiome è fondamentale per far progredire la medicina; tuttavia, tradizionali modelli di coltura cellulare eseguiti in un piatto di plastica o di una piastra ben statica non supportano la stalla co-coltura di cellule intestinali umane con microbi intestinali vivere per più di 1-2 giorni, perché le cellule microbiche soprattutto invadere le cellule di mammifero in vitro. La popolazione microbica overgrowing consuma rapidamente ossigeno e sostanze nutritive, in seguito la produzione d.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente 25 mM di glucosio e 25 mM di HEPES	Gibco	10564-011	Riscaldalo a 37 ° C a bagnomaria.
Difco Lactobacilli MRS brodo	BD	288120	Eseguire l'autoclave a 121 gradi C per 15 min.
Poli(dimetilsilossano)	Dow Corning	3097358-1004	15:1 (w/w), PDMS: agente curante
Caco-2BBE linea di carcinoma colorettale umano	Harvard Digestive Disease Center		Adenocarcinoma colorettale umano
FBS	Gibco	10082-147	20% (v/v) inattivato a caldo in DMEM
Penicillina-streptomicina-glutammina	Gibco	10378-016	Diluizione 1/100 in DMEM
4′,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato	Sonde molecolari	D1306	Colorazione dei nuclei
Coniugato falloidina-CF647 (25 unità/ml)	Colorazione
Sistema di tensione Flexcell FX-5000	Flexcell International Corporation	FX5K	Movimento di stretcing simile alla peristalsi (10% di deformazione cellulare, frequenza 0,15 Hz)
Microscopio a epifluorescenza invertita	Zeiss	Axio Observer Z1	Imaging, DIC
Microscopio confocale a scansione	Leica	DMI6000	Imaging, Fluorescence
UVO Cleaner	Jelight Company Inc	342	Attivazione superficiale del collagene di
tipo I	Gibco	A10483-01	Componente della matrice extracellulare per la coltura cellulare nel chip
Matrigel	BD	354234	Componente della matrice extracellulare per la coltura cellulare nel chip
Siringa monouso da 1 ml	BD	309628	Iniettore di cellule e terreni
25 G 5/8 ago	BD	329651	Iniettore di cellule e terreni
Pompa a siringa	Braintree Scientific Inc.	BS-8000	Attrezzatura per l'iniezione nel chip
VSL#3	Sigma-Tau Pharmaceuticals	7-45749-01782-6	Una formulazione di 8 diversi microbi intestinali commensali
Mezzo clostridiale rinforzato	BD	218081	Terreno di coltura batterica anaerobica
GasPak EZ Sistema di contenitori anaerobi con indicatore	BD	260001	Bustina per la generazione di gas anaerobico...
Microscopia elettronica	4% di paraformaldeide	157-4-100	Fissaggio delle cellule per la colorazione
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Permeabilizzazione delle cellule
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A7030	Agente bloccante per la colorazione delle cellule
Trattamento	Electro-Technic Products	BD-20AC	Generatore di plasma per la fabbricazione del chip
Steriflip	Millipore	SE1M003M00	Degasaggio dell'intero terreno di coltura
Emocitometro monouso	iNCYTO	DHC-N01	Per la conta manuale delle cellule

con F-actina Biotium 00041 al Scienza corona