Questo protocollo fornisce linee guida passo dopo passo per l'impostazione di esperimenti competitivi di trapianto di midollo osseo di topo per studiare la funzione delle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche senza previa purificazione delle cellule staminali mediante selezione cellulare.
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Articolo metodologico
Trapianti competitivi per valutare staminali ematopoietiche cellule Fitness
In questo articolo
Sommario
Abstract
La definizione gold standard di una cellula staminale ematopoietica (HSC) è una cellula che, una volta trasferita in un ricevente irradiato, avrà la capacità di ristabilire la produzione di cellule del sangue per tutta la durata della vita del ricevente. Questo protocollo spiega come impostare un test funzionale per confrontare le capacità HSC di due diverse popolazioni di cellule, come il midollo osseo di topi di due diversi genotipi, e come analizzare i topi riceventi mediante citometria a flusso. Il protocollo utilizza gli equivalenti HSC piuttosto che la selezione cellulare per la standardizzazione e discute i vantaggi e gli svantaggi di entrambi gli approcci. Discutiamo inoltre diverse varianti del protocollo di base, tra cui trapianti seriali, saggi di diluizione limitante, saggi di homing e trapianti non competitivi, compresi i vantaggi e gli usi preferiti di questi vari approcci. Questi saggi sono fondamentali per lo studio della funzione delle HSC e potrebbero essere utilizzati non solo per lo studio degli aspetti fondamentali della biologia delle HSC, ma anche per lo sviluppo di saggi preclinici per il trapianto di midollo osseo e l'espansione delle HSC in coltura.
Introduzione
Emopoiesi è un processo rigenerativo che assicura il rifornimento di cellule del sangue che sono state perse per infortunio, le radiazioni e la morte cellulare. Questo processo è garantita da cellule staminali ematopoietiche (HSC) che in gran parte si trovano nel midollo osseo. Inoltre, le cellule staminali ematopoietiche possono essere utilizzate a scopo terapeutico in malattie autoimmuni, neoplasie ematologiche e immunodeficienze 1. Vi è quindi la necessità di comprendere meglio i meccanismi che regolano la funzione HSC, tra cui la loro espansione proliferativa e la loro capacità di raggiungere e innestare il destinatario di midollo osseo dopo il trapianto. Anche se recenti studi hanno riportato diversi marcatori di superficie delle cellule, inclusi i membri della famiglia SLAM CD150 e CD48, per arricchire in modo prospettico CSE adulte e cellule staminali emopoietiche fetali di circa il 50% di purezza 2-4, la misura standard di riferimento per le CSE funzionale rimane un test in vivo ripopolamento a determinare la loro capacità di ristabilire sangue cproduzione ell in un host irradiato 5.
Il saggio ripopolamento clonale in vivo è stato inizialmente sviluppato da Till e McCulloch 6 e da allora è stata perfezionata e ampliata. Come originariamente definito, CSE garantire la produzione di globuli permanente attraverso l'auto-rinnovamento e la differenziazione. Il trasferimento di CSE in un destinatario irradiato permette quindi di valutare: la loro capacità di differenziare attraverso l'analisi delle diverse linee cellulari del sangue (linfociti T, linfociti B, granulociti, monociti) e la loro capacità di auto-rinnovamento attraverso il trapianto seriale. Il dosaggio di solito comporta il confronto della funzionalità e / o la quantità di due popolazioni di CSE, ad esempio, le cellule provenienti da due topi di differenti genotipi o cellule che sono state trattate o non trattate con differenti fattori che possono influenzare il mantenimento o l'espansione di CSE nella cultura. Donatore chimerismo, o il contributo di donatore di CSE trasferito to la produzione di globuli può quindi essere determinata mediante citometria di flusso analisi nel sangue periferico e nel midollo osseo utilizzando marcatori di superficie delle cellule o altri metodi che distinguerà cellule del donatore da parte del destinatario, o host. I marcatori più usati sono certamente i due alleli per il gene CD45 Ptprc o leucociti antigene 7 che abbiamo scelto per gli esempi forniti di seguito.
Il saggio ripopolamento clonale può essere competitivo o non competitiva. In un ambiente non competitivo, controllo e test CSE vengono trasferite in topi riceventi separati e il risultato per ogni tipo di cellula sarà indipendente dall'altro. In un ambiente competitivo, la funzione sia di prova e di controllo CSE è misurata contro una popolazione di concorrente CSE. Il protocollo qui descritto utilizza l'impostazione competitiva, ma può anche essere adattato per situazioni non competitivi. Entrambi gli approcci hanno i loro vantaggi e limitazioni, e li confronta in dettaglio neldiscussione. Abbiamo anche descrivere diversi approcci per garantire l'equità del numero di trapiantati CSE, è descritto come adattare il dosaggio per la quantificazione delle cellule staminali emopoietiche limitando test di diluizione (LDA), e fornire esempi di entrambi i trapianti di successo e insuccesso per l'interpretazione dei risultati.
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Protocollo
Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono stati approvati dal comitato etico degli animali istituzionale e seguire il Consiglio canadese sulle linee guida per la cura degli animali.
Nota: Per mantenere specifiche condizioni abitative sterili / esenti da organismi patogeni, di svolgere tutte le procedure che coinvolgono la gestione diretta di topi vivi all'interno di un armadio di sicurezza biologica o una cappa a flusso laminare. Pulire o sterilizzare gabbie, dispositivi di ritenuta, i materiali abitative, chow e acqua fornita agli animali in modo appropriato. Utilizzare aghi solo sterili, monouso per le iniezioni e per prelievi di sangue. tecnica asettica è di fondamentale importanza durante la preparazione del trapianto.
1. Preparazione di topi riceventi
- Identificare topi riceventi con tacche per le orecchie (o altro metodo approvato dal comitato etico locale animali 8) per consentire individuale follow-up di sangue e del midollo osseo periferico ricostituzione nel corso del tempo. Pesare i topi per la post-trapianto di follow-up. Noitopi riceventi e che sono tra i 7 e 12 settimane di età (meno di 25 g).
Nota: Nell'esempio fornito, topi riceventi CD45.1 + CD45.2 + sono stati allevati in casa attraversando C57Bl / 6 topi con topi B6.SJL congenic. - Irradiare topi riceventi con due dosi di 450 rad per distruggere l'attività ematopoietiche. Dare la prima dose il giorno prima del trapianto e la seconda 1-2 ore prima del trapianto.
Nota: i raggi X o raggi gamma possono essere entrambi utilizzati a seconda della disponibilità di strutture adeguate.
2. Preparazione di donatori e concorrente cellule del midollo osseo
- Euthanize donatore (prova e di controllo; CD45.2 +) e concorrente (CD45.1 +; B6.SJL) topi da CO 2 asfissia seguita da dislocazione cervicale o utilizzando metodi approvati dal comitato etico degli animali locale.
- Mettere i topi sulla schiena, le gambe spalancate, in una capsula di Petri vuota o su una garza sterile (per mantenere la superficie di lavoro pulita) iabitacolo di una cappa di sicurezza biologica. Bagnare la pelle e pelliccia con il 70% di etanolo / 30% H 2 O (v / v).
- Tagliare il piede con una lama chirurgica o forbici affilate. Tagliare aprire la pelle lungo la gamba e tirare via la pelle con pinze dentellate. Tagliare il muscolo in eccesso.
- Dislocare femore tirando l'osso della gamba e l'utilizzo di lame delle forbici contro le ossa pelviche come una forza contatore. Staccare tibia e femore dalla rotula e rimuovere i rimanenti pezzi di muscoli e tendini. Mettere le ossa in 2-3 ml di sterile tampone fosfato salino (PBS) in una piastra di coltura tissutale 6-bene.
- Raccogliere le cellule del midollo osseo da vampate di calore le ossa con 5 ml di PBS sterile.
- Tenere l'osso delicatamente con una pinza e inserire un ago 25 G attaccato ad una siringa riempita 1 ml di una estremità dell'osso. Premere il pistone e raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml. Ripetere se necessario fino al centro dell'osso è bianco.
- Dissociare le cellule ripetuti passando attraverso l'ago perottenere una sospensione di cellule singole. Evitare di bolle e la forza in eccesso. Nota: utilizzare un ago leggermente più grande (22 G) per migliorare la vitalità cellulare in questa fase.
- Passare le cellule attraverso un colino in nylon 70 micron per garantire sospensione cellulare uniforme e per rimuovere i detriti e grumi.
- Rimuovere una aliquota per il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro. Centrifugare la sospensione cellulare restante a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C. Regolare densità cellulare come richiesto in PBS sterile (10 8 cellule / ml). Mantenere le cellule in ghiaccio.
3. Stabilire donatore di cellule HSC equivalenti
- Trasferire l'equivalente di 3 x 10 6 celle (30 ml) in un 5 ml rotonde provetta di polistirene di fondo per citometria a flusso colorazione. Aggiungere un volume uguale di anticorpo marcato contro CD16 / CD32 per bloccare colorazione non specifica (diluito in tampone colorazione (PBS integrato con 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) e 1 mM EDTA) per una concentrazione finale di 2,5 mg / ml). Incubare 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 90 ml master mix anticorpi coniugati a fluorocromi preparato in tampone colorazione: cocktail di Lineage biotinilato (B220, CD3e, CD11b, GR1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150. Incubare in ghiaccio per 30 minuti, al riparo dalla luce.
Nota: diluizioni adeguate dovrebbero essere determinati per ciascun lotto di anticorpi. Vedere la Tabella dei Materiali per diluizioni utilizzati in questo studio. - Aggiungere 2 ml di tampone colorazione alle cellule, vortex e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C per rimuovere l'anticorpo non legato. Decantare il surnatante e risospendere pellet muovendo.
- Aggiungere 10 ml streptavidina coniugato a un fluorocromo diluito in buffer di colorazione (vedi Materiali Tavolo). Incubare in ghiaccio per 20 minuti, al riparo dalla luce. Lavare come al punto 3.3 per rimuovere streptavidina non legato.
- Acquisire i campioni di cellule utilizzando un citofluorimetro con almeno sei rilevatori 9. Determinare la frequenza di Lin - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 + cellule (stimato CSE) in ogni campione utilizzando il modello di analisi mostrati in figura 2 e come precedentemente riportato 10,11.
Nota: La frequenza delle cellule staminali emopoietiche funzionali all'interno di quella popolazione può essere stimato tra 1/3 e 1/5 2,12. - Stabilire equivalenti HSC stimati per tutti i campioni 11, utilizzando un campione (tipicamente, il concorrente, B6.SJL CD45.1 + in questo esempio) come linea di base come descritto di seguito e nella figura 2.
- Calcolare il numero di cellule necessarie utilizzando le seguenti formule:
#transplanted CSE / destinatario = 5 x 10 5 cellule x frequenza HSC stimato (come determinato per il campione di riferimento, questo numero è di solito tra il 75 e il 125 per tipo selvatico C57Bl 6 topi /) 10-12.
Nota: In figura 2, per il campione A, il risultato è 139 CSE.
# trapiantato cellule totali (per altri campioni; es campione B in figura 2) = # transFrequenza di CSE / HSC piantato.
Nota: In figura 2, per il campione B, il risultato è 197.826 (o circa 2 x 10 5) cellule totali del midollo osseo.
- Calcolare il numero di cellule necessarie utilizzando le seguenti formule:
- Calcolare il numero totale di cellule necessarie per destinatario trapianto per ogni campione utilizzando i risultati ottenuti in precedenza.
Nota: Questo numero dovrebbe essere di 5 x 10 5 per il campione di riferimento (concorrente).- Moltiplicare il numero ottenuto dalla fase 3.7 per il numero di topi riceventi e aggiungere abbastanza cellule per almeno due topi supplementari per compensare il volume morto nella siringa.
- Mescolare concorrente (ad esempio, CD45.1 +) e celle di prova (CD45.2 +) in rapporto 1: 1 equivalente HSC come calcolato al punto 3.6 e regolare il volume finale di 200 ml per iniezione utilizzando PBS sterile.
Nota: Per un gruppo di cinque topi riceventi il volume suggerito sarebbe quindi almeno 1.4 ml, contenente 3,5 x 10 cellule midollari 6 concorrenti (o973 CSE stimati per il campione A in figura 2), e il numero equivalente di celle di prova (in figura 2, l'equivalente per il campione B sarebbero 197.826 x 7 = 1,384,782 cellule del midollo osseo).
4. trapianti di midollo osseo
- Riscaldare i topi riceventi irradiati in fase di 1.2 con una lampada di calore rosso per garantire la dilatazione dei vasi sanguigni e di fare la coda laterale vene più visibile.
- Preparare una tubercolina siringa da 1 ml dotata di un ago G 27 (o inferiore). Aspirare circa 750 ml di sospensione cellulare preparato (per topi riceventi 3). Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella siringa.
- Inserire il mouse in un dispositivo di ritenuta. Esaminate la coda e cercare le vene coda laterali che dovrebbero essere chiaramente visibili da entrambi i lati della coda. Pulire il sito di iniezione con etanolo. Inserire l'ago smussare up, parallelamente alla pelle e premere delicatamente lo stantuffo. L'iniezione deve essere facile. Se la forza è reRICHIESTO, l'ago non è in vena.
Nota: i topi anziani hanno la pelle più spessa, che può rendere trovare la vena più difficile. Se l'ago non è in vena, reinserire prossimale dell'ago al sito di iniezione iniziale. - Rimuovere l'ago e premere il sito di iniezione con una garza sterile per alcuni secondi per fermare l'emorragia. Trasferire il mouse in una gabbia pulita.
Nota: utilizzare la stessa siringa e l'ago per tre iniezioni, dopo di che l'ago potrebbe diventare troppo noioso. - Per post-trapianto di follow-up, iniettare 1 ml di PBS sterile per via sottocutanea per reidratare i topi per i primi cinque giorni. Aggiungere antibiotici nell'acqua potabile per prevenire le infezioni (se richiesto; opzionale). Pesare topi ogni due o tre giorni per le prime tre settimane e euthanize topi che hanno perso più del 15-20% del loro peso corporeo pre-trapianto (o come determinato dal comitato etico degli animali locale).
5. Analisi del sangue periferico
- Raccogliere una goccia di sangue (unpprox. 50-100 ml) in provette EDTA.
- Per raccogliere il sangue dalla vena mandibolare, usare una lancetta o un ago 22 G per forare la pelle del viso vicino al punto senza pelo si trova sotto la mandibola e posizionare il tubo di raccolta per ricevere la goccia di sangue 13. Prelevare il sangue a 4, 8, 12 e 16 settimane dopo il trapianto di seguire multi-lignaggio ricostituzione.
- Aggiungere 1 ml appena preparato RT buffer di lisi dei globuli rossi (9 parti 0,16 M NH 4 Cl + 1 parte di 0,17 M Tris-HCl pH 7,65) alla goccia di sangue raccolto nella fase 5.1.1. Mescolare e campione di trasferirli in una provetta di polistirene da 5 ml a fondo rotondo adatto per citometria a flusso. Lasciate riposare per 4 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 4 volumi di PBS ghiacciato. Mescolare ruotando end-to-end e trasferire immediatamente in ghiaccio. Centrifugare 10 min a 200 xg a 4 ° C.
- Decantare il surnatante e risospendere pellet muovendo. Surnatante deve essere chiaro e rosso. Aggiungere 2 ml di colorazione tampone e vortex brevemente. Centrifugare 5 min a 200 XGAt 4 ° C.
- Decantare il surnatante e risospendere pellet muovendo.
- Procedere con citometria a flusso colorazione utilizzando il protocollo generale descritto nei passaggi da 3.1 a 3.3 e seguenti anticorpi per il master mix: CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1.
- Acquisire i campioni di cellule utilizzando un citofluorimetro con almeno sei rilevatori 9. Determinare la frequenza di cellule del donatore-derivato per ogni lignaggio (linfociti CD19 + B, linfociti T CD3e, GR1 granulociti luminosi) in ogni campione utilizzando il modello di analisi fornito in figura 3 e come pubblicato 10,11.
6. Analisi del midollo osseo Ricostituzione
- Raccogliere cellule del midollo osseo come descritto nella sezione 2. Stain le cellule per l'analisi di citometria a flusso utilizzando il protocollo generale descritto nei passaggi da 3.1 a 3.3 e seguenti anticorpi per il master mix: Lineage cocktail, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. Rileva linanticorpi cocktail EAGE utilizzando streptavidina coniugato a un fluorocromo come descritto al punto 3.4.
- Acquisire campioni di cellule utilizzando un citofluorimetro con almeno otto rilevatori 9. Se solo sei sono disponibili, aggiungere CD135 sullo stesso canale come pannello lignaggio come verranno esclusi cellule CD135 +. Determinare la frequenza di Lin donatore-derivati - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 + cellule staminali emopoietiche in ogni campione utilizzando il modello di analisi fornito nella figura 4 e come pubblicato 10.
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Risultati
Una descrizione generale della trapiantati competitivo, compresi i trapianti secondari (discussi più avanti) può essere trovato in Figura 1. Un'analisi rappresentativo per pre-trapianto di midollo osseo CSE può essere trovato in figura 2. Informazioni più dettagliate sulla esclusione di doppietti e le cellule morte possono essere trovati altrove 9.
Figure 3 e
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Discussione
Il protocollo qui descritto è stato progettato per valutare l'idoneità relativa del donatore (test) HSC contro concorrente noto CSE. La situazione di concorrenza aumenta la sensibilità relativa del test (più probabile per rilevare diminuzioni modeste palestra cellule staminali) e fornisce un controllo tecnico interno per l'efficacia di irradiazione e iniezione. Tuttavia, non dovrebbe essere usato come una misura assoluta di HTS fitness; una diminuzione della ricostituzione competitivo non significa automaticamen...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Siamo grati a Roxann Hétu-Arbour per l'assistenza con il disegno figura e dimostrazione delle procedure. La ricerca in laboratorio è stato sostenuto da un premio di transizione dalla Fondazione Cole, Discovery concedere alcuna. 419226-2012 dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC) e il Canada Foundation for Innovation (leader CFI Fondo concedere n. 31377). KMH è una Junior Chercheur-Boursier per il Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette Microtainer con K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | |
| ago da 20 G | Siringa | Per il prelievo di sangue dalla vena mandibolare | |
| LabQuake Shaker girarrosto | Thermo Scientific | C415110 | |
| Purificato anti-topo CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 μ g/ml |
| Pe-Cy7-coniugato anti-topo CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0.25 μ g/ml |
| PE-coniugato anti-topo CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0.25 μ g/ml |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalente)-coniugato anti-topo GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0.25 μ g/ml |
| FITC-coniugato anti-topo CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μ g/ml |
| eFluor450-coniugato anti-topo CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 48-0454 | 1.00 μ g/ml |
| Biotinilato anti-umano/topo CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1.25 μ g/ml |
| CD3e biotinilato anti-topo (clone 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1.25 μ g/ml |
| CD11b biotinilato anti-topo (clone M1/70) | eBioscience | 13-0112 | 1.25 μ g/ml |
| Anti-topo biotinilato GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1.25 μ g/ml |
| Biotinilato anti-topo TER119 (clone TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0.625 μ g/ml |
| V500 streptavidina | BD Biosciences | 56149 | 0,5 μ g/ml |
| PE-coniugato anti-topo CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 553355 | 0,25 μ g/ml |
| PE-Cy7-coniugato anti-topo Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 558162 | 0,25 μ g/ml |
| PerCP-eFluor710-coniugato anti-topo CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0.5 μ g/ml |
| Alexa fluor 647-coniugato anti-topo CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0.625 μ g/ml BD Biosciences ed eBioscience non portano lo stesso clone |
| Siringa da 1 ml di tubercolina con ago da 27 G | Siringa BD 309623 | ||
| Siringa da 1 ml di tubercolina con ago da 25 G | Siringa BD | 309626 | |
| 70 μ filtro per cellule m | BD Falcon | 352350 |
Riferimenti
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