Per le applicazioni a valle sono necessarie tecniche affidabili ed efficienti per l'isolamento delle cellule immunitarie renali. Ciò richiede la marcatura degli anticorpi di superficie di un piccolo numero di cellule immunitarie renali. Qui, descriviamo un metodo conciso per l'isolamento delle cellule immunitarie renali che sembra raggiungere questo obiettivo.
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Articolo metodologico
Affidabile e di alta efficienza di estrazione del rene cellule immunitarie
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'attivazione del sistema immunitario avviene in molteplici malattie renali e processi fisiopatologici. Il sistema immunitario è costituito da componenti adattativi e innati e da più tipi di cellule. A volte, il tipo di cellula di interesse è presente in numero molto basso tra il gran numero di cellule totali isolate dal rene. Pertanto, l'isolamento affidabile ed efficiente delle popolazioni di cellule mononucleate renali è importante per studiare i problemi immunologici associati alle malattie renali. Tradizionalmente, l'isolamento tissutale delle cellule mononucleate renali è stato eseguito tramite digestioni enzimatiche utilizzando diverse varietà e forze di collagenasi/DNAsi, producendo un numero variabile di cellule immunitarie vitali. Recentemente, con lo sviluppo degli interferenti tissutali meccanici per l'isolamento di singole cellule, la fase di digestione della collagenasi è stata evitata e sostituita da una semplice interruzione meccanica dei reni dopo l'estrazione dal topo. In questo articolo, dimostriamo un metodo semplice ma efficace per l'isolamento di cellule mononucleate renali per l'estrazione quotidiana di cellule immunitarie. Dimostriamo inoltre un esempio di analisi di sottogruppi di cellule immunitarie nel rene. È importante sottolineare che questa tecnica può essere adattata ad altri tessuti molli e non fibrosi come il fegato e il cervello.
Introduzione
Attivazione del sistema immunitario si verifica in molteplici malattie renali e processi fisiopatologici 6,10,11,13. Potenziali aree di ricerca attiva comprendono vari inneschi per l'attivazione del sistema immunitario, vari tipi cellulari coinvolti, il pattern di citochine / chemochine in una particolare impostazione di malattia, la modulazione di tutti i processi sopra menzionati un particolare farmaco ecc Per esemplificare, in ischemia-riperfusione lesioni (un modello di danno renale acuto), vi è un aumento delle cellule immuni o di midollo osseo derivate cellule ematopoietiche o cellule CD45 + in poche ore, che è sostenuto attraverso il ....
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Protocollo
Tutte le fasi del protocollo eseguiti sono stati esaminati e approvati dalla University of Missouri cura degli animali e del Comitato uso (ACUC). Per questo protocollo, maschi C57BL / 6 topi di età compresa tra 15 settimane sono stati utilizzati anche se teoricamente qualsiasi roditore a qualsiasi età può essere utilizzato per gli esperimenti. Poiché questo è un intervento chirurgico non-sopravvivenza, l'eutanasia si ottiene dissanguamento e pneumotorace bilaterale.
1. perfusione dei reni
Nota: perfusione di organi come cuore, fegato e reni di rimuovere il sangue, che possono interferire con l'interpreta....
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Risultati
Il numero di pannelli che possono essere eseguiti dipende dal numero di cellule immunitarie che possono essere estratti in modo affidabile dai reni. Qui, dimostriamo la capacità di eseguire 2 pannelli, uno per i linfociti T e uno per i macrofagi / cellule dendritiche. Sul pannello dei linfociti T, dobbiamo prima guardare al forward scatter (FSC) e side scatter modello (SSC) e delineare la popolazione di interesse come mostrato in Figura 1 (dot plot in alto a sinistra). Q.......
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Discussione
Abbiamo presentato qui un metodo per ottenere cellule immunitarie dal rene in modo affidabile ed efficiente. La modifica principale al passaggio digestione collagenasi ampiamente utilizzato (rottura meccanica del tessuto) risparmiare circa 30 min e l'isolamento di un gran numero di cellule immunitarie vitali richiede meno di due ore per 4 campioni renali. Inoltre, a seconda della nostra domanda di ricerca, ora usiamo un solo rene (l'altro rene può essere utilizzato per l'analisi delle proteine da Western b.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato da una sovvenzione di ricerca da Dialysis Clinics Inc. e dalla sovvenzione del consiglio di ricerca dell'Università del Missouri.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Stomacher 80 Biomaster sistema di laboratorio | Seward | ||
| Stomacher 80 sacche classiche | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuga | Thermo Scientific | O attrezzatura equivalente | |
| Emocitometro Microscopia | elettronica Scienze | 63514-11 | |
| Citometro a flusso analitico | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato 1x (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Provette in polipropilene, senza tappo | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-LY6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11C (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μ m filtro | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubi 50 ml | Fisher | O attrezzatura equivalente | |
| Fisherbrand Tubi 15 ml | Fisher | O attrezzatura equivalente | |
| Saccarosio | Fisher chimico | S5-3 | |
| Pipetta di trasferimento punta fine | Samco Scientific | 232 | O attrezzatura equivalente |
| Soluzione tampone per colorazione per citometria a flusso | EBioscience | 00-4222-26 | O apparecchiatura equivalente |
| 1x tampone di lisi RBC | EBioscience | 00-4333-57 | o attrezzatura equivalente |
Riferimenti
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al.
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Ristampe e permessi
