Sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto

Sommario

Negli organismi pluricellulari, i fattori solubili secreti suscitano risposte da diversi tipi di cellule come risultato della segnalazione paracrina. I sistemi di co-coltura in insert offrono un modo semplice per valutare i cambiamenti mediati da fattori solubili secreti in assenza di contatto cellula-cellula.

Abstract

Il ruolo dei fattori solubili secreti nella modifica delle risposte cellulari è un tema ricorrente nello studio di tutti i tessuti e sistemi. Nel tentativo di rendere semplici le relazioni molto complesse tra i diversi sottotipi cellulari che compongono gli organismi pluricellulari, sono state sviluppate tecniche in vitro per aiutare i ricercatori ad acquisire una comprensione dettagliata delle popolazioni di singole cellule. Una di queste tecniche utilizza inserti con una membrana permeabile che consente la diffusione dei fattori solubili secreti. Pertanto, una popolazione di cellule coltivate in inserti può essere co-coltivata in un pozzetto o in un piatto contenente un diverso tipo di cellula per valutare i cambiamenti cellulari a seguito di segnalazione paracrina in assenza di contatto cellula-cellula. Tali sistemi di co-coltura con inserti offrono vari vantaggi rispetto ad altre tecniche di co-coltura, in particolare la segnalazione bidirezionale, la polarità cellulare conservata e il rilevamento specifico della popolazione dei cambiamenti cellulari. Oltre ad essere utilizzati nel campo dell'infiammazione, del cancro, dell'angiogenesi e del differenziamento, questi sistemi di co-coltura sono di primaria importanza nello studio delle intricate relazioni che esistono tra i diversi sottotipi cellulari presenti nel sistema nervoso centrale, in particolare nel contesto della neuroinfiammazione. Questo articolo offre linee guida metodologiche generali per impostare un esperimento al fine di valutare le modificazioni cellulari mediate da fattori solubili secreti utilizzando un sistema di co-coltura in inserto. Inoltre, verrà dettagliato un protocollo specifico per misurare gli effetti neuroinfiammatori delle citochine secrete dalla microglia N9 attivata da lipopolisaccaridi sulle cellule neuronali PC12, offrendo una comprensione concreta della metodologia di co-coltura degli inserti.

Introduzione

Lo studio dei tessuti, organi o sistemi in vitro è un tentativo di semplificare le molto complesse relazioni esistenti fra i vari sottotipi cellulari che compongono organismi multicellulari. Infatti, gli studi in vitro permettono di acquisire una comprensione dettagliata delle popolazioni di cellule singole. Ci sono due principali vantaggi di condurre esperimenti in vitro: 1) riduzione interazioni cellulari, e 2) la capacità di manipolare facilmente l'ambiente cellulare. Scienziati Quindi, questi due vantaggi hanno consentito di prevedere il comportamento di specifici tipi cellulari in vivo, che porta alla capacità di regolare ....

Protocollo

NB: Ciascuna delle seguenti operazioni deve essere eseguita in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare come richiesto per colture cellulari di mammifero. Inoltre, le linee guida generali per la coltivazione ottimale delle cellule sterili si applicano, ad esempio., Scartando consigli ogni volta che possono portare a contaminazione incrociata, riducendo la quantità di cellule di tempo sono esposti all'aria durante l'esecuzione di interi cambiamenti dei media, correttamente, ma con delicatezza mescolando sospensioni cellulari per garantire la loro dispensazione omogeneo, ecc Inoltre, gli inserti sono una sorta di plasticware che richiedono un ....

Risultati

L'utilizzo di sistemi di inserti co-coltura è particolarmente pertinente nello studio dei processi neuroinfiammatori che mettono in risalto le relazioni tra i diversi attori paracrini cellulari del sistema nervoso centrale. Immunità nel sistema nervoso centrale avviene principalmente dalle cellule residenti chiamate microglia che monitorano l'ambiente nel loro riposo stato ramificata (Figura 2A) e sono in grado di disturbi di rilevamento che potrebbero turbare la prezios.......

Discussione

La fase più critica di esperimenti sistema inserto co-coltura effettivamente abita nello scegliere l'inserto corretto di utilizzare. Dimensione dei pori e materiale della membrana devono essere presi in considerazione approfondita, senza dimenticare di considerare il tipo di cellule che saranno seminate e lo scopo dell'esperimento. Per esempio, saggi chemiotassica possono utilizzare lo stesso tipo di membrana di co-colture cellulari per analizzare modulazioni comportamento cellulare indotta da fattori solubili s.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
RPMI-1640 medio	Sigma	R8755	Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Dulbecco' s Aquila modificata' s Miscela Medio/Nutriente F-12 Prosciutto	Sigma	D6421	Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso, deve essere integrato con 0,365 gm/L di L-glutammina
Siero di cavallo	ATCC	30-2040	Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso
Siero fetale bovino	MultiCell	80350	Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Nerve Growth Factor-7S dalla ghiandola sottomascellare murina	Sigma	N0513	Ricostituire la polvere liofilizzata in una soluzione di soluzione salina tamponata o di terreno di coltura tissutale contenente 0,1– 1,0% di albumina sierica bovina o 1-10% di siero
Tripsina-EDTA soluzione	Sigma	T3924	Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Lipopolisaccaridi da  Escherichia coli 055:B5	Sigma	L2880	tossiche
per l'uso con piastre a 24 pozzetti	BD Falcon	353095	0,4 μ m pori
piastre a 24 pozzetti	TrueLine	TR5002	Rivestire con collagene prima dell'uso
		coltura cellulare PC12	di routine Terreno di coltura cellulare N9 di routine
-            85% RPMI medio			-            90% DMEM-F12 medio
-            10% siero			-            10% siero di cavallo inattivato a caldo
-            Siero
		PC12 terreno di differenziazione	N9 mezzo di trattamento
-              99% RPMI medio			-            99% DMEM-F12 medio
-              1% siero			termicamente-            1% siero fetale bovino inattivato termicamente
-              50 ng/mL di fattore
PC12 terreno
-              99% RPMI medio
-              Siero