Questo protocollo descrive l'uso di tre diversi metodi per analizzare la proliferazione cellulare nelle linee cellulari di cancro al seno. Ciò include l'uso del conteggio cellulare convenzionale, la vitalità cellulare basata sulla luminescenza e il conteggio cellulare attraverso l'uso di un imager cellulare. Ognuno di essi offre vantaggi per la misurazione riproducibile della proliferazione cellulare.
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Articolo metodologico
Confronto di tre diversi metodi per la determinazione proliferazione cellulare in Breast Cancer linee cellulari
In questo articolo
Sommario
Abstract
La misurazione della proliferazione cellulare può essere eseguita con una serie di metodi diversi, ciascuno con diversi livelli di sensibilità, riproducibilità e compatibilità con la formattazione ad alto rendimento. Questo protocollo descrive l'uso di tre diversi metodi per misurare la proliferazione cellulare in vitro, tra cui la camera di conteggio dell'emocitometro convenzionale, un test basato sulla luminescenza che utilizza la variazione dell'attività metabolica di cellule vitali come misura del numero relativo di cellule e un imager cellulare multimodale che misura il numero di cellule utilizzando un algoritmo di conteggio. Ogni metodo presenta i propri vantaggi e svantaggi per la misurazione della proliferazione cellulare, tra cui tempo, costi e compatibilità ad alto rendimento. Questo protocollo dimostra che ogni metodo è in grado di misurare con precisione la proliferazione cellulare nel tempo ed è sensibile nel rilevare la crescita a diverse densità cellulari. Inoltre, la misurazione della proliferazione cellulare utilizzando un imager cellulare è stata in grado di fornire ulteriori informazioni come la morfologia, la confluenza e ha consentito un monitoraggio continuo della proliferazione cellulare nel tempo. In conclusione, ogni metodo è in grado di misurare la proliferazione cellulare, ma il metodo scelto dipende dall'utente.
Introduzione
Il gene soppressore del tumore, p53, è un regolatore essenziale di un certo numero di processi cellulari, tra cui l'arresto del ciclo cellulare, apoptosi e senescenza 1. E 'responsabile del mantenimento della stabilità genomica, ed è quindi fondamentale per mantenere l'equilibrio di morte cellulare e la crescita delle cellule. Le mutazioni nel p53 sono comuni nel cancro e sono la principale causa di p53 l'inattivazione porta al cancro incontrollata proliferazione cellulare 2. È interessante notare che mutazioni in p53 rappresentano solo circa il 25% dei tumori al seno 3, suggerendo che altri meccanismi sono responsabil....
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Protocollo
1. Le cellule Preparazione per la proliferazione Assays
Nota: Preparare due linee cellulari nello stesso modo e sementi nello stesso formato per ciascun metodo da analizzare.
- Grow MCF-7-Lego e MCF-7-Δ40p53 7 celle al 75-80% di confluenza nel T 75 cm 2 di tessuto fiasche di coltura usando fenolo-rosso libero di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) , 200 mM L-glutammina, 2 ug / ml di insulina e 1 mg / ml puromicina a 37 ° C con 5% di CO 2. Maneggiare le celle di una sicurezza biologica sterile armadietto di classe II.
Nota: La quantità di ....
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Risultati
Per studiare diversi metodi di misura della proliferazione delle cellule in coltura, la proliferazione delle cellule di MCF-7-Δ40p53 cellule trasdotte stata confrontata alla non trasdotte MCF-7-Lego linea cellulare di tumore al seno. I tre metodi che sono stati confrontati - il metodo di imaging emocitometro convenzionale, test di luminescenza vitalità cellulare, e la cella analisi-sono illustrate nel diagramma schematico (figura 1). Ogni metodo presenta vantaggi e svant.......
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Discussione
In questo protocollo sono state esaminate tre diversi metodi di misurazione proliferazione delle cellule in cellule in coltura. Ogni metodo era capace di misurazioni riproducibili e precise di proliferazione cellulare su 96 ore, ei risultati erano confrontabili tra ciascuno dei metodi testati (Figura 2 e 3). Sia il test di luminescenza-based e metodo di imaging cellulare prodotto i risultati più robusti, mostrando incremento lineare nella proliferazione cellulare dopo 96 ore (Figura 2b,.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dott. Hamish Campbell e il Prof. Antony Braithwaite per il loro aiuto nello sviluppo delle linee cellulari trasdotte MCF-7-LeGO. Vorremmo riconoscere il nostro sostegno finanziario da parte della Bloomfield Group Foundation attraverso l'Hunter Medical Research Institute. BCM è supportato da una borsa di studio APA attraverso l'Università di Newcastle e dalla borsa di studio MM Sawyer attraverso l'Hunter Medical Research Institute.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, senza rosso fenolo | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Integrato con il 10% di FBS, 200 mM di L-glutammina, 2 & micro; g/ml di insulina e 1 µ g/ml di puromicina |
| L-glutammina soluzione (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Soluzione di insulina umana | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromicina dicloridrato | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0,5% soluzione di tripsina-EDTA (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Diluire a 2x in DPBS |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Pallone per coltura tissutale, 75 cm2 area di crescita | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 | Merck Millipore | Contatore cellulare automatizzato | |
| multipozzetto a 96 pozzetti, | |||
| BOECO Germany | BOE 01 | ||
| Olympus IX51 microscopio invertito | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Saggio basato sulla luminescenza |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate Reader per luminescenza, fluorescenza e imaging cellulare in campo chiaro | |
| Software di analisi dati Gen5 | BioTek | GEN5 |
Riferimenti
- Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
- Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008(2010).
- ....
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Ristampe e permessi
