Preparazione e applicazioni di colture organotipiche timica Slice

Sommario

Descriviamo la preparazione di fette timici che, in combinazione con la citometria di flusso, possono essere utilizzate per modellare selezione positiva e negativa di sviluppare cellule T. Fette timo possono anche essere adattati per l'analisi in situ della migrazione thymocyte, localizzazione, e la segnalazione tramite immunofluorescenza e microscopia a due fotoni.

Abstract

Timici procede selezione in un microambiente timico unico e altamente organizzata conseguente generazione di un auto-tolerant repertorio cellule T funzionali. Modelli in vitro per lo studio T lineage impegno e sviluppo hanno fornito informazioni preziose questo processo. Tuttavia, questi sistemi hanno la completa ambiente timica tridimensionale necessario per lo sviluppo delle cellule T e, quindi, sono approssimazioni incompleti di selezione timica in vivo. Alcune delle sfide legate allo sviluppo delle cellule T modellazione possono essere superate usando in modelli in situ che forniscono un microambiente del timo intatto che supporta pienamente la selezione timica di sviluppare cellule T. Timo culture fetta organotipica completano esistenti nelle tecniche in situ. fette timo preservare l'integrità delle regioni corticali e midollari del timo e forniscono una piattaforma per studiare lo sviluppo dei timociti sovrapposti di una fase di sviluppo definito o di endogena T cells all'interno di un microambiente del timo maturo. Data la capacità di generare ~ 20 fette al mouse, fette del timo presentano un vantaggio unico in termini di scalabilità per gli esperimenti ad alto rendimento. Inoltre, la relativa facilità nel generare le fette del timo e potenzialmente in grado di sovrapporre diversi sottoinsiemi del timo o altre popolazioni di cellule provenienti da diversi background genetici aumenta la versatilità di questo metodo. Qui si descrive un protocollo per la preparazione di fette del timo, l'isolamento e la sovrapposizione dei timociti, e la dissociazione di fette del timo per l'analisi di citometria di flusso. Questo sistema può anche essere adattato per studiare lo sviluppo delle cellule T non convenzionale e visualizzarne migrazione timociti, interazioni cellula-timociti stromali, e segnali TCR associati selezione timica mediante microscopia a due fotoni.

Introduzione

Cellule T differenziano attraverso una serie di intermedi di sviluppo nel timo durante i quali incontrano diversi controlli che assicurano la generazione di un funzionali, self-tolerant repertorio cellule T ^1-3. Selezione positiva favorisce la sopravvivenza dei timociti con i recettori delle cellule T (TCR) in grado di riconoscere, con una bassa a moderata affinità, peptide presentati da grandi molecole complesse di istocompatibilità (MHC) sulle cellule epiteliali del timo corticali (CTEC) ^2,3. Selezione negativa e lo sviluppo delle cellule T regolatorie (T _reg) contribuiscono alla creazione di auto-tolleranza attraverso l'elimina....

Protocollo

I protocolli per tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato di cura degli animali presso il Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.

1. La raccolta del mouse Thymus per la preparazione di del timo fette e sospensioni singola cella

1. Euthanize il mouse con CO ₂ seguita da dislocazione cervicale.
2. In una cappa a flusso laminare, pin lato ventrale del mouse fino ad una tavola di dissezione. Spruzzare il mouse con il 70% di etanolo. Rimuovere l'eventuale eccesso di alcol tamponando con una garza per evitare che l'etanolo di entrare nella cavità toracica e danneggiare il tessuto.
3. Sollev....

Risultati

Timica analisi supporto fette di diversi aspetti dello sviluppo delle cellule T come la selezione positiva e negativa. Per gli esperimenti di successo, la qualità della fetta timica è fondamentale. Così, fette timici dovrebbero essere esaminati per garantire l'integrità del tessuto timico e che l'agarosio che circonda la fetta timica è intatto (Figura 1A). La tensione superficiale può essere compromessa quando l'agarosio è danneggiato causa.......

Discussione

Qui si descrive un protocollo per la preparazione di fette del timo e risultati rappresentativi di selezione positiva e negativa efficiente di sovrapposizione di preselezione MHC di classe I-limitato TCR timociti transgeniche di citometria a flusso. Questo sistema è stato utilizzato con successo simile per supportare selezione positiva di cellule MHC di classe II-ristrette T CD4 ⁺ di preselezione timociti DP ^32, e, in presenza di agonisti antigene selezione negativa e thymic T sviluppo _reg

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vibratomo	Leica Biosystems	VT1000S
NuSieve GTG Agarosio	Lonza	50080	agarosio a bassa temperatura di fusione
(troncato - T12)	Policiences	18986	22 mm x 22 mm quadrato, troncato a 12 mm x 12 mm
Lame per la preparazione del doppio bordo	Personna	74-0002
Adesivo per tessuti	3M	1469SB
0,4 & micro; m Inserti per colture cellulari	BD Falcon	353090	Di diverse marche testate, queste hanno mantenuto le cellule sopra le fette il miglior
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher	21600-010
RPMI-1640 con L-glutammina	Wisent	350-000-CL
Siero fetale bovino	Wisent	080-110	inattivata termicamente
, 200 mM	Wisent	609-065-EL
Penicillina/Streptomicina, 100x	Wisent	450-201-EL
2-Mercaptoetanolo	Alfa Aesar	A15890
15 ml Macinatori di tessuti Tenbroeck	Wheaton	357426
Nylon Mesh Filter	Component Supply	U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample Pestle	Bel-Art	F19922-0000
40 & micro; m Nylon Cell Strainer	BD Falcon	352340
Pinze Inox Punta Dumont		RS-5047	Pinza curva a punta fine, misura .17 x .10 mm
Micro Forceps	Dumont	RS-5090

Stampo per inclusione di L-glutammina