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Articolo metodologico

Preparazione e applicazioni di colture organotipiche timica Slice

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⸱

DOI:

10.3791/54355

⸱

6 agosto 2016

 ,  , 
1Centre de Recherche, Hôpital Maisonneuve-Rosemont, 2Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Descriviamo la preparazione di fette timici che, in combinazione con la citometria di flusso, possono essere utilizzate per modellare selezione positiva e negativa di sviluppare cellule T. Fette timo possono anche essere adattati per l'analisi in situ della migrazione thymocyte, localizzazione, e la segnalazione tramite immunofluorescenza e microscopia a due fotoni.

Abstract

Timici procede selezione in un microambiente timico unico e altamente organizzata conseguente generazione di un auto-tolerant repertorio cellule T funzionali. Modelli in vitro per lo studio T lineage impegno e sviluppo hanno fornito informazioni preziose questo processo. Tuttavia, questi sistemi hanno la completa ambiente timica tridimensionale necessario per lo sviluppo delle cellule T e, quindi, sono approssimazioni incompleti di selezione timica in vivo. Alcune delle sfide legate allo sviluppo delle cellule T modellazione possono essere superate usando in modelli in situ che forniscono un microambiente del timo intatto che supporta pienamente la selezione timica di sviluppare cellule T. Timo culture fetta organotipica completano esistenti nelle tecniche in situ. fette timo preservare l'integrità delle regioni corticali e midollari del timo e forniscono una piattaforma per studiare lo sviluppo dei timociti sovrapposti di una fase di sviluppo definito o di endogena T cells all'interno di un microambiente del timo maturo. Data la capacità di generare ~ 20 fette al mouse, fette del timo presentano un vantaggio unico in termini di scalabilità per gli esperimenti ad alto rendimento. Inoltre, la relativa facilità nel generare le fette del timo e potenzialmente in grado di sovrapporre diversi sottoinsiemi del timo o altre popolazioni di cellule provenienti da diversi background genetici aumenta la versatilità di questo metodo. Qui si descrive un protocollo per la preparazione di fette del timo, l'isolamento e la sovrapposizione dei timociti, e la dissociazione di fette del timo per l'analisi di citometria di flusso. Questo sistema può anche essere adattato per studiare lo sviluppo delle cellule T non convenzionale e visualizzarne migrazione timociti, interazioni cellula-timociti stromali, e segnali TCR associati selezione timica mediante microscopia a due fotoni.

Introduzione

Cellule T differenziano attraverso una serie di intermedi di sviluppo nel timo durante i quali incontrano diversi controlli che assicurano la generazione di un funzionali, self-tolerant repertorio cellule T 1-3. Selezione positiva favorisce la sopravvivenza dei timociti con i recettori delle cellule T (TCR) in grado di riconoscere, con una bassa a moderata affinità, peptide presentati da grandi molecole complesse di istocompatibilità (MHC) sulle cellule epiteliali del timo corticali (CTEC) 2,3. Selezione negativa e lo sviluppo delle cellule T regolatorie (T reg) contribuiscono alla creazione di auto-tolleranza attraverso l'eliminazione o la distrazione dei timociti che rispondono con forza di auto-peptide presentato da MHC 2,4. Immaturo CD4 + CD8 + doppio positivo (DP) timociti che esprimono TCR che passano il processo di selezione si differenziano in sottopopolazioni di cellule T mature, la maggior parte dei quali sono di classe I-restricted MHC citotossici CD8 +o MHC di classe II-ristretta singole cellule CD4 + helper positivi (SP) T, prima di uscire il timo per eseguire funzioni effettrici negli organi linfoidi secondari 1-3.

Aggiungendo alla complessità dello sviluppo delle cellule T è la migrazione dinamica e incontri cellulari di sviluppare timociti tutta la rete cellule stromali 5-9. Queste cellule stromali svolgono ruoli distinti nello sviluppo timocita e sono distribuiti in modo differenziale tra le regioni corticali e midollari timo dove positivo e selezione negativa si verificano 10. Anche se la selezione positiva si svolge principalmente nella corteccia, c'è accumulando prove che timociti DP migrano verso il midollo e continuano a richiedere i segnali TCR prima che si differenziano in cellule T mature che suggeriscono che il midollo può fornire segnali aggiuntivi necessari per il completamento della selezione positiva e lignaggio differenziazione 11,12. Ulteriore,nonostante la presenza di cellule specializzate midollari timiche epiteliali (MTEC) che esprimono e presentare gli antigeni tissutali-ristretto che facilitano l'eliminazione dei timociti autoreattivi 13,14, una grande percentuale di selezione negativa si verifica nella corteccia in risposta a espressa ubiquitariamente auto-peptide presentato da dendritiche cellule 15,16. Così, modelli accurati di sviluppo delle cellule T devono fornire un microambiente timico altamente organizzato, con corticale intatta e regioni midollari, che facilita l'interazione tra i timociti e cellule stromali, e supporta la migrazione thymocyte come queste cellule subiscono selezione positiva e negativa.

Per completare ex vivo analisi dei timociti come mezzo per studiare selezione positiva e negativa, un certo numero di in vitro, in situ, e in modelli in vivo di sviluppo delle cellule T sono stati sviluppati 17-22. E 'stato notoriamente difficile ricapitolareselezione positiva in vitro, ma co-coltura di popolazioni di cellule staminali o precursori delle cellule T con cellule stromali che esprimono Notch ligando, in particolare OP9-DL1 / 4 celle, ha la capacità di supportare T lignaggio impegno e la selezione positiva limitata che lo rende un prezioso modello in vitro per studio sullo sviluppo delle cellule T 23-25. Le limitazioni di questo sistema, tuttavia, includono il fatto che queste cellule hanno la macchine di trasformazione peptide unico trovato nelle cellule stromali del timo e il microambiente timico tridimensionale.

Anche se più tecnicamente ingombrante, in situ e in modelli in vivo di selezione timica può superare alcune delle barriere relative a sistemi in vitro. Reaggregate colture d'organo timo (RTOC) contengono miscele di timociti e cellule stromali del timo 18,26,27 definiti. Questi reaggregates cellule epiteliali del timo mantengono MHC di classe I e II espressione e in grado di supportare SVILUPPOnt di entrambi i sottogruppi di cellule T convenzionali, ma mancano ancora definite strutture corticali e midollari. Fetale cultura organo timica (FTOC) è un modello popolare di sviluppo delle cellule T che possono essere testa di serie con timociti attraverso la cultura impiccagione-drop dei lobi timici lymphodepleted o tramite iniezione di timociti in lymphoreplete lobi del timo e sostenere lo sviluppo efficiente di CD4 + e CD8 + cellule nel tempo nella cultura 18,28-31. Al l'inizio della cultura di lobi del timo fetale vi è una scarsità di mTECs, ma strutture corticali e midollari definiti può svilupparsi nel tempo a seconda delle condizioni. Una considerazione importante è che questo modello può preferenzialmente sostenere fetale contro lo sviluppo delle cellule T degli adulti. Infine, l'iniezione intratimica di precursori timici definiti in topi adulti è tecnicamente impegnativo, ma offre chiaramente un ambiente per sostenere Sviluppo delle cellule T in vivo. Questi in situ e in modelli in vivo sono ottimi strumenti to lo sviluppo delle cellule T di studio e il loro utilizzo devono essere considerati a titolo sperimentale-by-esperimento.

Fette timo, tuttavia, hanno recentemente emersi come un modello complementare versatile per studiare selezione timica in situ con la possibilità di ospitare unica, complessa, e gli esperimenti di throughput generalmente superiori. Fette timo mantengono l'integrità delle regioni corticali e midollari e forniscono un quadro di cellule stromali che supporta la migrazione thymocyte durante lo sviluppo, così come la selezione positiva e negativa efficiente 11,32-39. Sottoinsiemi thymocyte aggiunti in cima a fette timo migrano nel tessuto e alla loro appropriata nicchia microambientali 34,37. I timociti sovrapposti possono essere distinte dalle cellule endogene fetta del timo tramite marcatori congenic o etichette fluorescenti e possono essere mantenute in coltura per diversi giorni. culture timica fetta organotipica possono essere utilizzati per studiare i vari aspettidello sviluppo delle cellule T compresa la selezione del timo, il comportamento timociti (migrazione e interazioni cellulari), e la localizzazione thymocyte, tra gli altri. Data la capacità di generare ~ 20 fette del timo per il mouse, la scalabilità degli esperimenti è generalmente maggiore rispetto ad altri modelli in situ di selezione del timo. Sebbene la preparazione di fette timici richiede attrezzature specializzate, quali vibratome, e il tempo di vita di fette timici in coltura è limitata a causa della perdita di cellule nel tempo con morte cellulare e la mancanza di una membrana incapsulante, fette timici forniscono un eccellente modello per l'analisi di selezione del timo delle popolazioni sincronizzate di timociti all'interno di un microambiente timica maturo. Qui si descrive la preparazione di fette timici (compresa la raccolta il timo, l'incorporamento agarosio di lobi timo e vibratome sezionamento del tessuto incorporato), l'isolamento e la sovrapposizione di timociti, e la dissociazione di fette del timo per l'analisi di citometria di flusso.

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Protocollo

I protocolli per tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato di cura degli animali presso il Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.

1. La raccolta del mouse Thymus per la preparazione di del timo fette e sospensioni singola cella

  1. Euthanize il mouse con CO 2 seguita da dislocazione cervicale.
  2. In una cappa a flusso laminare, pin lato ventrale del mouse fino ad una tavola di dissezione. Spruzzare il mouse con il 70% di etanolo. Rimuovere l'eventuale eccesso di alcol tamponando con una garza per evitare che l'etanolo di entrare nella cavità toracica e danneggiare il tessuto.
  3. Sollevare la pelle alla base dello sterno, con un paio di pinze e fare un taglio attraverso la pelle. Estendere il taglio della pelle verso l'alto per ogni zampa anteriore.
  4. Effettuare un ulteriore taglio alla base dello sterno per separare la membrana dalla gabbia toracica. Poi tagliare ogni lato della gabbia toracica verso la clavicola. Vibrazione della gabbia toracica sopra verso la testa esponendo la cavità toracica. I due lobiIl timo giacciono sopra il cuore.
  5. Rimuovere il tessuto connettivo intorno ai lobi timici con pinze, forbici micro-dissezione, e / o forbici curve affilate. Utilizzare un paio di belle punta ricurva pinze per sollevare i singoli lobi da sotto o via restante tessuto connettivo.
    Nota: Non afferrare direttamente il timo.
  6. Posizionare i lobi del timo in un tubo da 15 ml contenente PBS e mettere da parte in ghiaccio fino al momento dell'uso.

2. Agarosio Embedding e Vibratome Affettatura di lobi del timo

  1. Preparare 4% soluzione di agarosio per l'incorporamento sciogliendo 2 g basso punto di fusione agarosio in 50 ml di PBS sterile e microonde su un livello basso fino alla agarosio completa dissoluzione. Coprire matraccio con foglio di alluminio e posto in un bagno di acqua a 55 ° C fino al momento dell'uso.
  2. In una cappa di coltura di tessuti, preparare supporti completi RPMI-1640 che contiene il 10% di siero fetale bovino (FBS), 4 mM L glutammina, 1x penicillina / streptomicina e 10 micron2-mercaptoetanolo.
  3. Aggiungere 1,5 ml completo dei media RPMI-1640 per pozzetto di una piastra di coltura cellulare 6-bene e posizionare un inserto di coltura cellulare in ciascun pozzetto. Impostare la piastra da parte in un incubatore a 37 ° C fino al momento dell'uso.
  4. Preparare un bagno di acqua ghiacciata fangosa con acqua e ghiaccio in un secchio di ghiaccio.
  5. Rimuovere con attenzione tutti i restanti tessuto connettivo circostante ogni lobo del timo con pinze punta fine. Fare questo mentre il lobo timica è immerso in PBS in un piatto di coltura di tessuti, dopo il trasferimento su un fazzoletto di carta imbevuto wipe con PBS, o sotto un microscopio da dissezione.
  6. Lasciare che il agarosio raffreddare sotto i 40 ° C, quando il pallone è solo caldo al tatto, per evitare il surriscaldamento dei tessuti. Versare il raffreddato 4% agarosio in uno stampo tessuto ad un'altezza di ~ 1 cm.
  7. Utilizzare un paio di pinze per trasferire accuratamente il lobo timica ad un tessuto pulire e rotolare delicatamente per asciugare senza danneggiare il tessuto. Assicurarsi che il tessuto si asciuga completamente o sarà scivolare fuori dal agarosio durante affettatura.
  8. Inserire delicatamente il lobo in agarosio e posizionarlo orizzontalmente (per aumentare la superficie di ogni fetta) o verticalmente (per aumentare il numero di fette) nella parte inferiore dello stampo. Mettere lo stampo in acqua ghiacciata per 5-10 minuti per consentire l'agarosio solidificare.
  9. Durante questo tempo, preparare il vibratome affettare montando la vasca del buffer, il montaggio del disco di preparato, ed inserendo la lama vibratome. Posizionare un pezzo di nastro laboratorio su disco di preparato. Sterilizzare il pulito, spazio di lavoro assemblato con il 70% di etanolo.
  10. Una volta che i solidifica agarosio, capovolgere lo stampo e premere delicatamente al centro per liberare l'agarosio incorporato lobo.
  11. Utilizzare una lama tagliente per tagliare l'eccesso di agarosio che circonda il lobo lasciando ~ 2 mm agarosio su ogni lato e ~ 0,5 cm nella parte inferiore.
  12. Fissare ogni blocco di agarosio con una goccia di colla tessuto al pezzo di nastro sul disco dei campioni. blocchi multipli possono essere incollati sul nastro.
  13. Allineare la lama wi vibratometh la parte superiore del blocco di agarosio. Riempire la vaschetta del buffer con PBS sterile fino a quando il blocco (s) lama e agarosio sono completamente immersi.
  14. Sezione tessuto agarosio incorporato per ottenere fette di spessore di 400-500 micron. Impostare la vibratome di 0,225 millimetri / sec di velocità, 100 Hz, e 5 °.
  15. Utilizzare una spatola piegata per raccogliere le fette di timo in una piastra di coltura tissutale contenente PBS sterile in quanto sono tagliati. Scartare la prima e l'ultima fetta.
  16. Esaminare le fette sotto un microscopio ottico a 4X ingrandimento. Scegliere le fette con il tessuto del timo intatto e dintorni agarosio (Figura 1A).
  17. Trasferire le fettine al piatto preparato al punto 2.3 utilizzando un puntale di scivolare delicatamente la fetta timica dalla spatola piegata sul inserto coltura cellulare. Ogni inserto può ospitare ~ 3 fette. Assicurarsi che le fette non si tocchino tra loro o le pareti inserto di coltura cellulare.
  18. Mantenere la piastra a 37 ° C fino al momento dell'uso.
3. Preparazione di Timociti per sovrapporre

  1. Isolare lobi timici come descritto nella sezione 1. Dissociare manualmente i lobi per fare una sospensione di cellule singole usando una sterilizzato smerigliatrice 15 ml tessuto riempito con 5 ml di PBS sterile contenente 2% FBS. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 ml.
  2. Centrifugare le cellule a 545 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 1 ml di tampone di lisi ACK 1x (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0.1 mM Na 2 EDTA) a temperatura ambiente per 3 minuti per lisare i globuli rossi.
  3. Riempire il tubo 15 ml con PBS contenente 2% FBS. Centrifugare le cellule a 545 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  4. Risospendere le cellule in 10 ml di PBS contenente 2% FBS e superare cellule attraverso un filtro a rete 255 micron.
  5. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Centrifugare le cellule a 545 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere il pellet cellulare in PBS contenente 2% FBS in un Conczione di 1 x 10 7 cellule per ml.
  6. Etichettare le cellule con coloranti cellulari come carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) secondo i protocolli del produttore se non si utilizza timociti da topi che esprimono i marcatori congenic o giornalisti fluorescenti geneticamente codificate da distinguere da cellule endogene fetta.
  7. Dopo l'ultimo lavaggio delle cellule marcate, risospendere il pellet cellulare in mezzi RPMI-1640 completi a 1-3 x 10 6 cellule per 15 microlitri.

4. Sovrapposizione Timociti sul timica Fette

  1. Utilizzare una pipetta per aspirare il liquido che circonda le fette timo sull'inserto.
    Nota: Fare attenzione a non danneggiare l'agarosio. Se l'agarosio è danneggiata, i timociti sovrapposti non attaccarsi alla superficie fetta causa della perdita di tensione superficiale.
  2. Senza toccare la fetta con la punta della pipetta, sovrapposizione di 15 ml di timociti preparati nella sezione 3 su ogni fetta del timo.
  3. Incubare le PLAte a 37 ° C per 2 ore per permettere alle cellule di migrare nelle fette timici.
  4. Dopo 2 ore, risciacquare le fette timici 3 volte con 1 ml di PBS per rimuovere i timociti sovrapposti eccesso che non hanno ancora migrato nel tessuto.
  5. Incubare la piastra a 37 ° C fino a quando le fette timici sono pronti per essere raccolti, tipicamente 1-72 ore a seconda dell'esperimento.

5. La dissociazione di fette del timo per Citometria a Flusso

  1. Preparare una provetta per ogni fetta con l'aggiunta di 150 ml di PBS contenente 2% FBS.
  2. Aggiungere 1 ml di PBS contenente 2% FBS all'inserto coltura tissutale con le fette timici e mescolare delicatamente con una spatola piegata per staccare le fette dalla superficie dell'inserto coltura cellulare.
  3. Trasferire la fetta da l'inserto alla provetta con una spatola piegata.
  4. interrompere manualmente la fetta con un pestello microcentrifuga campione del tubo. Aggiungere 150 pl di PBS contenente 2% FBS ad un volume finale di 300ul.
  5. Filtrare il tessuto dissociato attraverso un filtro 40 micron in una nuova provetta. Le cellule filtrati sono pronte per essere macchiato per l'analisi di citometria di flusso 40.
  6. Filtrare celle una seconda volta prima di passarli su un citofluorimetro per assicurare che tutto l'agarosio viene rimosso e non ostruire il citometro a flusso.
  7. Acquisire le cellule su un citometro a flusso e analizzare i dati come è stato descritto in precedenza 40.

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Risultati

Timica analisi supporto fette di diversi aspetti dello sviluppo delle cellule T come la selezione positiva e negativa. Per gli esperimenti di successo, la qualità della fetta timica è fondamentale. Così, fette timici dovrebbero essere esaminati per garantire l'integrità del tessuto timico e che l'agarosio che circonda la fetta timica è intatto (Figura 1A). La tensione superficiale può essere compromessa quando l'agarosio è danneggiato causa...

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Discussione

Qui si descrive un protocollo per la preparazione di fette del timo e risultati rappresentativi di selezione positiva e negativa efficiente di sovrapposizione di preselezione MHC di classe I-limitato TCR timociti transgeniche di citometria a flusso. Questo sistema è stato utilizzato con successo simile per supportare selezione positiva di cellule MHC di classe II-ristrette T CD4 + di preselezione timociti DP 32, e, in presenza di agonisti antigene selezione negativa e thymic T sviluppo reg

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Marilaine Fournier per i suoi commenti sul manoscritto e Josée Tessier per l'assistenza tecnica. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1 #4175 sono stati ottenuti attraverso il programma di scambio NIAID, NIH. Il sostegno a questa ricerca è fornito da una sovvenzione della SickKids Foundation e del CIHR-IHDCYN (NI15-002), da una sovvenzione operativa del CIHR-III (MOP-142254) e da fondi di avviamento del FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) e della Hôpital Maisonneuve-Rosemont Foundation a HJM. HJM è uno studioso junior 1 del FRQS, un nuovo ricercatore CIHR (MSH-141967) e un destinatario del premio Cole Foundation Early Career Transition.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
VibratomoLeica BiosystemsVT1000S 
NuSieve GTG AgarosioLonza50080agarosio a bassa temperatura di fusione
(troncato - T12)Policiences1898622 mm x 22 mm quadrato, troncato a 12 mm x 12 mm
Lame per la preparazione del doppio bordoPersonna74-0002
Adesivo per tessuti3M 1469SB
0,4 & micro; m Inserti per colture cellulari BD Falcon353090Di diverse marche testate, queste hanno mantenuto le cellule sopra le fette il miglior
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineThermoFisher21600-010
RPMI-1640 con L-glutamminaWisent350-000-CL
Siero fetale bovinoWisent080-110inattivata termicamente
, 200 mMWisent609-065-EL
Penicillina/Streptomicina, 100xWisent450-201-EL
2-MercaptoetanoloAlfa AesarA15890
15 ml Macinatori di tessuti TenbroeckWheaton357426
Nylon Mesh FilterComponent SupplyU-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample PestleBel-ArtF19922-0000
40 & micro; m Nylon Cell StrainerBD Falcon352340
Pinze Inox Punta DumontRS-5047Pinza curva a punta fine, misura .17 x .10 mm
Micro ForcepsDumont RS-5090 
Stampo per inclusione di L-glutammina

Riferimenti

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